Summary
이 프로토콜 embryogenesis 애기 에 난 허가 뒤에 현미경으로 배아 패턴 형성의 검사를 통해 관찰 하는 방법을 설명 합니다.
Abstract
그들의 개발의 높은 예측 가능한 특성을 감안할 때, 애기 배아 사용 되었습니다 모델로 morphogenesis 식물에서의 연구에 대 한. 그러나, 초기 단계 공장 배아 작은 그리고 그들을 관찰 하 고 분석 어렵게 만드는 몇 가지 셀을 포함. 메서드는 특성화 모델 유기 체 애기를 사용 하 여 현미경으로 식물 배아에서 패턴 형성에 대 한 여기 설명 되어 있습니다. Hoyer의 솔루션을 사용 하 여 신선한 ovules의 정리, 다음에 휴대폰 번호와 배아의 형태 관찰 될 수 있었다, 그리고 그들의 발달 단계는 기름 침수 렌즈 X 100을 사용 하 여 미분 간섭 명암 현미경에 의해 결정 될 수 있었다. 또한, 특정 마커 단백질 녹색 형광 단백질 (GFP)와 태그의 표현 confocal 레이저 스캐닝 현미경 검사 법에 의해 셀 id 사양 배아 패턴화 하는 동안 주석을 모니터링 했다. 따라서, 세포 및 분자 수준에서 야생-타입 식물 배아에서 패턴 형성을 관찰 하 고 야생-타입 식물 및 배아 치명적인 돌연변이 배아에서 패턴 형성을 비교 하 여 모방 하는 태아에서에서 특정 유전자의 역할을 특성화 하기 위해이 메서드를 사용할 수 있습니다. 따라서 메서드는 애기에 embryogenesis 특성을 사용할 수 있습니다.
Introduction
Embryogenesis 높은 공장 개발에서 초기 이벤트입니다. 세포 분열 및 엄격한 유전자 제어1,2차별화 통해 zygote에서 성숙한 배아 형태. 애기 배아는 embryogenesis 동안 세포 분열의 순서 예상된 패턴3,4를 따르기 때문에 morphogenesis의 제어를 공부 하는 유용한 모델입니다. 그러나, 여러 셀에 하나를 포함 하는 애기 배아 관찰 하 고 분석에 너무 작습니다. 또한, 특정 유전자의 돌연변이 배아 치 사 율5, embryogenesis에서 그 유전자의 중요 한 역할을 나타내는 발생할 수 있습니다. 배아-치명적인 돌연변이에 패턴 형성의 특성 필수 유전자 배아 개발을 규제 하는 의하여 분자 메커니즘을 이해 하기 위한 기초를 제공 한다.
자세한 방법은 직접 현미경 관찰에 의해 모델 공장 애기 배아 패턴 형성 특성에 대 한 여기 설명 되어 있습니다. 방법은 난 클리어런스를 배아의 현미경 관찰에 의해 다음을 포함 한다. 배아-치명적인 돌연변이의 특성 또한 설명 되어 있습니다.
다른 발달 단계에서 배아의 형태 Hoyer의 솔루션6,7지운 ovules를 사용 하 여 현미경으로 직접 확인할 수 있습니다. 이러한 ovules 전시 높은 굴절률; 따라서, 메서드를 비운이 난 차동 간섭 콘트라스트 (DIC) 현미경으로 관찰 한다 견본을 위해 특히 유리 하다.
또한, embryogenesis 동안 특정 셀 또는 셀 제한 된 수에 표현 되는 유전자 배아에서 세포를 식별 하기 위해 마커로 사용할 수 있습니다. 따라서, embryogenesis 동안 셀 id 사양 confocal 레이저 스캐닝 현미경 검사 법을 사용 하 여 GFP 태그 마커 단백질의 식이 모니터링 하 여 주석 첨부 될 수 있습니다. 반대로, 그것이 embryogenesis 중 한 알 수 없는 기능 유전자-GFP 융해의 식 패턴을 관찰 배아 패턴화와 그 유전자의 표현 사이의 링크를 제공를 애기에 embryogenesis에 필요한 새로운 유전자의 식별을 용이 하 게 됩니다.
여기 설명 하는 방법을 사용할 수 있습니다 또한 배아 치명적인 돌연변이의 표현 형을 특성화 하 고 세포 수준에서 embryogenesis에 영향을 받는 유전자의 영향을 확인 하. 또한, 함께 비교 마커 유전자의 표현 패턴의 야생 형 및 돌연변이 식물 사이 embryogenesis 동안, 방법은 분자 메커니즘 및 신호 경로 embryogenesis8,9에 참여에 대 한 단서를 얻을 수 있습니다. 실제로, 메서드 naa10 식물에 적용 된 그리고 그것은 돌연변이에 hypophysis의 비정상적인 부문 변화 embryogenesis5동안 auxin 배포에 의해 발생할 수 있습니다 발견 했다.
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Protocol
참고:이 프로토콜은 세 부분: 1) DIC 현미경;를 사용 하 여 야생-타입 애기 배아에서 패턴 형성 관찰 2) 특성화는 배아 패턴 형성을 통해 마커 단백질 표정 confocal 레이저 스캐닝 현미경 검사 법;를 사용 하 여 관찰 그리고 3) embryogenesis (예를 들어 naa10 돌연변이 사용)에서 특정 유전자의 역할을 결정.
1. 난 개간
- 식물 소재 준비
참고: 여기에 설명 된 프로토콜; 건강 한 식물을 성장 하는 방법에 예입니다. 건강 한 식물을 성장 하는 다른 방법 또한 작동 합니다.- 1.5 mL 튜브에 100 씨앗을 추가 하 고 소독 하 5 분 반전에 대 한 씨앗 튜브 여러 번 씨와 솔루션은 완전히 표면 씨앗 소독을 잘 혼합 되도록 1.5% 염소 (믹스 물 85 mL와 10% 염소의 15 mL)의 1 mL를 추가 합니다.
- 30에 대 한 원심 분리 하 여 튜브의 하단에 씨앗을 강제로 s 1200 x g에서 상쾌한, 제거 하 고 잔류 염소를 제거 하는 벤치에서 씨앗 살 균 물으로 4 번 세척.
- 1 l의 초순 4.4 g Skoog (MS)와 村 重 기저 소금 혼합물의 고 자당의 10 g를 추가 합니다. 소금 및 자당 분해 혼합물을 저 어. 고 에이전트, Phytagel, 등의 3 세대 MS 자당 솔루션에 추가 1 m 코, pH 5.8에 솔루션을 조정 하 고 MS 매체를 15 분 동안 121 ° C에서 솔루션을 소독.
- MS 중간 접시를 생성 하는 12 cm 문화 요리에 MS 매체의 30 mL를 붓으십시오.
- MS 판에 소독된 씨앗을 놓습니다. 성장 챔버에 접시를 전송 하 고 씨앗 층 리 (어둠 속에서 4 ° C에서 3 일) 후 긴 하루 조건 (22 ° C 16 h는 빛과 어둠 속에서 8 h 동안 18 ° C)에서 접시를 유지.
- 8 일 후의 성장, 식물 토양 (혼합 영양이 풍부한 토양 및 1:1 비율로 vermiculite) 쟁반에 전송 하 고 물 손실을 방지 하기 위해 5 일 흰색, 투명 한 뚜껑 트레이 커버 식물의 vitrification를 피하기 위해 간격을 두고.
- 용지함에서 뚜껑 하 고 긴 하루 조건 (1.1.5 참조)에서 도보 약 실에 있는 식물을 육성. 오전 6 시 빛을 전환 하 고에서 오후 10 시. 대형 챔버에 성장의 약 20 일 후 식물은 꽃 있고 siliques 생산.
- 씨앗의 위치에서 스레드가 있는 꽃 봉 오리는 꽃이 핌에서 오후 8 시 줄기 마크 (세 번째 꽃 봉 오리를 첫 번째 사용 하지 않는, 보통이 꽃 봉 오리에서 생성 된 siliques 몇 중단된 씨앗, 개발과이 비정상적인 ovules 정상의 비율을 변경할 수 있습니다). 표시 된 버드 오전 8 시 다음 날 아침 꽃 열 때로 난의 수 분의 시작을 정의 합니다.
- Hoyer의 솔루션의 준비
- 50 mL 튜브에 chloral 하이드 레이트의 24 g을 추가 하 고 완전히 알루미늄 호 일 (chloral 하이드 레이트의 솔루션은 빛 아래에서 안정)와 함께 튜브 포장.
- 다음, 위의 솔루션을 9 mL 초순 물과 글리세롤의 3 mL를 추가 하 고 해산 chloral 하이드 레이트 튜브를 흔들어. Hoyer의 솔루션으로 만들기 위해 모든 거품을 제거 하기 위해 실내 온도에 밤새 서 튜브를 하자.
- 난 분리 및 정리
- 양면 접착 테이프의 조각을 현미경 유리 슬라이드에 연결 합니다. 원하는 수 분 (DAP) pseudoseptum; 표면에 수직으로 슬라이드에 후 일 수에 대 한 성장 하는 silique 배치 이것은 carpels (그림 1A 및 1B)를 쉽게 할 것 이다.
- 주사기 바늘으로는 pseudoseptum의 양쪽에 carpels를 분할 하 고 2 개의 해 부 carpels 슬라이드 연결 하는 silique에서 ovules (그림 1C 및 1d) stereoscope 아래 볼 수 있습니다.
- 유리 슬라이드에 Hoyer의 솔루션의 70 µ L를 분배 하 고 파 버 Hoyer의 솔루션으로 뾰족한 핀셋의 쌍의 끝을 축. stereoscope를 사용 하 여 이동은 ovules Hoyer의 솔루션으로 슬라이드에 배아를 청소를 핀셋으로. 부드럽게 모든 거품을 생성 하지 않으려면 슬라이드는 coverslip을 적용 됩니다.
- 둔다 2-12 h에 대 한 어두운 방에 상자에 완성 된 슬라이드를 (더 성숙 된 난, 더 많은 시간이 필요 하 게 됩니다) 실내 온도에. 2/4-셀 단계 (1-2 DAP)에서 배아 배아 octant 구형 초기 (3 DAP) 사이 4 h 후 관찰 될 수 있다 그러나 2 시간 후 현미경으로 관찰할 수 있습니다. 더 성숙한 배아 (4-8 DAP) 12 h 후 관찰할 수 있습니다.
- 현미경의 DIC 함수를 사용 하 여 지운된 ovules를 검사 합니다. 저전력 필드 (10 배)에서 배아를 찾아서 다음 개발 된 배아에서 세포 패턴을 관찰 하 고 전력 분야 (100 X 기름 침수 렌즈)로 변경 합니다.
- 다른 발달 단계에서 배아를 검사 합니다.
2. 배아 패턴화 및 마커 단백질 식의 관찰을 통해 셀 Id의 특성
- 식물 재료의 준비
- 발기인 및 코딩 시퀀스 마커 유전자 또는 호르몬 응답 요소를 복제 하 고 형광 단백질 ( GFP); 같은 퓨즈 다음 구문이 삽입 (예: pCambia1300) 이진 벡터. 여기, auxin 응답 요소 DR5 예제10으로 제공 됩니다.
- Agrobacterium tumefaciens에 의해 야생 형 식물으로 결과 DR5 GFP 플라스 미드를 소개-변환11중재. T1 식물 hygromycin 포함 된 MS 중간 접시를 사용 하 여 선택 (50 mg/mL의 어머니 주류, 희석 1:1, 000). 유전자 변형 식물 긴 뿌리를 전시 하 고 1.1.5에 설명 된 조건 하에서 성장의 8 일 후 두 장미 잎을 생성.
- 토양에 유전자 변형 식물을 전송 및 1.1.6 및 1.1.7에 표시 된 대로 그들을 육성.
- 독립적인 T1 라인에서 T2 씨앗을 수집 합니다. MS hygromycin 접시에 씨앗을 뿌리 다, DR5 GFP 삽입 (민감한 식물에 저항 하는 식물의 비율이 될 것 이다 대략 3:1)의 복사본 하나를 운반 하는 식물을 선택 하 고 토양에 그들을 전송.
- 1.1.6에 1.1.7 같이 t 2 식물을 육성.
- T2 식물에서 T3 씨앗을 수집 합니다. MS hygromycin 접시에 씨앗을 뿌리 다, homozygous 유전자 변형 식물 (모두 한 줄에서 식물의 전시 hygromycin 저항)을 선택 하 고 토양에 그들을 전송.
- 1.1.8에 표시 된 대로 homozygous T3 식물의 꽃 봉 오리를 표시 합니다.
- GFP 신호 관측
- 6% 글리세롤 솔루션을 생성 하기 위해 초순의 47 mL와 글리세롤의 3 mL를 혼합.
- 양면 접착 테이프의 조각 유리 현미경 슬라이드를 부착 하 고는 silique 1.3.1에 표시 된 대로 수정.
- 주사기 바늘으로는 pseudoseptum의 양쪽에 carpels를 분할 하 고 1.3.2에 표시 된 대로 stereoscope 아래 슬라이드에 두 개의 해 부 carpels를 연결 합니다.
- 유리 슬라이드에 6% 글리세롤의 30 µ L를 분배 고 해 부 carpels에서 ovules의 모든 솔루션 뾰족한 핀셋을 사용 하 여 합니다. 부드럽게 슬라이드에는 coverslip을 놓습니다.
- 씨 외 투 및 각 난에 endosperm GFP 신호 태아에서의 관찰을 방지할 수 있습니다,으로 난에서 태아를 추출 합니다. 신속 하 고 부드럽게 슬라이드를 누릅니다 (더 성숙한는 난은, 슬라이드에 더 적은 힘을 적용 한다)는 난에서 태아를 돌출 시킬.
- GFP 형광 confocal 레이저 스캐닝 현미경 검사 법을 사용 하 여에 대 한 슬라이드를 검사 합니다. 낮은-전력 분야 (10 배)에서 격리 된 배아를 찾을 그들의 위치를 기록 그리고 DR5 GFP 식 배아에 488을 여기 광원을 설정 하 여 관찰 하 고 전력 분야 (100 X 기름 침수 렌즈) 변경 GFP 신호 검출에 대 한 nm.
- 추가 분석을 위해 적당 한 T3 라인 선택 배아에 GFP 식 감지.
3. 특성화의 난 클리어런스 및 마커 단백질 관찰을 통해 배아 치명적인 돌연변이에 배아 패턴 형성: 예를 들어 Naa10
- Naa10 돌연변이 식물에 모방 하는 태아
- 1.1.1-1.1.7에 표시 된 대로 식물 재료를 준비 합니다.
- Naa10식별+ / − 식물 유전자 특정 뇌관5, 다음 표를 사용 하 여 PCR에 의해 naa10의 꽃 봉 오리+ / − 1.1.8에 표시 된 대로 식물.
- 난 정리 및 naa10의 현미경 검사 수행+ / − 배아 1.2와 1.3에 표시 된 대로.
- Naa10 배아를 사용 하 여 마커 단백질 분석
- 2.1-2.2에 명시 된 절차를 사용 하 여 적합 한 DR5-GFP 유전자 변형 라인을 얻을.
- 구나10 homozygous DR5-GFP 유전자 변형 라인 크로스+ − naa10를 공장+ / − 식물 homozygous GFP 형광 마커 (유전자 특정 PCR에 의해 식별 된) F2 세대에서 naa10특성을+ −5 GFP 신호 homozygous DR5 GFP 라인을 사용 하 여 현미경으로 관찰 하 고.
- Naa10의 꽃 봉 오리를 표시+ / − DR5-GFP 2.1.7에서 homozygous 식물.
- DR5-GFP 2.2에서 homozygous naa10 배아에서 GFP 신호에 대 한 검색.
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Representative Results
이 문서에서 설명 하는 방법은 embryogenesis 직접 현미경으로 관찰 하 고, 특정 마커, embryogenesis 동안 셀 id 사양 주석을 추가 하 고 embryogenesis 동안 특정 유전자의 역할의 특성을 사용할 수 있습니다.
배아 (성숙한 스틱 산책 단계로 길쭉한 접합 자 단계)에서 야생-타입 애기 에 패턴의 분석에서 대표적인 결과 그림 2에 표시 됩니다. 난 정리 후 다른 발달 단계에서 배아 DIC 현미경 검사 법 (그림 2)에 의해 구별 될 수 있는. DR5-GFP 의 표현 패턴 embryogenesis에서 confocal 레이저 스캐닝 현미경 검사 법 (그림 3) 배아에 auxin의 분포를 결정 하 고 애기에 embryogenesis 동안 auxin의 잠재적인 역할을 검사 하는 동안 기록 되었다.
이 프로토콜은 또한 embryogenesis 동안 특정 한 유전자의 역할을 특성화 하기 위해 사용할 수 있습니다. 여기, 애기 에 embryogenesis 동안 Naa10 의 역할은 예를 들어 시험 되었다. hypophysis의 비정상적인 부문 ( Naa10 야생-타입 식물, 그림 4에서 hypophysis의 가로 비대칭 부분을 가진 비교에서 hypophysis의 비스듬히 및 수직 사업부) 관찰 되었다. 구형 무대에 auxin의 분포 대부분 Naa10 배아에서 거의 균일 한 고 야생 유형 배아 (그림 5)에 비해 hypophysis에 광범위 한 신호를 유지. 이러한 결과 Naa10 embryogenesis에 대 한 필요 하 고 애기에 통로 신호 하는 auxin 통해 embryogenesis에 관련 되어있을 수 있습니다 나타냅니다.
그림 1: 애기 Silique의 해 부에 대 한 회로도. (A) 유리 슬라이드에 연결 된 silique 양면 접착 테이프의 조각으로 붙여 넣 했다. (B) a에서 상자의 확대 이미지 2 상상의 선을 표현에 분할 위치. (C) 디 (D) 분할 silique의 이미지 상자에 분할 silique의 확대 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: DIC 현미경 검사 법에 의해 야생-타입 (열 0) 애기 에 Embryogenesis의 시험. (A) Elongated zygote. (B) A 1 셀 단계 태아 1 DAP에서. (C) A 2 DAP에서 2/4-셀 단계 배아. (D) 3 octant 단계 배아 튐. (E) A 3 DAP에 dermatogen 단계 배아. (F) 4 초기 구형 단계 배아 튐. (G) A 5 DAP에 늦은 구형 단계 배아. (H) A 6 DAP에 심장 단계 배아. (나) 7 DAP에서 어 뢰 단계 배아. (J) 8 DAP에 스틱 산책 단계 배아. 스케일 바 = 10 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: DR5 야생-타입 (열 0) 애기 배아에서의 표현 패턴입니다. (a - d) GFP 신호. (A-D) 밝은 분야 이미지 병합 된 이미지입니다. DR5 야생-타입 구형 단계 (a 와 A, 4 DAP)와 마음 (b 와 B, 6 DAP) 단계 배아의 루트 극에 표현 했다. DR5 배아 떡 팁 (c 와 C, 7 DAP)와 성숙한 야생-타입 배아 (d 와 D, 8 DAP)의 맥 관 구조에도 표현 되었다. 스케일 바 = 50 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Embryogenesis 애기에 동안 Naa10 의 역할의 그림 4: 특성 야생-타입 식물 (A)에서 hypophysis의 정상적인 부분. Naa10 돌연변이 식물에 hypophysis의 비정상적인 부분 흰 선 (B)는 (hypophysis 비스듬히 부문) 및 (C)는 (hypophysis 수직 부문)로 표시 됩니다. 스케일 바 = 10 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: DR5 식 패턴 구형 무대 야생-타입 (열 0) 애기 와 Naa10 배아에. (a 와 b) GFP 신호입니다. (A 와 B) 밝은 분야 이미지 병합 된 이미지입니다. DR5 야생-타입 구형 단계 배아(및 A) 의 루트 극에 표현 했다. DR5 구형 단계 Naa10 배아에 거의 균일 하 게 표현 했다 고 야생 유형 (b 와 B)에 비해 hypophysis에 광범위 한 신호를 유지. 스케일 바 = 50 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
난 클리어런스는 세포 분열을 감지 하 고 애기;에서 embryogenesis 동안 형태를 평가 하는 유용한 방법 이 기술을 사용 하 여, 배아 DIC 현미경5,12에서 직접 관찰할 수 있습니다. 난 정리를 위한 중요 한 단계는 단계 1.3.4. 1.3.4 단계에서 난 허가에 필요한 시간은 변수입니다. 2/4-셀 단계에서 배아 Hoyer의 솔루션에서 2 시간 후 그들은 불명료 한 후 12 h 보이는 반면 명확 하 게 관찰할 수 있습니다. 따라서, 더 성숙한 한 난, 더 이상 시간 이다 허가에 필요한.
2.2.5 단계는 난에서 배아를 분리 하는 슬라이드에 적용 되는 힘의 양을 중요 합니다. 태아 수 있습니다 짓 눌린 경우 너무 많은 힘이 적용 됩니다. 그러나, 너무 작은 힘을 사용 하는 경우 태아는 난에서 돌출 될 수 없습니다. 우리의 경험에서는, 더 성숙한는 난, 더 적은 힘이 필요 하다. 어 뢰 무대와 성숙한 배아 필 링 오픈 한 난 주사기 바늘을 사용 하 여 직접 고립 될 수 있다. Suspensor 세포의 일부 고립 된 배아에서 분리 과정에서 파괴 수도, 형광 신호는 suspensor에서 손실 되거나 불완전 한 수 있습니다. 이 방법의 또 다른 한계는 4 셀 단계 전에 배아 했다 그들은 너무 작고 난 조각에 의해 차폐 된 배아에서 찾기 어렵다 이다.
발달 단계와 배아의 형태학; 특정 유전자의 돌연변이 의해 영향을 받을 수 있습니다. 이러한 효과 난 클리어런스에 따라 현미경에 의해 설명할 수 있습니다. 이 접근은 어느 특정 유전자 중재 하십시오 embryogenesis5분자 메커니즘의 이해에 도움이 됩니다. 알 수 없는 기능 유전자GFP 융해 embryogenesis 동안의 식을 패턴 관찰 배아 패턴화와 그 유전자의 표현 사이의 링크를 제공 하 고 애기13에 embryogenesis에 필요한 새로운 유전자의 식별을 용이 하 게 수 있습니다. 따라서, 여기에 설명 된 프로토콜 애기에 embryogenesis 특성에 대 한 기본 메서드를 제공 합니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
우리는 비판적으로 원고 읽기 위한 박사 제시카 Habashi 감사 합니다. 우리 DR5 GFP 분석 결과의 지역화를 수행 하기 위한 이미징 센터,의 생명 과학, 수도 사범 대학 (베이징, 중국), 대학 박사 Xianyong Sheng을 감사 합니다. 이 작품은 베이징 시 정부 과학 재단에서 교부 금에 의해 지원 되었다 (CIT & TCD20150102) 국가 자연 과학 재단의 중국 (31600248)에서.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chloral Hydrate | Sigma | 15307 | |
| Murashige and Skoog Basal Medium | Sigma | M5519 | |
| Phytagel | Sigma | P8169 | |
| Hygromycin | Roche | 10843555001 | |
| Growth chamber | Percival | CU36L5 | |
| Fluorescence microscope | Zeiss Oberkochen | Zeiss Image M2 | camera: AxioCam 506 color |
| Confocal Laser Scanning Microscopy | Zeiss Oberkochen | Zeiss LSM 5 | filters: BP 495 - 555 nm |
| Stereoscope | Zeiss Oberkochen | Axio Zoom V16 | camera: AxioCam MRc5 |
| nutrient-rich soil | KLASMANN, Germany | ||
| 50-mL tube | Corning Inc. | ||
| 1.5-mL tube | Corning Inc. | ||
| 10% sodium hypochlorite solution | Domestic analytical reagent | ||
| sucrose | Domestic analytical reagent | ||
| KOH | Domestic analytical reagent | ||
| glycerol | Domestic analytical reagent | ||
| culture dish | Domestic supplies | ||
| vermiculite | Domestic supplies | ||
| glass slide | Domestic supplies | ||
| syringe needle | Domestic supplies | ||
| fine-tipped tweezers | Domestic supplies | ||
| super clean bench | Domestic equipment |
References
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