Summary
本议定书概述了观察胚胎发生的但在拟南芥中通过依次检查在显微镜下胚胎模式形成的胚珠间隙的方法。
Abstract
给出的发展高度可预测性，拟南芥胚胎有被用作模型研究植物的形态发生。然而，早期植物胚胎很小，包含几个细胞，使它们难以观察和分析。一种方法在这里描述中使用的模式生物拟南芥在显微镜下的植物胚胎模式形成。之后使用 Hoyer 解决方案的新鲜胚珠的间隙，可以观察胚胎形态学和细胞数目中的，和他们发育阶段可以由微分干涉相衬显微镜使用 100 X 油浸没透镜。此外，标记与绿色荧光蛋白 (GFP) 的特异性标记蛋白的表达被监视批注单元格标识规范期间胚胎模式通过共聚焦激光扫描显微镜。因此，可以使用此方法，观察野生型植物胚胎细胞和分子层面的模式形成和通过比较模式形成的胚胎从野生型植物和胚胎致死突变表征特定基因在胚胎模式中的作用。因此，该方法可以用于表征在拟南芥胚胎发生。
Introduction
胚胎发育是中高等植物发育最早的事件。成熟胚的形式从一个受精卵通过细胞分裂和分化在严格的遗传控制1，2下。拟南芥胚胎是一个有用的模型，研究形态发生的控制，因为胚胎发生过程中细胞分裂的顺序遵循预期的模式3，4。然而，包含一到多个单元格拟南芥胚是太小了，观察和分析。此外，某些基因的突变会导致胚胎致死5，指示这些基因在胚胎发生过程中的关键作用。在胚胎致死突变模式形成的表征为理解藉以必需基因调节胚胎发育的分子机制提供了依据。
详细的方法在这里描述为表征的模式植物拟南芥胚胎模式形成由直接的微观观察。该方法涉及然后微观观察的胚胎的胚珠间隙。此外介绍胚胎致死突变体的特性。
不同发育阶段的胚胎的形态学可以直接测定显微镜与霍耶的解决方案6，7使用已被清除的胚珠。这种胚珠表现出高的折射率;因此，这胚珠结算方法是特别有利的必须遵守微分干涉显微镜 (DIC) 的标本。
此外，基因在胚胎发育过程中都是在一个特定的细胞或细胞数量有限表示可以用作标记来识别中的胚胎细胞。因此，胚胎发生过程中的细胞标识规范可以注明通过监视使用共聚焦激光扫描显微镜的 GFP 标记的标记蛋白的表达。相反，观察未知功能基因GFP融合胚胎发生过程中的表达模式可提供胚胎模式与该基因的表达之间的联系及促进所需的拟南芥胚胎发育的新基因的鉴定。
描述表型的胚胎致命的突变体，并确定受影响的基因在胚胎发生在细胞水平上的影响，也可以使用这里介绍的方法。此外，结合比较的标记基因的表达模式之间野生型与突变型植物胚胎发生过程中，该方法可以产生分子机制和信号传导通路在胚胎发生8，9的线索。事实上，该方法被应用于naa10植物，它被发现的突变体中垂体异常分裂可能引起胚胎发生5年间，生长素分布的变化。
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Protocol
注： 此协议有三个部分： 1) 观测模式形成在野生型拟南芥胚胎使用 DIC 显微镜;2） 表征胚胎模式形成通过观察标记蛋白的表达，使用激光共聚焦扫描显微镜;和 3） 确定特定基因 （使用naa10突变体为例） 的胚胎发生过程中的作用。
1.胚珠结算
- 植物材料的制备
注意： 此处所述的议定书 》 是一个例子如何种植健康的植物;其他的方法来生长健康的植物也工作。- 一 1.5 毫升管，添加 100 种子，然后添加 1 毫升的 1.5%次氯酸钠 （混合 15 毫升 10%氯与 85 毫升的水） 来消毒 5 分钟倒种子管几次，确保种子和溶液充分混合完全消毒表面的种子。
- 用离心法为 30 到管底力种子在 1,200 x g s 除去上清，和在一条长凳，以去除残留的次氯酸钠洗的种子用无菌水四倍。
- 4.4 g 的村蕃和斯库格 (MS) 的基底盐混合物和 10 克的蔗糖添加 1 L 的超纯水。搅动混合物溶解的盐类和蔗糖。调整到 pH 5.8 用 1 米岛，解 3 g 的凝胶剂，培养基，MS-蔗糖溶液，加上消毒 121 ° C，15 分钟，使 MS 培养基的解决方案。
- 30 毫升的 MS 培养基倒入 12 厘米的培养皿，生成 MS 中厚板。
- 在 MS 板上放置消毒的种子。将板转移到生长室及在长日条件 (16 h 在光和 18 ° C 8 h 在黑暗中为 22 ° C) 下的板后种子分层 （在 4 ° C，在黑暗中的 3 天）。
- 经过 8 天的生长，将植物转移到土壤 （组合富含养分的土壤和蛭石在比例为 1:1） 在一个托盘，涵盖 5 天，以避免水的损失，白色，透明盖纸盒和留下了一个缺口，避免玻璃化冷冻保存的植物。
- 把盖子揭开，托盘和培养下长日条件 （见 1.1.5） 步入式室内植物。开灯，在 6:00 上午和关闭在 10:00 下午。大约 20 天之后的增长在步入式会议厅，植物会有花和产生长角果。
- 马克花芽与种子中的位置的线程在 8:00 下午茎秆在花序 （不要使用第一到第三的花蕾; 通常从这些花蕾生成的长角果开发几个流产的种子，和这可能会改变正常异常胚珠的比例）。时红的芽将打开，并在 8:00 上午第二天早上花定义授粉的胚珠作为的开始。
- 霍耶的溶液的制备
- 24 g 的水合氯醛 50 毫升管加包装管完全用铝箔 （水合氯醛的解决方案不是稳定在灯光下的）。
- 接下来，向上述解决方案中添加 9 毫升纯水和甘油 3 毫升和摇管解散水合氯醛。为了使霍耶的解决方案，让管一夜之间站在室温，消除任何气泡。
- 胚珠分离和清
- 将一块双面压敏胶带附加到显微镜载玻片。放置角果生长所需数目的幻灯片与垂直于表面; pseudoseptum (DAP) 授粉后天数这将使它容易拆分心皮 （图 1A和1B）。
- 用针头劈开 pseudoseptum 两边都心皮和附加两个解剖心皮到幻灯片，以便在角果胚珠都可见镜下获得立体 （数字 1和1 D）。
- 免去 70 微升的玻片，霍耶的溶液，然后用来蘸滋润一把尖头镊子 Hoyer 解决方案一角。使用立体，进入胚珠霍耶的解决方案在幻灯片上用镊子清洁的胚胎。应用于幻灯片轻轻地以避免产生任何气泡的盖玻片。
- 把成品的滑入一个框，在黑暗的房间里为 2 ~ 12 小时 （越成熟胚珠，将需要更多的时间） 在室温。(1-2 DAP) 2/4-细胞阶段的胚胎可以后 2 h，显微镜下观察到，虽然可以在 4 小时后观察胚胎八区和球形早期 (3 DAP) 之间。更成熟胚 (4-8 DAP) 可以在 12 小时后观察。
- 检查使用的显微镜 DIC 函数清除胚珠。在低功耗领域 (10 X) 下找到胚胎，然后更改到一个大功率的字段 （100 X 油浸没透镜） 以观察中发达国家胚胎的细胞模式。
- 检查胚胎发育不同阶段。
2.胚胎模式和通过观察标记蛋白表达细胞身份的表征
- 植物材料的制备
- 克隆启动子和编码序列的标记基因或激素反应元件，然后将其融合与荧光蛋白 （ GFP); 如接下来，插入 （如 pCambia1300) 的二进制向量的构造。在这里，生长素反应元件dr5 的表达是提出了一种作为示例10。
- 引入野生型植物根瘤农杆菌介导产生GFP dr5 的表达质粒-介导转化11。选择使用 MS 中厚板含潮霉素的 t1 代植株 （50 毫克/毫升的母液稀释 1:1，000）。转基因植物会表现出长根和经过 8 天的生长 1.1.5 中所述的条件下生成两个莲座丛叶。
- 将转基因植物转移到土壤和培养他们如 1.1.6 和 1.1.7 所示。
- 从独立的 T1 线路收集 T2 种子。播下的种子在 MS 潮霉素板上，选择适宜的植物，携带一份dr5 的表达绿色荧光蛋白插入 （敏感植物的抗性植株的比例将大约 3:1），和将他们转移到土壤。
- 培养 T2 植物如 1.1.6 和 1.1.7 所示。
- 从 T2 植物收集 T3 种子。播下的种子在 MS 潮霉素板上，选择纯合的转基因植物 （所有的植物从一行将展示潮霉素抗性），并将他们转移到土壤。
- 1.1.8 所示，将标记的纯合子的 T3 植物花蕾。
- 绿色荧光蛋白信号观察
- 用来生成 6%甘油溶液超纯水 47 毫升混合 3 毫升的甘油。
- 将一块双面压敏胶带附加到玻片和修复角果 1.3.1 所示。
- 用针头劈开 pseudoseptum 两边都心皮和附加两个解剖心皮向下立体幻灯片 1.3.2 所示。
- 免除 30 微升的 6%甘油到玻璃幻灯片并将所有从解剖心皮胚珠放入使用尖头镊子的解。轻轻地将盖玻片放在幻灯片上。
- 种皮和胚乳中每个胚珠可以防止观察 GFP 信号在胚胎中，提取胚胎从胚珠。点击幻灯片快速、 轻轻挤压胚胎从胚珠 （越成熟胚珠是较少力量应该应用到幻灯片）。
- 检查为 GFP 荧光共焦激光扫描显微镜使用幻灯片。在低功耗领域 (10 X) 下找到离体的胚和记录他们的位置，然后更改到一个大功率的字段 （100 X 油浸没透镜） 以观察dr5 的表达绿色荧光蛋白表达在胚胎通过将激发光源设置为 488 nm 的荧光信号检测。
- 在胚胎来选择合适的 T3 线作进一步的分析检测 GFP 表达。
3.通过胚珠间隙和标记蛋白观察胚胎致死突变体胚胎模式形成的表征： Naa10为例
- 胚胎阵列的naa10突变体植株
- 准备的植物材料，1.1.1-1.1.7 所示。
- 确定naa10+ −由 PCR 基因特异性引物5，然后标记植物花蕾的naa10+ −植物 1.1.8 所示。
- 执行胚珠间隙和镜检的naa10+ −胚胎如 1.2 和 1.3 所示。
- 使用naa10胚胎的标记蛋白质分析
- 获得使用 2.1-2.2 所述程序适合dr5 的表达绿色荧光蛋白转基因株系。
- 越界纯合子dr5 的表达绿色荧光蛋白转基因与naa10+ −工厂获得naa10+ −植物是纯合型 GFP 荧光标记在 F2 代 （标识基因特异性聚合酶链反应） 来表征naa10+ −5和观察 GFP 信号使用纯合子DR5 GFP行显微镜下的。
- 标记的naa10 花蕾+ − DR5 GFP 2.1.7 所示的纯合的植物。
- 搜索DR5 GFP 2.2 所示的纯合的naa10胚胎的绿色荧光蛋白信号。
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Representative Results
在本文中描述的方法可以用于观察直接在显微镜下的胚胎发生、 带有特定标记，注释胚胎发生过程中的细胞标识规范和胚胎发育过程描述特定基因的作用。
代表分析结果得到的胚胎模式 （从细长的受精卵阶段到成熟的手杖阶段） 在野生型拟南芥如图 2所示。胚珠过关后不同发育阶段的胚胎可分辨出 DIC 显微术 (图 2)。共聚焦激光扫描显微镜 (图 3)，以确定生长素在胚胎中的分布和在拟南芥胚胎发生过程中检查的潜在作用的生长素的胚胎发育过程录得dr5 的表达绿色荧光蛋白的表达模式。
此协议也可以用于表征胚胎发生过程中的特定基因的作用。这里， Naa10在拟南芥胚胎发生过程中的作用被审查作为一个例子。脑下垂体的异常分裂观察 （歪斜和垂直分工在Naa10相比横向不对称分裂的野生型植物，图 4中垂体垂体）。生长素在球形阶段的分布是均匀在大多数Naa10胚胎，保留一个更广泛的信号，在垂体，而野生型胚胎 (图 5)。这些结果表明Naa10是需要胚胎发生，并可能参与生长素信号转导通路在拟南芥胚发生。
图 1：拟南芥角果夹层的示意图。(A) 角果附在玻璃幻灯片用一块双面压敏胶带粘贴。(B) 在 A.框放大图像两个假想线代表要拆分的位置。(C) 中的框中 (D) 的图像拆分角果 D.拆分角果放大图像。 请点击这里查看此图的大版本。
图 2： 检查胚胎发生在 (Col-0) 野生型拟南芥的 DIC 显微镜。(A) 细长受精卵。(B) A 1-细胞期胚胎在 1 磷酸二铵。(C) A 2/4-细胞期胚胎在 2 磷酸二铵。(D) 分体阶段胚胎在 3 磷酸二铵。(E) A dermatogen 阶段胚胎在 3 磷酸二铵。(F) 早期球状胚胎在 4 磷酸二铵。(G) A 晚球形阶段胚胎在 5 磷酸二铵。(H) A 心阶段胚胎在 6 磷酸二铵。(我) 7 磷酸二铵在鱼雷阶段胚胎。(J)在 8 磷酸二铵的手杖阶段胚胎。规模酒吧 = 请点击这里查看此图的大版本。 10 µ m。
图 3: dr5 的表达野生型 (Col-0)拟南芥胚胎表达模式。(-d)绿色荧光蛋白信号。(A D)合并的图像的明亮的领域图像。DR5与会者在野生型球形阶段 （ A、 4 磷酸二铵） 和心阶段b和B（6 磷酸二铵） 胚根杆。在胚胎子叶提示 （c和C，7 磷酸二铵） 和在血管的成熟野生型胚 （d和D，8 磷酸二铵），也有人表示dr5 的表达。规模酒吧 = 请点击这里查看此图的大版本。 50 µ m。
图 4： 表征胚胎发生过程中拟南芥 Naa10的作用。在野生型植物 (A) 垂体正常分工。Naa10突变体植株在垂体异常分工是用白线在 (B) （脑下垂体歪斜分工） 和 (C) （脑下垂体垂直分工） 标记的。规模酒吧 =请点击这里查看此图的大版本。 10 µ m。
图 5: dr5 的表达中的表达式模式球形阶段 (Col-0) 野生型拟南芥和Naa10胚胎。（a和b）绿色荧光蛋白的信号。（A和B）合并的图像的明亮的领域图像。DR5与会者在野生型胚胚胎 （ A） 根杆。DR5的球状Naa10胚胎几乎一致地表达了和保留中垂体较野生型 （b和B） 更广泛的信号。规模酒吧 = 请点击这里查看此图的大版本。 50 µ m。
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Discussion
胚珠间隙是种有用的检测细胞分裂和评估拟南芥; 在胚胎发生过程中的形态学方法使用这种技术，可以直接在 DIC 显微镜5，12下观察到胚。胚珠间隙关键的一步是一步 1.3.4。胚珠间隙 1.3.4 步骤中所需的时间是变量。2/4-细胞阶段的胚胎可以清楚地观察后 2 h 在霍耶的解决方案中，，而在 12 小时后，他们看隐隐绰绰。因此，越成熟的胚珠是，清关所需的时间越长。
在步 2.2.5，隔离从胚珠，胚的力应用到幻灯片的大小至关重要。可以粉碎胚胎，如果太多力;然而，胚胎不能挤压从胚珠，如果使用太少的武力。在我们的经验，越成熟的胚珠是，需要较少的力量。鱼雷阶段和成熟胚可以隔离直接由剥开使用针头的胚珠。由于一些胚柄细胞可能会摧毁被孤立的胚胎中分离过程中，从胚柄的荧光信号可能丢失或不完整。这种方法的另一个限制是前 4-细胞期胚胎是很难找到从挤压的胚胎，因为它们太小和屏蔽由胚珠片段。
发育阶段和形态的胚胎可以受突变的某些基因;这种影响可以一斑镜后胚珠间隙。这种方法将由哪些特定基因介导胚胎发生5援助中的分子机制的理解。观察的未知功能基因GFP融合胚胎发生过程中的表达模式可提供胚胎模式与该基因的表达之间的联系及促进所需的拟南芥13在胚胎发育的新基因的鉴定。因此，此处所述议定书 》 规定的基本方法，胚胎在拟南芥中的表征。
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Disclosures
作者没有透露。
Acknowledgments
我们感谢杰西卡 · 哈巴希博士批判性阅读的手稿。我们感谢成像中心，首都师范大学 （中国北京），生命科学学院博士白先勇盛执行dr5 的表达绿色荧光蛋白测定的定位。这项工作由从北京市政政府科学基金会赠款 (CIT & TCD20150102) 和中国国家自然科学基金会 (31600248)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chloral Hydrate | Sigma | 15307 | |
| Murashige and Skoog Basal Medium | Sigma | M5519 | |
| Phytagel | Sigma | P8169 | |
| Hygromycin | Roche | 10843555001 | |
| Growth chamber | Percival | CU36L5 | |
| Fluorescence microscope | Zeiss Oberkochen | Zeiss Image M2 | camera: AxioCam 506 color |
| Confocal Laser Scanning Microscopy | Zeiss Oberkochen | Zeiss LSM 5 | filters: BP 495 - 555 nm |
| Stereoscope | Zeiss Oberkochen | Axio Zoom V16 | camera: AxioCam MRc5 |
| nutrient-rich soil | KLASMANN, Germany | ||
| 50-mL tube | Corning Inc. | ||
| 1.5-mL tube | Corning Inc. | ||
| 10% sodium hypochlorite solution | Domestic analytical reagent | ||
| sucrose | Domestic analytical reagent | ||
| KOH | Domestic analytical reagent | ||
| glycerol | Domestic analytical reagent | ||
| culture dish | Domestic supplies | ||
| vermiculite | Domestic supplies | ||
| glass slide | Domestic supplies | ||
| syringe needle | Domestic supplies | ||
| fine-tipped tweezers | Domestic supplies | ||
| super clean bench | Domestic equipment |
References
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