Summary
Este protocolo describe un método para la observación de embriogénesis en Arabidopsis vía separación de óvulo, seguido por la inspección de la formación de patrones de embrión bajo un microscopio.
Abstract
Dada la naturaleza altamente predecible de su desarrollo, embriones de Arabidopsis se han utilizado como modelo de estudios de morfogénesis en plantas. Sin embargo, embriones en fase temprana de plantas son pequeños y contienen pocas células, haciéndolas difíciles de observar y analizar. Aquí se describe un método para caracterizar la formación de embriones de la planta bajo el microscopio utilizando el organismo modelo Arabidopsis. Tras la separación de óvulos frescos usando solución de Hoyer, pudieran observarse el número de celular de y morfología de los embriones, y su etapa de desarrollo podría ser determinado por microscopía de contraste de interferencia diferencial usando un 100 X lente de inmersión de aceite. Además, la expresión de proteínas del marcador específico etiquetadas con proteína fluorescente verde (GFP) fue supervisada para anotar la especificación de identidad de la célula durante el dibujo de embrión por microscopía de láser confocal. Así, este método puede utilizarse para observar la formación de embriones de la planta de tipo salvaje a nivel celular y molecular y caracterizar el papel de genes específicos en modelar embrionario mediante la comparación de la formación de patrones en los embriones de las plantas de tipo silvestre y mutantes letales para el embrión. Por lo tanto, el método puede utilizarse para caracterizar la embriogénesis en Arabidopsis.
Introduction
Embriogénesis es el evento más temprano en el desarrollo de las plantas superior. Una forma de embriones maduros de un cigoto por división celular y diferenciación bajo estricto control genético1,2. Embriones de Arabidopsis son un modelo útil para estudiar el control de la morfogénesis porque la secuencia de divisiones celulares durante la embriogénesis sigue un patrón esperado3,4. Sin embargo, un embrión de Arabidopsis con una a varias células es demasiado pequeño para ser observado y analizado. Además, la mutación de ciertos genes puede causar embrión letalidad5, que indica el papel clave de estos genes en la embriogénesis. La caracterización de la formación de patrones en los mutantes letales para el embrión constituye una base para entender el mecanismo molecular por el que genes esenciales regulan el desarrollo embrionario.
Un método detallado se describe aquí para la caracterización de la formación de patrón del embrión en la planta modelo Arabidopsis por observación microscópica directa. El método implica la separación del óvulo seguido por la observación microscópica de un embrión. También se describe la caracterización de un mutante letal para el embrión.
La morfología de los embriones en diferentes etapas de desarrollo se puede determinar directamente por microscopia con los óvulos que han sido borrados solución6,7 de Hoyer. Estos óvulos exhiben un alto índice de refracción; así, este óvulo claro método es especialmente ventajoso para las muestras que deben ser observadas por microscopia de interferencia diferencial (DIC) de contraste.
Además, los genes que se expresan en una celda determinada o un número limitado de células durante la embriogénesis pueden utilizarse como marcadores para identificar las células en un embrión. Por lo tanto, la especificación de identidad celular durante la embriogénesis se puede anotar mediante el control de la expresión de proteínas del marcador etiquetado GFP utilizando microscopía de láser confocal. Por el contrario, observando el patrón de expresión de un gen funcional desconocida -GFP fusion durante la embriogénesis puede proporcionar un vínculo entre patrones de embrión y la expresión de ese gen y facilitar la identificación de nuevos genes que se requieren para la embriogénesis en Arabidopsis.
El método aquí descrito puede utilizarse también para caracterizar el fenotipo de un mutante letal para el embrión y para determinar el impacto del gen afectado en la embriogénesis a nivel celular. Además, en combinación con una comparación de los patrones de expresión de genes marcadores durante la embriogénesis entre plantas tipo salvaje y mutantes, el método puede producir pistas sobre los mecanismos moleculares y las vías de señalización implicadas en la embriogénesis8,9. De hecho, el método fue aplicado a las plantas de naa10 , y se encontró que la división anormal de la hipófisis en el mutante puede ser causada por un cambio en la distribución de la auxina durante embriogénesis5.
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Protocol
Nota: Este protocolo tiene tres partes: 1) observando la formación de patrones en embriones de Arabidopsis de tipo salvaje utilizando microscopía DIC; 2) caracterizar el embrión patrón formación a través de la observación de la expresión de la proteína del marcador mediante láser confocal de barrido microscopía; y 3) determinar el papel de un gen específico en la embriogénesis (usando el mutante de naa10 como ejemplo).
1. el óvulo claro
- Preparación de material de planta
Nota: El protocolo descrito aquí es un ejemplo de cómo hacer crecer plantas sanas; otras maneras de crecer plantas sanas también trabajan.- Añade 100 a un tubo de 1,5 mL y luego añadir 1 mL de hipoclorito de sodio 1.5% (15 mL de 10% de cloro con 85 mL de agua de la mezcla) para esterilizar las semillas durante 5 minutos invertir el tubo varias veces para asegurar que las semillas y la solución bien mezcladas para esterilizar las superficie semillas completamente.
- Forzar las semillas en la parte inferior del tubo de centrifugación durante 30 s a 1.200 x g, eliminar el sobrenadante y lavar las semillas con agua destilada cuatro veces en un banco para eliminar el hipoclorito residual.
- Añadir a 1 L de agua ultrapura 4,4 g de mezcla sal basal Murashige y Skoog (MS) y 10 g de sacarosa. Revolver la mezcla para disolver las sales y la sacarosa. Ajustar la solución a pH 5.8 con 1 M de KOH, añadir 3 g de agente gelificante, como Phytagel, a la solución de sacarosa de MS y para esterilizar la solución a 121 ° C durante 15 min hacer MS medio.
- Vierta 30 mL de medio MS en una placa de cultivo de 12 cm para generar placas de medio MS.
- Coloque las semillas estériles en la placa MS. Transferir la placa a una cámara de crecimiento y mantenga la placa bajo condiciones de día largo (22 ° C por 16 h en la luz y 18 ° C durante 8 h en la oscuridad) después de la estratificación de la semilla (3 días a 4 ° C en la oscuridad).
- Después de 8 días de crecimiento, transferir las plantas al suelo (mezcla rica en nutrientes suelo y vermiculita en una proporción 1:1) en una bandeja, cubrir la bandeja con una tapa blanca, transparente por 5 días evitar pérdida de agua y deje un espacio para evitar la vitrificación de las plantas.
- Tomar la tapa de la bandeja y cultivar las plantas en una cámara independiente bajo condiciones de día largo (ver 1.1.5). Encender la luz en 6:00 y fuera a 22:00. Después de 20 días de crecimiento en la cámara de cabina, las plantas habrán floreció y produjo silicuas.
- Marca de tallos de brotes de la flor con un hilo en la posición de la semilla en la inflorescencia en 20:00 (no utilice la primera a la tercera flor; las silicuas generados a partir de estos capullos generalmente desarrollan algunas semillas abortadas, y esto puede alterar la proporción de normales a anormales óvulos). Definir el inicio de la polinización el óvulo como cuando el brote marcado se abre en flor en 8:00 la mañana siguiente.
- Preparación de solución de Hoyer
- Añadir a un tubo de 50 mL 24 g de hidrato de cloral y envuelva el tubo completamente con papel de aluminio (no son estables bajo luz soluciones de hidrato de cloral).
- A continuación, añadir 9 mL de agua ultrapura y 3 mL de glicerol a la solución anterior y agitar el tubo para disolver el hidrato de cloral. Para hacer solución de Hoyer, dejar que el tubo soporte de la noche a temperatura ambiente para eliminar cualquier burbuja.
- Separación y separación del óvulo
- Coloque un pedazo de cinta adhesiva de doble cara a un portaobjeto de microscopio. Coloque una silicua crecido para el número deseado de días después de la polinización (DAP) de la diapositiva con la pseudoseptum perpendicular a la superficie; Esto hará fácil dividir los carpelos (figuras 1A y 1B).
- Dividir los carpelos en ambos lados de la pseudoseptum con una aguja de jeringa y coloque los dos carpelos disecados a la diapositiva para que los óvulos en la silicua son visibles bajo un estereoscopio (figuras 1C y 1D).
- Dispensar de 70 μl de solución de Hoyer en el portaobjetos de cristal y luego humedecer la punta de un par de pinzas de punta fina con solución de Hoyer por inmersión. Usando el estereoscopio, mover los óvulos en la solución de Hoyer en el portaobjetos con las pinzas para limpiar los embriones. Se aplica un cubreobjetos a la diapositiva suavemente para evitar la generación de burbujas.
- Colocar la corredera acabada en una caja en un cuarto oscuro de 2-12 h (cuanto más madura un óvulo es, cuanto más tiempo se necesitará) a temperatura ambiente. Embriones en la etapa de 2/4-cell (DAP de 1-2) pueden observarse microscópicamente después de 2 h, mientras que los embriones entre el octante y estadios globulares (DAP 3) se observan después de 4 h. Embriones más maduros (4-8 UTA) pueden observarse después de 12 h.
- Examinar los óvulos hayan borrado usando la función DIC de un microscopio. Coloque los embriones en un campo de baja potencia (10 X) y luego cambiar a un campo de alta potencia (objetivo de inmersión del aceite del X 100) para observar el patrón celular en los embriones desarrollados.
- Examinar los embriones en diferentes etapas de desarrollo.
2. Caracterización de patrones de embrión e identidad de la célula a través de la observación de la expresión de la proteína de marcador
- Preparación de materiales de planta
- Clonar el promotor y la secuencia del marcador gene u hormona respuesta elemento de codificación y luego fusionarlo con una proteína fluorescente (como GFP); a continuación, inserte el construir el vector binario (por ejemplo, pCambia1300). Aquí, el elemento de respuesta a auxinas DR5 se presenta como un ejemplo10.
- Introducir el plásmido resultante del DR5-GFP en las plantas de tipo silvestre por tumefaciens de la agrobacteria-mediado transformación11. Seleccione las plantas de T1 utilizando placas de medio de MS con Higromicina (50 mg/mL de licor de madre, diluido 1:1, 000). Las plantas transgénicas se exhiben largas raíces y generar dos hojas de la roseta después de 8 días de crecimiento bajo las condiciones descritas en 1.1.5.
- Transferir las plantas transgénicas a tierra y cultivarlos como se indica en 1.1.6 y 1.1.7.
- Recoger las semillas de la T2 de las líneas T1 independiente. Sembrar las semillas en las placas de EM-Higromicina, seleccionar las plantas portadoras de una copia de la inserción del DR5-GFP (la proporción de plantas resistentes a las plantas sensibles será aproximadamente 3:1) y transferencia al suelo.
- Cultivar las plantas de T2 como se indica en 1.1.6 y 1.1.7.
- Recoger las semillas de la T3 de las plantas de T2. Sembrar las semillas en las placas de EM-Higromicina, seleccionar las plantas transgénicas homocigóticas (todas las plantas de una sola línea muestran resistencia Higromicina) y transferir al suelo.
- Marque los botones florales de las plantas homocigóticas de T3 como se indica en 1.1.8.
- Observación de señal GFP
- Mezclar 3 mL de glicerol con 47 mL de agua ultrapura para generar una solución de glicerol 6%.
- Adhiera un pedazo de cinta adhesiva de doble cara a un portaobjetos de vidrio y fijar una silicua como se indica en 1.3.1.
- Dividir los carpelos en ambos lados de la pseudoseptum con una aguja de jeringa y coloque los dos carpelos disecados en el portaobjetos bajo un estereoscopio como se indica en 1.3.2.
- Dispensar 30 μl de 6% de glicerol en el portaobjetos de cristal y colocar todos los óvulos de los carpelos disecados en la solución con unas pinzas de punta fina. Colocar suavemente un cubreobjetos sobre el portaobjetos.
- Como la capa de semilla y endospermo en cada óvulo pueden impedir la observación de las señales de la GFP en el embrión, extraer el embrión el óvulo. Puntee la diapositiva rápidamente y suavemente a extraer el embrión desde el óvulo (más madura un óvulo es, menos fuerza se debe aplicar a la diapositiva).
- Examinar el portaobjetos usando microscopía de láser confocal de la fluorescencia de GFP. Encontrar los embriones aislados en un campo de baja potencia (10 X) y registrar su ubicación, luego cambiar a un campo de alta potencia (objetivo de inmersión del aceite del X 100) para observar la expresión DR5-GFP en los embriones mediante el establecimiento de la fuente de luz de excitación de 488 nm para la detección de la señal de la GFP.
- Detectar la expresión de GFP en los embriones para seleccionar la línea T3 adecuada para su posterior análisis.
3. Caracterización de la formación embrionaria en un mutante letal embrión mediante separación del óvulo y marcador proteína observación: Naa10 como ejemplo
- Dibujo del embrión en plantas mutantes naa10
- Preparar los materiales de planta como se indica en 1.1.1-1.1.7.
- Identificar la naa10+ / − plantas por PCR utilizando cebadores específicos del gen5y marca luego los capullos de la naa10+ / − plantas como se indica en 1.1.8.
- Realizar la separación del óvulo y la examinación microscópica del naa10+ / − embriones como se indica en 1.2 y 1.3.
- Análisis de la proteína del marcador naa10 embriones
- Obtener convenientes líneas transgénicas DR5-GFP utilizando el procedimiento descrito en 2.1-2.2.
- Cruzar una línea transgénica homocigótica de DR5-GFP con un naa10+ / − planta para obtener naa10+ / − plantas que son homocigóticas para el marcador de la fluorescencia de GFP en la generación F2 (identificada por PCR de genes específicos) caracterizar naa10+ / −5 y observe la señal GFP bajo el microscopio utilizando una línea homocigótica del DR5-GFP .
- Marcar los botones florales de naa10+ / − plantas que son homocigóticas para DR5-GFP como se indica en 2.1.7.
- La búsqueda de la señal de la GFP en naa10 los embriones que son homocigotos para DR5-GFP como se indica en 2.2.
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Representative Results
El método descrito en este documento puede utilizarse para observar la embriogénesis directamente bajo un microscopio, anotar la especificación de identidad celular durante la embriogénesis con marcadores específicos y caracterizar el papel de un gen en particular durante la embriogénesis.
Resultados representativos a partir del análisis de patrones (de la etapa de cigoto alargada a la etapa madura del bastón) en el tipo salvaje de Arabidopsis del embrión se muestran en la figura 2. Después de la separación de óvulos, los embriones en diferentes etapas de desarrollo podían distinguirse por microscopia CID (figura 2). El patrón de expresión de GFP DR5 se registró durante la embriogénesis con láser confocal de barrido microscopía (figura 3) para determinar la distribución de la auxina en el embrión y examinar el papel potencial de la auxina durante la embriogénesis en Arabidopsis.
Este protocolo también puede utilizarse para caracterizar el papel de genes específicos durante la embriogénesis. Aquí, el rol de Naa10 durante la embriogénesis en Arabidopsis fue examinado como un ejemplo. División anormal de la hipófisis se observó (División vertical y oblicuamente de la hipófisis en Naa10 en comparación con división asimétrica transversal de la hipófisis en plantas de tipo silvestre, figura 4). La distribución de la auxina en la etapa globular fue casi uniforme en la mayoría de Naa10 de embriones y conserva una señal más amplia en la hipófisis, en comparación con los embriones de tipo salvaje (figura 5). Estos resultados indican que Naa10 se requiere para la embriogénesis, y que podrían estar implicado en la embriogénesis por la auxina señalización camino en Arabidopsis.
Figura 1: Diagrama esquemático de la disección de la silicua de Arabidopsis . (A) la silicua atado en el portaobjetos de cristal que había pegado con un trozo de cinta adhesiva de doble cara. (B) la imagen ampliada de la caja en el A. Las dos líneas imaginarias representan la ubicación a dividirse. (C) la imagen ampliada de la silicua de split en el cuadro D. (D) la imagen de la silicua de split. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Examen de la embriogénesis en Wild-type (Col-0) de Arabidopsis por microscopia CID. Alargados (A) zygote. (B) un embrión de etapa 1-células a 1 UTA. (C) A embriones de etapa 2/4-cell en DAP 2. (D) un embrión de etapa octante 3 DAP. (E) A embriones de etapa de dermatogen en el DAP de 3. DAP (F) un embrión globular etapa 4. (G) un último embrión globular etapa en DAP 5. (H) A embriones de etapa de centro en DAP 6. () Un embrión de la fase de torpedo en DAP 7. (J) un embrión de la etapa de bastón en el DAP 8. Barras de la escala = 10 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: El patrón de expresión de DR5 en embriones de Arabidopsis de tipo salvaje (Col-0). (un - d) señales GFP. (A, D) Imágenes combinadas con imágenes de campo claro. DR5 se expresó en el polo de la raíz de la etapa globular de tipo salvaje (a y A, 4 DAP) y embriones en fase (b y B, DAP 6) corazón. DR5 se expresó también en los consejos de embrionario del cotiledón (c y C, DAP 7) y en la vasculatura de embriones maduros de tipo salvaje (d y D, DAP 8). Barras de escala = 50 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Caracterización del papel de la Naa10 durante la embriogénesis en Arabidopsis. División normal de la hipófisis en una planta de tipo salvaje (A). División anormal de la hipófisis en plantas mutantes Naa10 está marcada con una línea blanca en (B) (División torcida de la hipófisis) y (C) (División vertical de la hipófisis). Barras de la escala = 10 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: El patrón del expresión del DR5 en etapa Globular (Col-0) de tipo salvaje Arabidopsis y embriones Naa10 . (a y b) Señales de la GFP. (A y B) Imágenes combinadas con imágenes de campo claro. DR5 se expresó en el polo de la raíz de un embrión globular etapa de tipo salvaje (una y una). DR5 se expresó casi uniformemente en un embrión de Naa10 etapa globular y conserva la señal más amplio en hipófisis en comparación con el tipo salvaje (b y B). Barras de escala = 50 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Óvulo es un método útil para detectar la división celular y la evaluación de morfología durante la embriogénesis en Arabidopsis; usando esta técnica, embriones pueden ser observados directamente bajo DIC microscopía5,12. El paso crítico para la remoción del óvulo es paso 1.3.4. El tiempo requerido para la remoción del óvulo en el paso 1.3.4 es variable. Embriones en la etapa de 2/4-cell pueden observarse claramente después de 2 h en solución de Hoyer, que parecen indistintos después de 12 h. Así, cuanto más madura un óvulo es, más el tiempo requerido para el despacho.
Paso 2.2.5, para aislar un embrión de un óvulo, la cantidad de fuerza aplicada a la diapositiva es fundamental. Los embriones pueden ser aplastados si se aplica demasiada fuerza; sin embargo, un embrión no puede ser sacar el óvulo si se utiliza muy poca fuerza. En nuestra experiencia, es de un óvulo más maduro, menos fuerza es necesaria. Fase de torpedo y embriones maduros pueden aislarse directamente por peeling abierto un óvulo utilizando una aguja de jeringa. Como algunas de suspensiones de células podrían ser destruido en el embrión aislado durante el proceso de aislamiento, la señal de fluorescencia de las suspensiones puede ser perdido o incompleto. Otra limitación de este método es que los embriones antes de la fase de 4 células eran difíciles de encontrar de los embriones extrusionados ya que son demasiado pequeños y blindado por el fragmento de óvulo.
La etapa de desarrollo y morfología de un embrión pueden ser afectados por la mutación de determinados genes; tales efectos pueden ser demostrados por microscopía tras la separación del óvulo. Este enfoque ayudará a la comprensión del mecanismo molecular que medie embriogénesis de genes específicos5. Observando el patrón de expresión de un gen funcional desconocida -GFP fusion durante la embriogénesis puede proporcionar un vínculo entre el patrón de embrión y la expresión de ese gen y facilitar la identificación de nuevos genes que se requieren para la embriogénesis en Arabidopsis13. Así, el protocolo descrito aquí proporciona un método básico para la caracterización de la embriogénesis en Arabidopsis.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a Dr. Jessica Habashi para la lectura crítica del manuscrito. Agradecemos a Dr. Xianyong Sheng de la centro de la imagen, Facultad de Ciencias de la vida, Capital Normal University (Beijing, China), para realizar la localización de ensayo DR5-GFP . Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Fundación de Ciencias de Gobierno Municipal de Beijing (CIT & TCD20150102) y de la Fundación Nacional de Ciencias naturales de China (31600248).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chloral Hydrate | Sigma | 15307 | |
| Murashige and Skoog Basal Medium | Sigma | M5519 | |
| Phytagel | Sigma | P8169 | |
| Hygromycin | Roche | 10843555001 | |
| Growth chamber | Percival | CU36L5 | |
| Fluorescence microscope | Zeiss Oberkochen | Zeiss Image M2 | camera: AxioCam 506 color |
| Confocal Laser Scanning Microscopy | Zeiss Oberkochen | Zeiss LSM 5 | filters: BP 495 - 555 nm |
| Stereoscope | Zeiss Oberkochen | Axio Zoom V16 | camera: AxioCam MRc5 |
| nutrient-rich soil | KLASMANN, Germany | ||
| 50-mL tube | Corning Inc. | ||
| 1.5-mL tube | Corning Inc. | ||
| 10% sodium hypochlorite solution | Domestic analytical reagent | ||
| sucrose | Domestic analytical reagent | ||
| KOH | Domestic analytical reagent | ||
| glycerol | Domestic analytical reagent | ||
| culture dish | Domestic supplies | ||
| vermiculite | Domestic supplies | ||
| glass slide | Domestic supplies | ||
| syringe needle | Domestic supplies | ||
| fine-tipped tweezers | Domestic supplies | ||
| super clean bench | Domestic equipment |
References
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