Summary
ويحدد هذا البروتوكول وسيلة لمراقبة امبريوجينيسيس في نبات عن طريق إزالة ovule متبوعاً بالتفتيش على تشكيل نمط الجنين تحت مجهر.
Abstract
نظراً لطبيعة شديدة يمكن التنبؤ بها لتنميتها، استخدمت أجنة نبات كنموذج للدراسات morphogenesis في النباتات. ولكن الأجنة النباتية المرحلة المبكرة الصغيرة وتحتوي على بعض الخلايا، مما يجعل من الصعب مراقبة وتحليل. يتم وصف أسلوب هنا لوصف تشكيل نمط في الأجنة النباتية تحت مجهر باستخدام نموذج الكائن الحي نبات. بعد إزالة البويضات الطازجة الحل هوير باستخدام، يمكن ملاحظة مورفولوجيا الأجنة وعدد الخلايا في، ومرحلة إنمائية يمكن أن تحددها التدخل التفاضلية تباين مجهرية باستخدام 100 × النفط غمر عدسة. وبالإضافة إلى ذلك، تم رصد التعبير عن البروتينات علامة محددة معلم مع أخضر نيون البروتين (التجارة والنقل) لإضافة تعليق توضيحي مواصفات هوية الخلية أثناء الزخرفة الجنين بالليزر [كنفوكل] الفحص المجهري. وهكذا، يمكن استخدام هذا الأسلوب لمراقبة تشكيل نمط في الأجنة النباتية البرية من نوع المستويات الخلوية والجزيئية، وتلخص الدور جينات محددة في الزخرفة الجنين بمقارنة تشكيل نمط في الأجنة من النباتات البرية من نوع وطفرات الجنين الفتاكة. ولذلك، يمكن استخدام الأسلوب تميز embryogenesis في نبات.
Introduction
امبريوجينيسيس هو الحدث أقرب في أعلى النبات التنمية. أشكال جنين ناضجة من الزيجوت عن طريق انقسام الخلايا وتمايزها تحت رقابة صارمة على الوراثية1،2. أجنة نبات نموذجا مفيداً لدراسة مراقبة morphogenesis لأنه يتبع تسلسل انقسامات الخلية أثناء امبريوجينيسيس نمط المتوقع3،4. ومع ذلك، جنين نبات يحتوي على واحد إلى عدة خلايا صغير جداً مراعاتها وتحليلها. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يسبب الطفرة لبعض الجينات الجنين الفتك5، مما يشير إلى الدور الرئيسي لتلك الجينات في امبريوجينيسيس. وصف تشكيل نمط في طفرات الجنين الفتاكة يوفر أساسا لفهم الآلية الجزيئية بموجبه تنظيم الجينات الأساسية تنمية الجنين.
يتم وصف طريقة مفصلة هنا لوصف تشكيل نمط الجنين في المصنع النموذجي نبات بالملاحظة المجهرية المباشرة. الأسلوب الذي ينطوي على إزالة ovule تليها المراقبة المجهرية للجنين. ويرد أيضا وصف المسخ الجنين الفتاكة.
يمكن تحديد مورفولوجية الأجنة في مراحل إنمائية مختلفة مباشرة عن طريق الفحص المجهري باستخدام البويضات التي أزيلت مع هوير لحل6،7. هذه البويضات يحمل إنكسار عالية؛ وهكذا، ovule هذا مسح الأسلوب مفيد خاصة للعينات التي يجب مراعاتها قبل التدخل التفاضلية التباين (DIC) الفحص المجهري.
وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام الجينات التي يتم التعبير عنها في خلية معينة أو عدد محدود من الخلايا أثناء embryogenesis كعلامات لتحديد الخلايا في جنين. ولذلك، يمكن المشروح مواصفات هوية الخلية أثناء امبريوجينيسيس عن طريق رصد التعبير عن البروتينات بروتينات فلورية خضراء معلم علامة باستخدام الليزر [كنفوكل] الفحص المجهري. على العكس من ذلك، مراقبة نمط التعبيرالتجارة والنقل الانصهار الجينات الوظيفية غير معروف-أثناء embryogenesis يمكن توفير ارتباط بين الجنين الزخرفة والتعبير عن ذلك الجين، وتيسير تحديد الجينات الجديدة التي مطلوبة من أجل امبريوجينيسيس في نبات.
يمكن أيضا استخدام الأسلوب الموصوفة هنا تميز النمط الظاهري المسخ الجنين الفتاكة، وتحديد أثر الجينات المتضررة على امبريوجينيسيس على المستوى الخلوي. وعلاوة على ذلك، في تركيبة مع مقارنة بين نمط التعبير للجينات ماركر خلال امبريوجينيسيس بين النباتات البرية من نوع ومتحولة، الطريقة يمكن أن تسفر عن أدلة حول الآليات الجزيئية ومسارات الإشارات المشتركة في امبريوجينيسيس8،9. في الواقع، تم تطبيق الأسلوب للنباتات naa10 ، ووجد أن الشعبة غير طبيعي من النخامية في المسخ قد تنجم عن تغيير في توزيع اكسين خلال embryogenesis5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: هذا البروتوكول له ثلاثة أجزاء: 1) مراقبة تشكيل نمط في أجنة نبات البرية من نوع استخدام الفحص المجهري DIC؛ 2) تميز الجنين نمط تشكيل عن طريق مراقبة التعبير البروتين علامة باستخدام الليزر [كنفوكل] الفحص المجهري؛ و 3) تحديد دور جين معين في امبريوجينيسيس (باستخدام المسخ naa10 على سبيل مثال).
1-أبل المقاصة
- إعداد المواد النباتية
ملاحظة: بروتوكول الموصوفة هنا مثال على كيفية زراعة النباتات صحية؛ طرق أخرى لزراعة النباتات صحية تعمل أيضا.- إضافة بذور 100 إلى أنبوب 1.5 مل ومن ثم أضف 1 مل من محلول هيبوكلوريت الصوديوم 1.5% (ميكس 15 مل كلور 10% مع 85 مل من الماء) لتعقيم بذور دقيقة 5 عكس الأنبوبة عدة مرات لضمان جيدا مختلطة لتعقيم بذور السطحية تماما بالبذور والحل.
- قوة البذور إلى الجزء السفلي من الأنبوب بالطرد المركزي لمدة 30 ثانية في س 1,200 ز، إزالة المادة طافية، وتغسل البذور بالماء المعقم أربع مرات على مقاعد البدلاء لإزالة تحت كلوريت الصوديوم المتبقية.
- إضافة 4.4 غ من خليط الملح القاعدي Murashige وسكوغ (مللي ثانية) و 10 غم من السكروز إلى 1 لتر الماء عالي النقاوة. يقلب الخليط لإذابة الأملاح والسكروز. ضبط الحل للأس الهيدروجيني 5.8 مع 1 م كوه، إضافة الجيل الثالث 3g عامل مجمد، مثل فيتاجيل، إلى حل مرض التصلب العصبي المتعدد-السكروز، وتعقيم الحل في 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة لجعل متوسط MS.
- صب 30 مل الوسط مرض التصلب العصبي المتعدد في صحن 12-سم ثقافة لإنشاء لوحات متوسطة مرض التصلب العصبي المتعدد.
- وضع بذور معقمة على لوحة مرض التصلب العصبي المتعدد. نقل اللوحة إلى دائرة نمو وإبقاء اللوحة تحت ظروف طويلة أيام (22 درجة مئوية ح 16 في الضوء و 18 درجة مئوية ح 8 في الظلام) بعد بذور التقسيم الطبقي (3 أيام في 4 درجات مئوية في الظلام).
- بعد 8 أيام نمو، نقل النباتات للتربة (التربة الغنية بالمغذيات ميكس والفيرميكوليت بنسبة 1:1) في علبة وتغطي العلبة مع غطاء أبيض وشفاف لمدة 5 أيام لتجنب فقدان الماء، ويترك ثغرة لتجنب عمليات التزجيج النباتات.
- تتخذ الغطاء قبالة الدرج وزراعة النباتات في حجرة حجرة تحت ظروف أيام طويلة (انظر 1.1.5). تبديل الضوء الساعة 06:00 ص وإيقاف الساعة 10:00 م. بعد حوالي 20 يوما نمو في قاعة حجرة، سوف يكون مزهر النباتات وإنتاج سيليكويس.
- مارك يطارد براعم الزهور مع مؤشر ترابط في الموضع للبذور في نورات الساعة 08:00 م (لا تستخدم الأولى لبراعم الزهور الثالث؛ سيليكويس المتولدة من هذه البراعم الزهرة عادة وضع بذور إحباط عدد قليل، وهذا قد يغير نسبة طبيعية للبويضات غير طبيعي). تحديد بداية التلقيح ovule كما عند فتح برعم ملحوظ زهرة الساعة 08:00 ص في صباح اليوم التالي.
- إعداد الحل هوير
- إضافة 24 ز من كلورال هيدرات لأنبوب 50 مل ولف الأنبوب تماما مع رقائق الألومنيوم (حلول كلورال هيدرات ليست مستقرة تحت الضوء).
- المقبل، بإضافة 9 مل من الماء عالي النقاوة و 3 مل من الجلسرين إلى الحل أعلاه ويهز أنبوب لإذابة هيدرات كلورال. لجعل الحل هوير، اسمحوا الأنبوب الوقوف بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة لإزالة أي فقاعات.
- فصل ovule وإزالة الألغام
- إرفاق قطعة من شريط لاصق الوجهين بشريحة زجاجية مجهر. ضع خردلة نمت للعدد المطلوب من أيام بعد التلقيح (حزب العمل الديمقراطي) على الشريحة مع بسيودوسيبتوم عمودي على السطح؛ هذا سيجعل من السهل تقسيم carpels (الأرقام 1A و 1B).
- تقسيم كاربيلس على كلا الجانبين من بسيودوسيبتوم بإبرة محقن وإرفاق carpels تشريح اثنين إلى الشريحة حيث تكون البويضات في خردلة مرئية تحت ستيريوسكوبي (الأرقام 1 ود 1).
- الاستغناء عن 70 ميليلتر من محلول هوير لعلى الشريحة الزجاجية، ومن ثم ترطيب غيض من زوج من ملاقط مقلوب غرامة مع الحل هوير بالغمس. تستخدم في ستيريوسكوبي، نقل البويضات إلى الحل هوير على الشريحة مع ملاقط لتنظيف الأجنة. تطبيق ساترة على الشريحة برفق لتجنب توليد أي فقاعات.
- وضع الشريحة الانتهاء في مربع في غرفة مظلمة ح 2-12 (أكثر نضجاً ovule، ستكون هناك حاجة إلى مزيد من الوقت) في درجة حرارة الغرفة. ويمكن ملاحظة الأجنة في المرحلة 2/4-الخلية (1-2 مديرية إدارة السجون) مجهريا بعد ح 2، في حين يمكن ملاحظة الأجنة بين أوكتانت والمراحل المبكرة كروي (3 سماد) بعد ح 4. ويمكن ملاحظة أكثر نضجاً الأجنة (4-8 سماد) بعد 12 ساعة.
- فحص البويضات تم مسحها باستخدام الدالة DIC مجهر. حدد الأجنة ضمن حقل طاقة منخفضة (10 X) ثم قم بتغيير إلى حقل عالية الطاقة (النفط غمر عدسة 100 X) لمراقبة نمط الخلوية في الأجنة المتقدمة النمو.
- فحص الأجنة في مراحل إنمائية مختلفة.
2-توصيف الجنين الزخرفة وهوية الخلية عن طريق مراقبة تعبير البروتين علامة
- تحضير المواد النباتية
- استنساخ المروج والترميز تسلسل علامة عنصر استجابة الجينات أو الهرمونات والصمامات ثم أنه مع بروتين فلوري (مثل التجارة والنقل)؛ بعد ذلك، إدراج في البناء ناقلات ثنائية (مثل pCambia1300). هنا، عنصر الاستجابة اكسين DR5 يقدم ك مثال10.
- إدخال بلازميد DR5-التجارة والنقل الناتجة عن النباتات البرية من نوع من توميفاسينس المتبعة-بوساطة تحويل11. تحديد النباتات T1 باستخدام MS لوحات متوسطة الحجم التي تحتوي على هيجروميسين (50 ملغم/مل الخمور الأم، المخفف 1:1، 000). النباتات المعدلة وراثيا سوف يحمل جذور طويلة وتولد اثنين روزيت يترك بعد 8 أيام نمو في ظل الشروط الموضحة في 1.1.5.
- نقل النباتات المعدلة وراثيا إلى التربة وزراعتها كما هو مبين في 1.1.6 و 1.1.7.
- جمع بذور T2 من خطوط T1 مستقلة. بذر البذور في لوحات MS-هيجروميسين وتحديد النباتات تحمل نسخة واحدة من الإدراج DR5-التجارة والنقل (نسبة نباتات مقاومة للنباتات الحساسة سيكون تقريبا 3:1)، ونقلها إلى التربة.
- زراعة النباتات T2 كما هو مبين في 1.1.6 و 1.1.7.
- جمع بذور T3 من النباتات T2. بذر البذور في لوحات MS-هيجروميسين وتحديد النباتات المعدلة وراثيا متماثل (جميع النباتات من سطر واحد سوف يحمل المقاومة هيجروميسين)، ونقلها إلى التربة.
- وضع علامة على براعم الزهور من النباتات T3 متماثل كما هو مبين في 1.1.8.
- بروتينات فلورية خضراء إشارة المراقبة
- خلط 3 مل الجلسرين مع 47 مل من الماء عالي النقاوة لإنشاء حل والغليسيرول 6%.
- إرفاق قطعة من شريط لاصق الوجهين إلى شريحة الميكروسكوب زجاجية وإصلاح خردلة النحو المبين في 1.3.1.
- تقسيم كاربيلس على كلا الجانبين من بسيودوسيبتوم بإبرة محقن وإرفاق carpels تشريح اثنين للشريحة تحت ستيريوسكوبي كما هو مبين في 1.3.2.
- الاستغناء عن 30 ميليلتر من الجلسرين 6% على شريحة زجاجية ووضع كل من البويضات من carpels تشريح في الحل باستخدام الملقط مقلوب غرامة. ضع ساترة على الشريحة بلطف.
- كما يمكن منع البذور معطف والسويداء في كل ovule مراقبة إشارات التجارة والنقل في الجنين، استخراج الجنين من أبل. انقر فوق الشريحة بسرعة و بلطف قذف الجنين من ovule (أكثر نضجاً ovule، ينبغي أن تطبق قوة أقل على الشريحة).
- تفحص الشريحة للأسفار التجارة والنقل باستخدام الليزر [كنفوكل] الفحص المجهري. البحث عن الأجنة المعزولة تحت حقل طاقة منخفضة (10 X) وتسجيل مواقعها، ثم قم بتغيير إلى حقل عالية الطاقة (النفط غمر عدسة 100 X) لمراقبة التعبير DR5-التجارة والنقل في الأجنة بإعداد مصدر الضوء الإثارة إلى 488 نانومتر للكشف عن إشارة التجارة والنقل.
- الكشف عن تعبير بروتينات فلورية خضراء في الأجنة لتحديد خط T3 مناسبة لمزيد من التحليل.
3. وصف تشكيل نمط الجنين في المسخ الجنين الفتاكة عن طريق إزالة Ovule وعلامة البروتين المراقبة: Naa10 كمثال
- الزخرفة الجنين في نباتات متحولة naa10
- إعداد المواد النباتية وكما هو مبين في 1.1.1-1.1.7.
- تحديد naa10+ − النباتات ببكر استخدام الجينات محددة كبسولة تفجير5، ومارك ثم براعم الزهور ل ناه10+ − النباتات كما هو مبين في 1.1.8.
- تؤدي إزالة ovule والفحص المجهري ل ناه10+ − الأجنة كما هو مبين في 1.2 و 1.3.
- تحليل البروتين علامة باستخدام أجنة naa10
- الحصول على خطوط المعدلة وراثيا DR5-بروتينات فلورية خضراء مناسبة باستخدام الإجراء المبين في 2.1-2.2.
- عبور خط DR5-التجارة والنقل المعدلة وراثيا متماثل مع ناه10+ − المصنع للحصول على ناه10+ − النباتات متماثل لعلامة fluorescence بروتينات فلورية خضراء في الجيل F2 (المعرفة بواسطة PCR الخاصة بالجينات) لوصف naa10+ −5 ونلاحظ إشارة بروتينات فلورية خضراء تحت مجهر باستخدام خط DR5-بروتينات فلورية خضراء متماثل.
- وضع علامة على براعم الزهور ل ناه10+ − النباتات التي يتم متماثل التجارة والنقل DR5 كما هو مبين في 2.1.7.
- البحث عن إشارة بروتينات فلورية خضراء في الأجنة naa10 التي متماثل التجارة والنقل DR5 كما هو مبين في 2.2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يمكن استخدام الطريقة الموضحة في هذه الورقة لمراقبة embryogenesis مباشرة تحت مجهر، وإضافة تعليق توضيحي لمواصفات هوية الخلية أثناء embryogenesis مع علامات محددة، وتلخص دور الجينات خاصة أثناء امبريوجينيسيس.
وتظهر نتائج تمثيلية من التحليل للجنين الزخرفة (من مرحلة الزيجوت ممدود إلى مرحلة ناضجة عصا المشي) في البرية من نوع نبات في الشكل 2. بعد إزالة أبل، ويمكن تمييز الأجنة في مراحل إنمائية مختلفة بمدينة دبي للإنترنت مجهرية (الشكل 2). تم تسجيل نمط التعبير DR5-التجارة والنقل خلال embryogenesis تحت [كنفوكل] ليزر المسح المجهري (الشكل 3) تحديد توزيع اكسين في الجنين ودراسة الدور المحتمل اكسين أثناء امبريوجينيسيس في نبات.
يمكن أيضا استخدام هذا البروتوكول لتوصيف أدوار جينات محددة أثناء امبريوجينيسيس. هنا، تم بحث دور Naa10 أثناء امبريوجينيسيس في نبات كمثال. وقد لوحظ شعبة غير طبيعي النخامية (شعبة بميل والعمودي من النخامية في Naa10 بالمقارنة مع شعبة غير المتناظر عرضية من النخامية في النباتات البرية من نوع، الرقم 4). توزيع اكسين في مرحلة كروي تقريبا موحدة في معظم Naa10 الأجنة والإبقاء عليه إشارة أوسع نطاقا في النخامية، مقارنة بالأجنة نوع البرية (الشكل 5). تشير هذه النتائج إلى أن Naa10 مطلوب امبريوجينيسيس، وأن ذلك قد يكون متورطا في امبريوجينيسيس عن طريق اكسين إشارات الطريق في نبات.
الشكل 1: رسم تخطيطي لتشريح نبات خردلة. تم لصق (A) خردلة يعلق على الشريحة الزجاجية بقطعة من الشريط اللاصق على الوجهين. (ب) الصورة الموسع في مربع في ألف. السطرين وهمي تمثل الموقع الذي تريد تقسيمه. (ج) صورة خردلة انقسام في المربع دال (د) صورة خردلة انقسام الموسع. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2: دراسة امبريوجينيسيس في البرية من نوع (Col-0) نبات بالفحص المجهري DIC. اقحه الونجاتيد (A). (ب) المرحلة 1-خلية الجنين في 1 حزب العمل الديمقراطي. (ج) المرحلة 2/4 خلايا الجنين في 2 مديرية إدارة السجون. (د) مرحلة جنين أوكتانت في 3 مديرية إدارة السجون. (ﻫ) ديرماتوجين مرحلة الجنين في 3 مديرية إدارة السجون. (و) جنين كروي مرحلة الأولى في 4 مديرية إدارة السجون. (ز) الجنين كروي المرحلة المتأخرة في 5 مديرية إدارة السجون. (ح) قلب الجنين مرحلة في 6 مديرية إدارة السجون. (أنا) جنينا مرحلة طوربيد في 7 مديرية إدارة السجون. (ي) عصا المشي مرحلة جنين في 8 مديرية إدارة السجون. تغيير حجم أشرطة = 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: نمط التعبير DR5 في أجنة نبات البرية من نوع (Col-0). ( - د) إشارات التجارة والنقل. (أ-د) الصور المدمجة مع الصور الميدانية مشرق. وأعرب DR5 في القطب الجذري للمرحلة البرية من نوع كروي ( و ألف، 4 مديرية إدارة السجون) وقلب الأجنة المرحلة (ب و ب، 6 مديرية إدارة السجون). وأعرب DR5 أيضا في نصائح كوتيليدون الجنينية (ج ج، 7 مديرية إدارة السجون) والمفرج ناضجة البرية من نوع الأجنة (د د، 8 حزب العمل الديمقراطي). تغيير حجم أشرطة = 50 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: وصف دور Naa10 أثناء امبريوجينيسيس في نبات. التقسيم العادي النخامية في نبات البرية من نوع (A). يتم وضع علامة تقسيم غير طبيعي النخامية في نباتات متحولة Naa10 مع خط أبيض في (ب) (شعبة بميل النخامية) و (ج) (تقسيم عمودي النخامية). تغيير حجم أشرطة = 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 5: DR5 "التعبير نمط كروي المرحلة" البرية من نوع (Col-0) نبات والأجنة Naa10 . ( و ب) إشارات التجارة والنقل. (أ و ب) الصور المدمجة مع الصور الميدانية مشرق. وأعرب DR5 في القطب الجذر جنين كروي المرحلة البرية من نوع(و ألف) . وأعرب تقريبا موحد في جنينا Naa10 مرحلة كروي DR5 والإبقاء على إشارة أوسع نطاقا في النخامية بالمقارنة مع نوع البرية (ب و ب). تغيير حجم أشرطة = 50 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
إزالة ovule طريقة مفيدة للكشف عن انقسام الخلية وتقييم مورفولوجيا أثناء امبريوجينيسيس في نبات؛ باستخدام هذا الأسلوب، يمكن ملاحظة الأجنة مباشرة تحت المجهر DIC5،12. أن الخطوة الحاسمة لإزالة ovule خطوة 1.3.4. الوقت اللازم لإزالة أبل في الخطوة 1.3.4 متغير. يمكن ملاحظة الأجنة في المرحلة 2/4-خلية وضوح بعد ح 2 في الحل هوير، بينما تبدو واضحة بعد 12 ساعة. وهكذا، أكثر نضجاً ovule، يعد الوقت اللازم للتخليص.
في خطوة 2.2.5، عزل جنين من أبل، مقدار القوة المطبقة على الشريحة الحرجة. يمكن أن تسحق الأجنة إذا تم تطبيق الكثير من القوة؛ ومع ذلك، لا مقذوف جنين من أبل إذا كان يتم استخدام قوة صغيرة جداً. في تجربتنا، ovule أكثر نضجاً، مطلوب قوة أقل. يمكن أن تكون معزولة المرحلة الطوربيد والأجنة الناضجة مباشرة بواسطة تقشير فتح ovule استخدام إبرة محقن. كما قد دمرت بعض خلايا تعليق في الجنين معزولة أثناء عملية العزل، قد يكون إشارة الأسفار من تعليق المفقودة أو غير كاملة. قيد آخر لهذا الأسلوب أن الأجنة قبل المرحلة 4-الخلية التي كانت صعبة للعثور على من الأجنة مقذوف كما أنها صغيرة جداً ومحمية بشظية ovule.
مرحلة النمو والتشكل للجنين يمكن أن تتأثر بتحول بعض الجينات؛ يمكن إثبات هذه الآثار بالفحص المجهري بعد إزالة أبل. هذا النهج سوف تساعد في فهم هذه الآلية الجزيئية التي embryogenesis التوسط جينات محددة5. يمكن مراقبة نمط التعبيرالتجارة والنقل الانصهار الجينات الوظيفية غير معروف-أثناء امبريوجينيسيس بتوفير ارتباط بين الزخرفة الجنين والتعبير عن ذلك الجين، وتيسير تحديد الجينات الجديدة التي مطلوبة من أجل امبريوجينيسيس في نبات13. وهكذا، ينص البروتوكول على الموصوفة هنا وسيلة أساسية لوصف امبريوجينيسيس في نبات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
ونشكر الدكتور جيسيكا حبشي لقراءة خطيرة من المخطوطة. ونشكر الدكتور Xianyong شنغ من مركز التصوير، كلية علوم الحياة، جامعة العاصمة للمعلمين (بيجين، الصين)، للقيام بترجمة الإنزيم DR5-التجارة والنقل . هذا العمل كان يدعمها المنح من "مؤسسة العلوم حكومة بلدية بكين" (CIT & TCD20150102) ومن "مؤسسة العلوم الطبيعية الوطنية الصينية" (31600248).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chloral Hydrate | Sigma | 15307 | |
| Murashige and Skoog Basal Medium | Sigma | M5519 | |
| Phytagel | Sigma | P8169 | |
| Hygromycin | Roche | 10843555001 | |
| Growth chamber | Percival | CU36L5 | |
| Fluorescence microscope | Zeiss Oberkochen | Zeiss Image M2 | camera: AxioCam 506 color |
| Confocal Laser Scanning Microscopy | Zeiss Oberkochen | Zeiss LSM 5 | filters: BP 495 - 555 nm |
| Stereoscope | Zeiss Oberkochen | Axio Zoom V16 | camera: AxioCam MRc5 |
| nutrient-rich soil | KLASMANN, Germany | ||
| 50-mL tube | Corning Inc. | ||
| 1.5-mL tube | Corning Inc. | ||
| 10% sodium hypochlorite solution | Domestic analytical reagent | ||
| sucrose | Domestic analytical reagent | ||
| KOH | Domestic analytical reagent | ||
| glycerol | Domestic analytical reagent | ||
| culture dish | Domestic supplies | ||
| vermiculite | Domestic supplies | ||
| glass slide | Domestic supplies | ||
| syringe needle | Domestic supplies | ||
| fine-tipped tweezers | Domestic supplies | ||
| super clean bench | Domestic equipment |
References
- Jenik, P. D., Gillmor, C. S., Lukowitz, W.
- Lau, S., Slane, D., Herud, O., Kong, J., Jurgens, G. Early embryogenesis in flowering plants: setting up the basic body pattern. Annu Rev Plant Biol. 63, 483-506 (2012).
- Wendrich, J. R., Weijers, D. The Arabidopsis embryo as a miniature morphogenesis model. New Phytol. 199 (1), 14-25 (2013).
- ten Hove, C. A., Lu, K. J., Weijers, D. Building a plant: cell fate specification in the early Arabidopsis embryo. Development. 142 (3), 420-430 (2015).
- Feng, J., et al. Protein N-terminal acetylation is required for embryogenesis in Arabidopsis. J Exp Bot. 67 (15), 4779-4789 (2016).
- Berleth, T., Jurgens, G. The role of the monopteros gene in organising the basal body region of the Arabidopsis embryo. Development. 118, 575-587 (1993).
- Luo, Y., et al. D-myo-inositol-3-phosphate affects phosphatidylinositol-mediated endomembrane function in Arabidopsis and is essential for auxin-regulated embryogenesis. Plant Cell. 23 (4), 1352-1372 (2011).
- Nodine, M. D., Yadegari, R., Tax, F. E. RPK1 and TOAD2 are two receptor-like kinases redundantly required for Arabidopsis embryonic pattern formation. Dev Cell. 12 (6), 943-956 (2007).
- Ulmasov, T., Murfett, J., Hagen, G., Guilfoyle, T. J. Aux/IAA proteins repress expression of reporter genes containing natural and highly active synthetic auxin response elements. Plant Cell. 9 (11), 1963-1971 (1997).
- Friml, J., et al. Efflux-dependent auxin gradients establish the apical-basal axis of Arabidopsis. Nature. 426 (6963), 147-153 (2003).
- Clough, S. J., Bent, A. F. Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Plant J. 16 (16), 735-743 (1998).
- Fiume, E., Fletcher, J. C. Regulation of Arabidopsis embryo and endosperm development by the polypeptide signaling molecule CLE8. Plant Cell. 24 (3), 1000-1012 (2012).
- Jurkuta, R. J., Kaplinsky, N. J., Spindel, J. E., Barton, M. K. Partitioning the apical domain of the Arabidopsis embryo requires the BOBBER1 NudC domain protein. Plant Cell. 21 (21), 1957-1971 (2009).
