Summary
Этот протокол описывает метод для наблюдения эмбриогенеза в проростках Arabidopsis через яйцеклетку Распродажа следуют инспекции формирования зародыша шаблон под микроскопом.
Abstract
Учитывая весьма предсказуемый характер их развития, Arabidopsis эмбрионы использовались как модель для изучения морфогенеза растений. Однако ранней стадии завод эмбрионов малы и содержат несколько клеток, что делает их трудно наблюдать и анализировать. Характеризующих формирование шаблон в завод эмбрионов под микроскопом, используя модель организма Arabidopsisздесь описан метод. После очистки свежей яйцеклеток, используя Хойер решение мобильный номер в и морфология эмбрионы могут наблюдаться и стадии их развития могут определяться дифференциальной помехи контрастной микроскопии с помощью 100 X объектив погружения нефти. Кроме того выражение определенных маркер белков, помеченный с зеленого флуоресцентного белка (ГПУП) для аннотирования Спецификация идентификации клеток во время структурирования эмбриона контролируется Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия. Таким образом этот метод может использоваться соблюдать модель формирования в зародыши дикого типа растений на клеточном и молекулярном уровнях и охарактеризовать роль конкретных генов в эмбрион патронирования, сравнивая модели формирования в эмбрионы от дикого типа растений и эмбрионов смертоносных мутантов. Таким образом этот метод может использоваться для характеристики эмбриогенеза в проростках Arabidopsis.
Introduction
Эмбриогенез является раннее событие в развитии высших растений. Зрелая эмбриона формы из зиготы через клеточного деления и дифференциации под строгим генетическим контролем1,2. Арабидопсис эмбрионов являются полезной моделью для изучения управления морфогенеза, потому что последовательность клеточных делений во время эмбриогенеза ниже ожидаемых шаблон3,4. Однако эмбрион Arabidopsis , содержащие один в несколько ячеек слишком малы, чтобы быть замечен и проанализированы. Кроме того мутация некоторых генов может вызвать эмбриона летальность5, указывающее ключевую роль этих генов в эмбриогенезе. Характеристика формирования шаблона в зародыш смертоносных мутантов обеспечивает основу для понимания молекулярный механизм, при котором важно генов регулировать развитие эмбриона.
Подробный метод описан здесь для характеристики формирования зародыша шаблон в модели растение Arabidopsis прямого микроскопические наблюдения. Метод предполагает яйцеклетку Распродажа следуют микроскопические наблюдения эмбриона. Характеристика эмбриона смертоносных мутантов также описал.
Морфология эмбрионов на разных этапах своего развития может определяться непосредственно микроскопии, используя яйцеклеток, которые были очищены с Hoyer решение6,7. Такие семяпочек демонстрируют высокий коэффициент преломления; Таким образом этот яйцеклетку, очистка метод особенно выгодно для образцов, которые должны соблюдаться дифференциальной помехи микроскопия контраста (ОПК).
Кроме того гены, которые выражаются в определенной ячейке или ограниченное количество клеток во время эмбриогенеза может использоваться в качестве маркеров для идентификации клетки эмбриона. Таким образом Спецификация идентификации клеток во время эмбриогенеза может быть Аннотированная контролируя экспрессию белков GFP-тегами маркер, используя Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия. И наоборот наблюдения выражения неизвестного функциональных генов -GFP фьюжн во время эмбриогенеза может служить связующим звеном между эмбриона кучность и экспрессия этого гена и способствовать выявлению новых генов, которые требуются для эмбриогенеза в арабидопсиса.
Метод, описанный здесь может использоваться также характеризовать фенотип эмбриона смертоносных мутантов и для определения воздействия пострадавших гена на эмбриогенеза на клеточном уровне. Кроме того в сочетании с сравнение выражения шаблона маркерных генов во время эмбриогенеза между растениями дикого типа и мутантов, метод может принести подсказки о молекулярных механизмов и сигнальных путей, участвующих в эмбриогенезе8,9. Действительно этот метод был применен к naa10 растений, и было установлено, что аномальные разделение гипофиза в мутанта может быть вызвано изменением ауксинов распределения во время эмбриогенеза5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Примечание: Этот протокол состоит из трех частей: 1) наблюдения за модель формирования в одичал тип Arabidopsis эмбрионов, с помощью микроскопии ДВС; 2) характеризующие эмбриона модель формирования через наблюдение маркер выражения протеина используя Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия; и 3) определение роли определенного гена в эмбриогенезе (с использованием naa10 мутант в качестве примера).
1. яйцеклетка очистка
- Подготовка растений
Примечание: Протокол, описанные здесь приведен пример о том, как вырастить здоровых растений; также работают другие способы вырастить здоровых растений.- Добавить 100 семян в 1,5 мл, а затем добавьте 1 мл 1,5% гипохлорита натрия (смесь 15 мл 10% хлора с 85 мл воды) для стерилизации семена для 5 минут инвертировать трубки несколько раз для обеспечения полностью перемешанных полностью стерилизовать поверхности семена семена и решения.
- Сила семена в нижней части трубки центрифугированием 30 s на 1200 x g, удалить супернатант и мыть семена с стерильной водой четыре раза на скамейку, чтобы удалить остаточные гипохлорита натрия.
- Добавьте 1 Л ультрачистая вода 4,4 г фотосинтетическую и Скуг (МС) базальной смеси соли и 10 г сахарозы. Перемешайте смесь распустить солей и сахароза. Настроить решение для pH 5,8 с 1 M Кох, добавить 3 g желеобразователь, таких как Phytagel, MS-сахароза решение и стерилизовать раствор при температуре 121 ° C 15 мин сделать MS среднего.
- Налейте в культуры 12-см блюдо для создания средних пластины MS 30 мл среды MS.
- Поместите стерилизованные семена на табличке MS. Передача пластины в камере роста и держать пластину в условиях Лонг день (22 ° C 16 h в свете и 18 ° C в течение 8 ч в темноте) после стратификации семян (3 дня при температуре 4 ° C в темноте).
- После 8 дней роста передача растений в почву (микс богатые питательными веществами почвы и вермикулита в соотношении 1:1) в лоток, охватывают лоток с крышкой белый, прозрачный на 5 дней, чтобы избежать потери воды и оставить зазор во избежание витрификации растений.
- Возьмите крышку лотка и выращивать растения в камере ходить в Лонг день условиях (см. 1.1.5). Включите свет в 6:00 утра и с 10:00 вечера. Примерно через 20 дней роста в зале ходить растения цветками и производства siliques.
- Марк, бутоны с потоком на позиции семя стебли в соцветие в 8:00 вечера (не используйте первый для третьего бутоны; siliques, созданный из этих бутоны обычно разработать несколько прерванных семян, и это может изменить долю нормальным ненормального яйцеклеток). Определите в начале опыления яйцеклетку как когда отмеченные бутон открывает цвести в 8:00 утра утром следующего дня.
- Приготовление раствора Хойер в
- Добавьте 50 мл 24 g хлораль гидрата и обернуть трубу полностью с алюминиевой фольгой (решения хлораль гидрата не стабильны при свете).
- Далее добавить 9 мл ультрачистая вода и 3 мл глицерина в выше решение и встряхнуть трубки распустить хлораль гидрат. Чтобы сделать Хойер в раствор, пусть трубку на ночь стоять при комнатной температуре, чтобы устранить любые пузыри.
- Яйцеклетка разделения и Специальные акции
- Прикрепите кусок двухсторонний скотч на стекло микроскопа. Место стручок, выращенных на нужное количество дней после опыления (DAP) на слайде с pseudoseptum перпендикулярно поверхности; Это позволит сделать его легко разделить плодолистиков (цифры 1A и 1B).
- Сплит плодолистиков по обе стороны pseudoseptum с иглой шприца и прикрепить два расчлененных плодолистиков к слайду, так что семяпочек в стручок видны под стереоскоп (цифры 1 c и 1 D).
- Лунки 70 мкл Хойер в раствор на стеклянное скольжение, а затем смачивают кончик острым концом пинцет с Hoyer в раствор путем погружения. С помощью стереоскоп, переместите семяпочек в Hoyer решение на слайде с помощью пинцета, чтобы очистить эмбрионов. Применить coverslip к слайду осторожно, чтобы избежать создания любой пузыри.
- Положите готового слайд в коробку в темной комнате на 2-12 ч (более зрелые яйцеклетку, тем больше времени потребуется) при комнатной температуре. Эмбрионы на стадии 2/4-ячейки (1-2 DAP) может наблюдаться микроскопически после 2 ч, в то время как эмбрионы между Октант и ранних стадиях шаровых (3 DAP) может наблюдаться после 4 ч. Более зрелые эмбрионов (4-8 DAP) может наблюдаться через 12 ч.
- Изучите очищается яйцеклеток, используя функцию DIC микроскопа. Найдите эмбрионы под полем малой мощности (10 X), а затем измените мощных поле (100 X нефти погружения объектив) соблюдать Сотовый шаблон в развитых эмбрионов.
- Изучите эмбрионы на разных этапах своего развития.
2. характеристика эмбриона кучность и ячеек самобытности через наблюдение маркер выражения протеина
- Подготовка материалов завод
- Клонировать промоутер и кодирования последовательность маркеров генов или гормон ответ элемента и затем сливаются с флуоресцентный белок (например GFP); затем вставьте конструкцию в бинарный вектор (например pCambia1300). Здесь элемент ответа ауксинов DR5 представлен как пример10.
- Привнести одичал тип заводов Agrobacterium tumefaciensрезультате плазмида DR5-GFP -опосредованной преобразования11. Выберите T1 растений с использованием MS средних плит, содержащих hygromycin (50 мг/мл ликера мать, разбавленный 1:1, 000). Трансгенные растения будут выставлять длинные корни и создавать две розетки листьев после 8 дней роста в условиях, описанных в 1.1.5.
- Передачи трансгенные растения в почве и обрабатывать их, как указано в 1.1.6 и 1.1.7.
- Собирают семена T2 от независимых линий T1. Сеять семена на MS-hygromycin пластины, выберите растения, перевозящих одну копию вставки DR5-GFP (соотношение устойчивых растений для чувствительных растений будет примерно 3:1) и перевести их в почву.
- Культивируйте растения T2, как указано в 1.1.6 и 1.1.7.
- Собирают семена T3 от T2 растений. Сеять семена на MS-hygromycin пластины, выберите гомозиготных трансгенных растений (все растения из одной строки будет экспонат hygromycin сопротивления) и передавать их в почву.
- Марк бутоны гомозиготных T3 растений, как указано в 1.1.8.
- GFP сигнал наблюдения
- Смешайте 3 мл глицерина с 47 мл ультрачистая вода для создания 6% раствором глицерина.
- Прикрепить кусок двухсторонний скотч на стекло микроскопа и исправить стручок, как указано в 1.3.1.
- Разделение плодолистиков по обе стороны pseudoseptum с иглой шприца и прикрепить два расчлененных плодолистиков слайд под стереоскоп, как указано в 1.3.2.
- Обойтись 30 мкл 6% глицерина на слайд стекла и поместите все яйцеклеток из расчлененных плодолистиков в решения с помощью пинцета, острым концом. Осторожно разместите coverslip на слайде.
- Как семя Пальто и эндосперма в каждом яйцеклетка может предотвратить наблюдения сигналов GFP в эмбрион, извлечения эмбриона из яйцеклетку. Коснитесь слайда, быстро и аккуратно выдавливание эмбриона от яйцеклетку (более зрелая яйцеклетка является, меньше силы должны применяться к слайду).
- Просмотрите слайд для флуоресценции GFP с помощью Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия. Найти изолированных зародышей под полем малой мощности (10 X) и записывать их местоположение, а затем изменить мощных поле (100 X нефти погружения объектив) соблюдать экспрессия Гена GFP DR5 в эмбрионы, установив источник света возбуждения 488 нм для обнаружения сигнала GFP.
- Обнаружить экспрессия гена GFP в эмбрионов позволяет выбрать подходящую линию T3 для дальнейшего анализа.
3. характеристика формирования шаблон эмбриона в зародыш смертельное мутант через Распродажа яйцеклетку и маркер белка наблюдения: Naa10 качестве примера
- Кучность эмбриона в мутантных растений naa10
- Подготовьте материалы завода, как указано в 1.1.1-1.1.7.
- Определить naa10+/ − растений методом ПЦР с использованием гена специфические праймеры5, а затем Марк бутоны naa10+/ − растения, как указано в 1.1.8.
- Распродажа яйцеклетку и микроскопическое исследование naa10+/ − эмбрионы, как указано в 1.2 и 1.3.
- Анализ белка маркера с использованием naa10 эмбрионов
- Получения подходящей DR5-GFP трансгенных линий с помощью процедуры, изложенные в пункте 2.1-2.2.
- Крест гомозиготных трансгенные линии DR5-GFP с naa10+/ − завода для получения naa10+/ − растения, которые гомозиготных GFP флуоресценции маркера на поколение F2 (определяется по ген специфического PCR) характеризовать naa10+/ −5 и наблюдать GFP сигнал под микроскопом с помощью гомозиготных линии DR5-GFP .
- Марк бутоны naa10+/ − растения, которые гомозиготных для DR5-GFP как указано в 2.1.7.
- Поиск GFP сигнала в naa10 эмбрионов, которые гомозиготных для DR5-GFP как указано в 2.2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Метод, описанный в этом документе может использоваться для наблюдения эмбриогенеза непосредственно под микроскопом, аннотировать Спецификация идентификации клеток во время эмбриогенеза с конкретными маркеров и охарактеризовать роль определенного гена во время эмбриогенеза.
Представитель результаты анализа эмбриона, кучность (от стадии удлиненные зиготы в зрелой стадии ходьба stick) в одичал тип Arabidopsis показано на рисунке 2. После оформления яйцеклетку эмбрионы на разных этапах своего развития может отличают DIC микроскопии (рис. 2). Выражения DR5-GFP был записан во время эмбриогенеза под Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия (рис. 3), чтобы определить распределение ауксинов в эмбрион и изучения потенциальной роли ауксинов во время эмбриогенеза в проростках Arabidopsis.
Этот протокол также может использоваться для описания роли конкретных генов во время эмбриогенеза. Здесь роль Naa10 во время эмбриогенеза в проростках Arabidopsis было рассмотрено как пример. Аномальные отдел гипофиза было отмечено (косо и вертикальное разделение гипофиза в Naa10 по сравнению с поперечной асимметричным разделением гипофиза в одичал тип растений, рис. 4). Распределение ауксинов в стадии шаровидных был почти равномерным в большинстве Naa10 эмбрионов и сохранить широкий сигнал в гипофизе, по сравнению с дикого типа эмбрионов (рис. 5). Эти результаты показывают, что Naa10 является обязательным для эмбриогенеза, и что он может быть вовлечен в эмбриогенезе через ауксинов, сигнальный путь в арабидопсиса.
Рисунок 1: Схема для рассечения Arabidopsis стручок. (A) крепится на стеклянное скольжение стручок был вставлен с куском двухсторонний скотч. (B) увеличенное изображение поля в а. Две воображаемые линии представляет расположение должны быть разделены. (C) увеличенное изображение Сплит стручок в поле в D. (D) изображение Сплит стручок. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: Изучение эмбриогенеза в одичал тип (Col-0) Arabidopsis , DIC микроскопии. (A) удлиненные зиготы. (B) этап 1-клеток эмбриона в 1 DAP. (C) A этап 2/4-клеток эмбриона в 2 DAP. (D) эмбрион стадии Октант на 3 DAP. (E) A dermatogen стадии эмбриона в 3 DAP. (F) раннего эмбриона шаровидных этап 4 DAP. (G) A конце шаровидных стадии эмбриона в 5 DAP. (H) A сердце стадии эмбриона в 6 DAP. (я) стадии эмбриона Торпедо в 7 DAP. (J) ходьба stick стадии эмбриона в 8 DAP. Масштаб баров = 10 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: Шаблон выражения DR5 в эмбрионы Arabidopsis одичал тип (Col-0). ( - d) GFP сигналов. (A-D) Объединенного изображения с яркими поле изображения. DR5 была выражена в корень полюса шаровидных стадии одичал тип ( и A, 4 DAP) и сердце этап (b и B, 6 DAP) эмбрионов. DR5 была также выражена в эмбриональных Семядоля советы (c и C, 7 DAP) и сосудистую зрелых одичал тип эмбрионов (d и D, 8 DAP). Масштаб баров = 50 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: Характеристика роли Naa10 во время эмбриогенеза в арабидопсиса. Нормальное деление гипофиза в растение дикого типа (A). Аномальные отдел гипофиза в Naa10 мутантных растений отмечены белая линия в (B) (косо отдел гипофиза) и (C) (вертикальное разделение гипофиза). Масштаб баров = 10 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: DR5 выражению в глобулярных стадии одичал тип (Col-0) Arabidopsis и Naa10 эмбрионов. ( и b) GFP сигналы. (A и B) Объединенного изображения с яркими поле изображения. В корень полюс одичал тип шаровидных стадии эмбриона ( и A) была выражена DR5 . DR5 почти равномерно была выражена в глобулярных стадии Naa10 эмбриона и сохранил более широкие сигнал в гипофизе по сравнению с дикого типа (b и B). Масштаб баров = 50 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Распродажа яйцеклетку является полезным методом для обнаружения деление клеток и оценки морфологии во время эмбриогенеза в арабидопсиса; используя эту технику, эмбрионы можно наблюдать непосредственно под ДВС микроскопии5,12. Важным шагом для оформления яйцеклетку является шаг 1.3.4. Время, необходимое для оформления яйцеклетку в шаге 1.3.4 — переменная. Эмбрионы на стадии 2/4-ячейки можно ясно наблюдать после 2 ч в растворе Хойер, тогда как они выглядят нечеткими через 12 ч. Таким образом более зрелой яйцеклетку является, тем дольше время, необходимое для оформления.
В шаг 2.2.5 чтобы изолировать эмбриона от яйцеклетку, важно количество силы применяется к слайду. Эмбрионы могут быть раздроблены, если слишком много сил применяется; Однако эмбрион не экструдированный от яйцеклетку, если используется слишком мало сил. В нашем опыте тем более зрелых яйцеклетку, требуется меньше сил. Стадии Торпедо и зрелые эмбрионы могут быть изолированы непосредственно пилинг открыть яйцеклетку, с помощью иглы шприца. Как некоторые подвесы клетки могут быть уничтожены в изолированных эмбриона во время процесса изоляции, флуоресценции сигнал от подвесы могут быть потеряны или неполными. Еще одно ограничение этого метода является, что эмбрионов до стадии 4-ячейки были трудно найти из экструдированного эмбрионов, как они слишком малы и экранированный на яйцеклетку фрагмент.
Стадии развития и морфология эмбриона могут быть затронуты мутация некоторых генов; такое воздействие может быть продемонстрирована микроскопии после разминирования яйцеклетку. Этот подход поможет в понимании молекулярный механизм посредничества эмбриогенеза какие конкретные гены5. Наблюдения за выражения неизвестного функциональных генов -GFP фьюжн во время эмбриогенеза может служить связующим звеном между патронирования эмбриона и экспрессия этого гена и способствовать выявлению новых генов, которые требуются для эмбриогенеза Arabidopsis13. Таким образом протокол, описанные здесь обеспечивает основной метод для характеризации эмбриогенеза в арабидопсиса.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Мы благодарим д-р Джессика Хабаши за критически прочтения рукописи. Мы благодарим д-р Xianyong Sheng центра изображения, Колледж наук о жизни, Capital Normal University (Пекин, Китай), для выполнения локализации DR5-GFP assay. Эта работа была поддержана гранты от фонда науки муниципального правительства Пекин (CIT & TCD20150102) и из национального фонда Китая естественных наук (31600248).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chloral Hydrate | Sigma | 15307 | |
| Murashige and Skoog Basal Medium | Sigma | M5519 | |
| Phytagel | Sigma | P8169 | |
| Hygromycin | Roche | 10843555001 | |
| Growth chamber | Percival | CU36L5 | |
| Fluorescence microscope | Zeiss Oberkochen | Zeiss Image M2 | camera: AxioCam 506 color |
| Confocal Laser Scanning Microscopy | Zeiss Oberkochen | Zeiss LSM 5 | filters: BP 495 - 555 nm |
| Stereoscope | Zeiss Oberkochen | Axio Zoom V16 | camera: AxioCam MRc5 |
| nutrient-rich soil | KLASMANN, Germany | ||
| 50-mL tube | Corning Inc. | ||
| 1.5-mL tube | Corning Inc. | ||
| 10% sodium hypochlorite solution | Domestic analytical reagent | ||
| sucrose | Domestic analytical reagent | ||
| KOH | Domestic analytical reagent | ||
| glycerol | Domestic analytical reagent | ||
| culture dish | Domestic supplies | ||
| vermiculite | Domestic supplies | ||
| glass slide | Domestic supplies | ||
| syringe needle | Domestic supplies | ||
| fine-tipped tweezers | Domestic supplies | ||
| super clean bench | Domestic equipment |
References
- Jenik, P. D., Gillmor, C. S., Lukowitz, W.
- Lau, S., Slane, D., Herud, O., Kong, J., Jurgens, G. Early embryogenesis in flowering plants: setting up the basic body pattern. Annu Rev Plant Biol. 63, 483-506 (2012).
- Wendrich, J. R., Weijers, D. The Arabidopsis embryo as a miniature morphogenesis model. New Phytol. 199 (1), 14-25 (2013).
- ten Hove, C. A., Lu, K. J., Weijers, D. Building a plant: cell fate specification in the early Arabidopsis embryo. Development. 142 (3), 420-430 (2015).
- Feng, J., et al. Protein N-terminal acetylation is required for embryogenesis in Arabidopsis. J Exp Bot. 67 (15), 4779-4789 (2016).
- Berleth, T., Jurgens, G. The role of the monopteros gene in organising the basal body region of the Arabidopsis embryo. Development. 118, 575-587 (1993).
- Luo, Y., et al. D-myo-inositol-3-phosphate affects phosphatidylinositol-mediated endomembrane function in Arabidopsis and is essential for auxin-regulated embryogenesis. Plant Cell. 23 (4), 1352-1372 (2011).
- Nodine, M. D., Yadegari, R., Tax, F. E. RPK1 and TOAD2 are two receptor-like kinases redundantly required for Arabidopsis embryonic pattern formation. Dev Cell. 12 (6), 943-956 (2007).
- Ulmasov, T., Murfett, J., Hagen, G., Guilfoyle, T. J. Aux/IAA proteins repress expression of reporter genes containing natural and highly active synthetic auxin response elements. Plant Cell. 9 (11), 1963-1971 (1997).
- Friml, J., et al. Efflux-dependent auxin gradients establish the apical-basal axis of Arabidopsis. Nature. 426 (6963), 147-153 (2003).
- Clough, S. J., Bent, A. F. Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Plant J. 16 (16), 735-743 (1998).
- Fiume, E., Fletcher, J. C. Regulation of Arabidopsis embryo and endosperm development by the polypeptide signaling molecule CLE8. Plant Cell. 24 (3), 1000-1012 (2012).
- Jurkuta, R. J., Kaplinsky, N. J., Spindel, J. E., Barton, M. K. Partitioning the apical domain of the Arabidopsis embryo requires the BOBBER1 NudC domain protein. Plant Cell. 21 (21), 1957-1971 (2009).
