Summary
Denne protokol beskriver en metode til at observere embryogenese i Arabidopsis via ovule clearance efterfulgt af inspektion af embryo mønster dannelse under et mikroskop.
Abstract
Grund af deres udvikling meget forudsigelig er Arabidopsis embryoner blevet brugt som en model for studier af morfogenese i planter. Imidlertid tidlig fase plante embryoner er små og indeholder få celler, hvilket gør dem svære at observere og analysere. En metode er beskrevet her for kendetegner mønster dannelse i anlægget embryoner under et mikroskop ved hjælp af model organismen Arabidopsis. Efter afslutning af frisk æganlæg bruger Hoyers løsning, celle nummer i og morfologi af embryoner kunne konstateres, og deres udviklingsstadiet kunne bestemmes af differential interferens kontrast mikroskopi ved hjælp af en 100 X olie fordybelse linse. Desuden blev udtryk for specifikke markør proteiner markeret med grøn fluorescerende proteiner (NGL) overvåget for at anmærke celle identitet specifikation under embryo mønstre af Konfokal laser scanning mikroskopi. Således, denne metode kan bruges at observere mønster dannelse i wild-type plante embryoner på cellulære og molekylære niveau, og at karakterisere rolle af specifikke gener i fosteret mønstret ved at sammenligne mønster dannelse i embryoner fra wild-type planter og embryo-dødbringende mutanter. Metoden kan derfor anvendes til at karakterisere embryogenese i Arabidopsis.
Introduction
Embryogenese er den tidligste begivenhed i højere plante udvikling. En moden embryo formularer fra en zygote gennem celledeling og differentiering under streng genetiske kontrol1,2. Arabidopsis embryoner er en nyttig model til at studere kontrol af morfogenese, fordi rækkefølgen af celledelinger under embryogenese følger et forventet mønster3,4. Men embryonet Arabidopsis indeholdende én til flere celler er for lille til at være observeret og analyseret. Derudover kan mutation af visse gener forårsage embryo dødelighed5, der angiver den centrale rolle i disse gener i embryogenese. Karakterisering af mønster dannelse i fosteret-dødbringende mutanter giver et grundlag for at forstå de molekylære mekanisme, hvorved væsentlige gener regulere embryo udvikling.
En detaljeret metode er beskrevet her til karakterisering af embryo mønster dannelse i model planten Arabidopsis af direkte mikroskopiske observation. Metoden indebærer ovule clearance efterfulgt af mikroskopisk observation af et embryo. Karakterisering af et embryo-dødbringende mutant er også beskrevet.
Morfologi af embryoner på forskellige udviklingsstadier kan bestemmes direkte ved mikroskopi benytter de frøanlæg, der er blevet ryddet hos Hoyers løsning6,7. Disse æganlæg udviser en høj brydningsindeks; således, denne ovule clearing metode er særligt fordelagtigt for enheder, der skal overholdes af differential interferens kontrast (DIC) mikroskopi.
Derudover kan de gener, der er udtrykt i en bestemt celle eller et begrænset antal celler under embryogenese bruges som markører til at identificere cellerne i embryonet. Derfor, den celle identity specifikation under embryogenese kan påtegnes af overvågning udtryk for normal god landbrugspraksis-markeret datamærke proteiner ved hjælp af Konfokal laser scanning mikroskopi. Omvendt, observere udtryk mønster af en ukendt funktionel genet -normal god landbrugspraksis fusion under embryogenese kan give et link mellem embryo mønstre og udtryk for gen, og lette identifikationen af nye gener, der er nødvendige for embryogenese i Arabidopsis.
Metoden beskrevet her kan også bruges til at karakterisere Fænotypen af et embryo-dødbringende mutant og bestemme virkningen af de berørte gen på embryogenese på cellulært niveau. Desuden i kombination med en sammenligning af udtryk mønster af markørgener under embryogenese mellem wild-type og mutant planter, kan vil metoden give fingerpeg om de molekylære mekanismer og signalering veje involveret i embryogenese8,9. Metoden blev anvendt til naa10 planter, og det konstateredes, at de unormale division af hypofysen i muterede kan være forårsaget af en ændring i auxin fordelingen under embryogenese5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bemærk: Denne protokol har tre dele: 1) observere mønster dannelsen i wild-type Arabidopsis embryoner ved hjælp af DIC mikroskopi; 2) karakteriserede af embryoer mønster dannelse via observation af markør protein udtryk ved hjælp af Konfokal laser scanning mikroskopi; og 3) bestemmelse betydning af et specifikt gen i embryogenese (Brug naa10 mutant som et eksempel).
1. ovule Clearing
- Plante materielle forberedelse
Bemærk: Protokollen beskrevet her er et eksempel på hvordan at vokse sunde planter; andre måder at vokse sunde planter også arbejde.- Tilføje 100 frø til en 1,5 mL tube, og derefter tilsættes 1 mL 1,5% natriumhypochlorit (mix 15 mL 10% klor med 85 mL vand) for at sterilisere frøene til 5 min. inverter røret flere gange til at sikre, at frø og løsning er godt blandet til at sterilisere overflade frøene helt.
- Tvinge frøene til bunden af røret ved centrifugering for 30 s på 1.200 x g, Fjern supernatanten, og vask frøene med sterilt vand fire gange på en bænk til at fjerne de resterende natriumhypochlorit.
- Tilføje 4,4 g af Murashige og Skoog (MS) basal salt blanding og 10 g saccharose til 1 L ultrarent vand. Rør blandingen for at opløse Saltene og saccharose. Justere løsningen på pH 5,8 med 1 M KOH, tilsættes 3 g geldannende agent, såsom Phytagel, til MS-rørsukkeropløsning, og sterilisere løsning ved 121 ° C i 15 min at gøre MS medium.
- Hældes 30 mL af MS medium i en 12 cm kultur parabol til at generere MS medium plader.
- Placer de steriliseret frø på MS plade. Overføre pladen til en vækst kammer og holde pladen på længe-dag betingelser (22 ° C til 16 h i lyset og 18 ° C i 8 timer i mørke) efter frø stratificering (3 dage ved 4 ° C i mørke).
- Efter 8 dage af vækst, overføre planterne til jorden (mix næringsrige jord og vermiculit i forholdet 1:1) i en bakke, dække bakken med en hvid, transparent låg i 5 dage for at undgå vandtab og efterlade et tomrum for at undgå forglasning af planterne.
- Tag låget af bakken og dyrke planter i en walk-in kammer under lange-dag betingelser (Se 1.1.5). Tænde lys kl 6:00 og off kl 10:00. Efter ca 20 dage af vækst i walk-in mødesalen, vil planterne har blomstret og produceret siliques.
- Mark blomsterknopper med en tråd på placeringen af frø stilke i Blomsterstanden på 8:00 pm (brug ikke først til de tredje blomsterknopper; en siliques, genereret fra disse blomsterknopper normalt udvikle et par aborterede frø, og dette kan ændre andelen af normal til unormal frøanlæg). Definere begyndelsen af bestøvning af ovule som, når den markerede bud åbner til blomst kl 8:00 den næste morgen.
- Forberedelse af Hoyers løsning
- Tilføj 24 g Kloral hydrat til en 50 mL tube og Pak tube helt med alufolie (løsninger af Kloral hydrat ikke er stabilt under lys).
- Dernæst tilføje 9 mL i ultrarent vand og 3 mL glycerol til ovenstående løsning og ryste rør til at opløse Kloral hydrat. At gøre Hoyers løsning, lad glasset stå natten over ved stuetemperatur til at fjerne eventuelle bobler.
- Ovule adskillelse og regnskabsafslutning
- Fastgør et stykke af dobbeltsidet tape til et objektglas glas. Placer en silique, vokset til det ønskede antal dage efter bestøvning (DAP) på diaset med pseudoseptum vinkelret på overfladen. Dette vil gøre det nemt at opdele frugtblade (tal 1A og 1B).
- Split frugtblade på begge sider af pseudoseptum med en sprøjte nål og knytte de to dissekeret frugtblade til diaset, så frøanlæg i silique er synlige under en Stereoskopet (tal 1 c og 1 D).
- Dispensere 70 µL af Hoyers løsning på glas dias, og derefter fugtes spidsen af et par fine-tippet pincet med Hoyers løsning ved dypning. Brug Stereoskopet, flytte frøanlæg i Hoyers løsning på diaset med pincet til at rense embryoner. Dækglas til forsigtigt at undgå at generere nogen bobler dias.
- Sætte det færdige dias i en boks i et mørkt rum for 2-12 h (de mere modne en ovule er, jo mere tid vil være nødvendig) ved stuetemperatur. Embryoner på 2/4-celle stadium (1-2 DAP) kan observeres mikroskopisk efter 2 h, mens embryoner mellem octant og kugleformede vorden (3 DAP) kan observeres efter 4 h. Mere modne embryoner (4-8 DAP) kan observeres efter 12 timer.
- Undersøge de ryddet æganlæg ved hjælp af funktionen DIC i et mikroskop. Find embryonerne under en energibesparende felt (10 X) og derefter skifte til en high-power felt (100 X olie fordybelse linse) at observere den cellulære mønster i de udviklede embryoner.
- Undersøge embryoner på forskellige udviklingsstadier.
2. karakterisering af Embryo mønstre og celle identitet via Observation af markør Protein udtryk
- Forberedelse af plantematerialer
- Klone initiativtageren og kodende sekvens af elementet markør gen eller hormon reaktion og derefter smelte det med en fluorescerende proteiner (som normal god landbrugspraksis); Indsæt dernæst konstruktionen til den binære vektor (såsom pCambia1300). Her, auxin svar element DR5 er præsenteret som et eksempel10.
- Indføre den deraf følgende DR5-NGL plasmid i wild-type planter af Agrobacterium tumefaciens-medieret transformation11. Vælg T1 planter ved hjælp af MS medium plader der indeholder hygromycin (50 mg/mL af mor spiritus, fortyndet 1:1, 000). De transgene planter vil udstille lange rødder og generere to roset blade efter 8 dage af vækst på betingelser beskrevet i 1.1.5.
- Overføre de transgene planter ned i jorden og dyrke dem, som anført i 1.1.6 og 1.1.7.
- Indsamle T2 frø fra de uafhængige T1 linjer. Så frøene på MS-hygromycin plader, Vælg planter bærer en kopi af DR5-NGL indsættelsen (forholdet mellem resistente planter til sarte planter vil være ca 3:1) og overføre dem til jorden.
- Dyrke T2 planter, som anført i 1.1.6 og 1.1.7.
- Indsamle T3 frø fra T2 planter. Så frøene på MS-hygromycin plader, Vælg de homozygot transgene planter (alle planter fra en enkelt linje vil udstille hygromycin modstand) og overføre dem til jorden.
- Markere homozygot T3 planterne blomsterknopper, som angivet i 1.1.8.
- Normal god landbrugspraksis signal observation
- Bland 3 mL glycerol med 47 mL i ultrarent vand til at generere en 6% glycerol løsning.
- Fastgør et stykke af dobbeltsidet tape til et glas objektglas og lave en silique, som angivet i 1.3.1.
- Split frugtblade på begge sider af pseudoseptum med en sprøjte nål og tillægger dias under en Stereoskopet to dissekeret frugtbladene, som angivet i 1.3.2.
- Give afkald på 30 µL af 6% glycerol diaset glas og placere alle æganlæg fra dissekeret frugtbladene i løsning ved hjælp af fine spids pincet. Placere en coverslip på diaset forsigtigt.
- Som frø frakke og frøhvide i hver ovule kan forhindre observation af normal god landbrugspraksis signaler i embryo, udtrække embryonet fra ovule. Tryk på diasset, hurtigt og forsigtigt at presse embryo fra ovule (de mere modne en ovule er den mindre kraft skal anvendes på diaset).
- Undersøge glideslidsen for normal god landbrugspraksis fluorescens bruger Konfokal laser scanning mikroskopi. Find de isolerede embryoner under en energibesparende felt (10 X) og registrere deres placering, så ændre til en high-power felt (100 X olie fordybelse linse) at observere DR5-NGL udtryk i embryoner ved at indstille excitation lyskilde til 488 nm for påvisning af normal god landbrugspraksis signal.
- Opdage udtrykket normal god landbrugspraksis i embryoner til at vælge den passende T3 linje for yderligere analyse.
3. karakterisering af Embryo mønster dannelse i et Embryo-dødbringende Mutant via Ovule Clearance og markør Protein Observation: Naa10 som eksempel
- Embryo mønstre i naa10 mutant planter
- Forberede plantematerialer som angivet i 1.1.1-1.1.7.
- Identificere naa10+/ − planter ved PCR ved hjælp af gen-specifikke primere5og derefter mark Nielsen10 blomsterknopper+/ − planter som angivet i 1.1.8.
- Udføre ovule clearance og mikroskopisk undersøgelse af Nielsen10+/ − embryoner som angivet i 1.2 og 1.3.
- Markør proteinanalyse ved hjælp af naa10 embryoner
- Få egnede DR5-NGL transgene linjerne ved hjælp af den procedure, der er skitseret i 2.1-2.2.
- Krydse en homozygot DR5-NGL transgene linje med en naa10+/ − plante at få Nielsen10+/ − planter, der er homozygot for normal god landbrugspraksis fluorescens markør på F2-generationen (identificeret ved gen-specifik PCR) til at karakterisere naa10+/ −5 og observere normal god landbrugspraksis signal under et mikroskop ved hjælp af en homozygot DR5-NGL linje.
- Mark Nielsen10 blomsterknopper+/ − planter, der er homozygot for DR5-normal god landbrugspraksis som angivet i 2.1.7.
- Søg efter normal god landbrugspraksis signal i naa10 embryoner, der er homozygot for DR5-normal god landbrugspraksis som angivet i punkt 2.2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Metoden i dette papir kan bruges til at observere embryogenese direkte under et mikroskop, anmærke celle identitet specifikation under embryogenese med specifikke markører og karakterisere et bestemt gen rolle under embryogenese.
Repræsentative resultater fra analysen af embryo mønster (fra den aflange zygote fase til den modne walking stick fase) i wild-type Arabidopsis er vist i figur 2. Efter ovule clearance, kunne embryoner på forskellige udviklingsstadier adskilles af DIC mikroskopi (figur 2). Udtryk mønster af DR5-normal god landbrugspraksis var optaget under embryogenese under Konfokal laser scanning mikroskopi (figur 3) for at fastlægge fordelingen af auxin i embryo og undersøge auxin potentielle rolle under embryogenese i Arabidopsis.
Denne protokol kan også bruges til at karakterisere rollerne af specifikke gener under embryogenese. Her, blev Naa10 rolle under embryogenese i Arabidopsis undersøgt som et eksempel. Unormal opdeling af hypofysen blev observeret (skævt og lodret opdeling af hypofysen i Naa10 sammenlignet med tværgående asymmetriske fordeling af hypofysen i wild-type planter, figur 4). Distribution af auxin i kugleformede scenen var næsten ensartet i de fleste Naa10 embryoner og beholdt en bredere signal i hypofysen, i forhold til vildtype embryoner (figur 5). Disse resultater viser, at Naa10 er nødvendig for embryogenese, og at det kan være involveret i embryogenese via auxin signalering pathway i Arabidopsis.
Figur 1: Skematisk Diagram for dissektion af Arabidopsis Silique. (A) silique fastgjort på glas dias blev indsat med et stykke af dobbeltsidet tape. (B) det forstørrede billede af boksen i A. De to imaginære linjer repræsenteret placering deles. (C) det forstørrede billede af split silique i boksen i D. (D) billedet af split silique. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Undersøgelse af embryogenese i Wild-type (Col-0) Arabidopsis af DIC mikroskopi. (A) Elongated zygote. (B) en 1-celle stadium embryo på 1 DAP. (C) en 2/4-celle stadium embryo på 2 DAP. (D) en octant fase embryo på 3 DAP. (E) A dermatogen fase embryo på 3 DAP. (F) en tidlig kugleformede fase embryo på 4 DAP. (G) A sent kugleformede fase embryo på 5 DAP. (H) A hjerte fase embryo på 6 DAP. (jeg) en torpedo fase embryo på 7 DAP. (J) en walking stick fase embryo på 8 DAP. Skalere barer = 10 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Udtryk mønstret af DR5 i Wild-type (Col-0) Arabidopsis embryoner. (en - d) normal god landbrugspraksis signaler. (A-D) Flettede billeder med lysfelt billeder. DR5 kom til udtryk i rod pol i wild-type kugleformede etape (en og A, 4 DAP) og hjertet fase (b og B, 6 DAP) embryoner. DR5 blev også udtrykt i de embryonale Kimblad tips (c og C, 7 DAP) og i Vaskulaturen af modne vildtype embryoner (d og D, 8 DAP). Skalere barer = 50 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Karakterisering af Naa10 rolle under embryogenese i Arabidopsis. Normale opdeling af hypofysen i et wild-type plante (A). Unormal opdeling af hypofysen i Naa10 mutant planter er markeret med en hvid streg i (B) (skævt division af hypofysen) og (C) (lodret opdeling af hypofysen). Skalere barer = 10 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: De DR5 udtryk mønster i kugleformede fase wild-type (Col-0) Arabidopsis og Naa10 embryoner. (a og b) Normal god landbrugspraksis signaler. (A og B) Flettede billeder med lysfelt billeder. DR5 kom til udtryk i rod pol af et wild-type kugleformede etape embryo (en og A). DR5 var næsten ensartet udtrykt i en kugleformet fase Naa10 embryo og beholdt den bredere signal i hypofysen i forhold til den vilde type (b og B). Skalere barer = 50 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ovule clearance er en nyttig metode til påvisning af celledeling og vurdere morfologi under embryogenese i Arabidopsis; Brug af denne teknik, kan embryoner observeres direkte under DIC mikroskopi5,12. Det afgørende skridt for ovule clearance er trin 1.3.4. Den nødvendige tid til ovule clearance taktfast 1.3.4 er variabel. Embryoner på 2/4-celle stadium kan observeres klart efter 2 h i Hoyers løsning, mens de ser utydelig efter 12 timer. Således, den mere modne en ovule er, jo længere tid for regnskabsafslutning.
Taktfast 2.2.5 for at isolere et embryo fra en ovule, er mængden af kraft, diaset kritisk. Embryoer kan blive knust, hvis for meget kraft er anvendt; dog kan et foster ekstruderes fra ovule, anvendes for lidt kraft. Vores erfaring, jo mere modne en ovule er, de mindre kraft er nødvendig. Torpedo fase og modne embryoner kan være isoleret direkte af peeling åbne en ovule ved hjælp af en sprøjte nål. Da nogle af suspensor celler kan blive ødelagt i isolerede embryo under isolering proces, kan fluorescens signalet fra suspensor være tabt eller ufuldstændige. En anden begrænsning ved denne metode er, at embryoner før 4-celle stadium var vanskeligt at finde fra de ekstruderet embryoner som de er for små og afskærmet af ovule fragment.
Udviklingsstadiet og morfologi af et embryon kan blive påvirket af mutation af visse gener; sådanne virkninger kan påvises ved mikroskopi efter ovule clearance. Denne tilgang vil støtte i forståelsen af den molekylære mekanisme af hvilke specifikke gener mægle embryogenese5. Observere udtryk mønster af en ukendt funktionel genet -normal god landbrugspraksis fusion under embryogenese kan give et link mellem embryo mønstre og udtryk for gen, og lette identifikationen af nye gener, der er nødvendige for embryogenese i Arabidopsis13. Således indeholder protokollen beskrevet her en grundlæggende metode til karakterisering af embryogenese i Arabidopsis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Jessica Habashi for kritisk læsning af manuskriptet. Vi takker Dr. Xianyong Sheng Imaging Center, College of life Sciences, kapital Normal University (Beijing, Kina), til at udføre lokalisering af DR5-NGL assay. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Beijing Municipal regering Science Foundation (CIT & TCD20150102) og fra den National Natural Science Foundation of China (31600248).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chloral Hydrate | Sigma | 15307 | |
| Murashige and Skoog Basal Medium | Sigma | M5519 | |
| Phytagel | Sigma | P8169 | |
| Hygromycin | Roche | 10843555001 | |
| Growth chamber | Percival | CU36L5 | |
| Fluorescence microscope | Zeiss Oberkochen | Zeiss Image M2 | camera: AxioCam 506 color |
| Confocal Laser Scanning Microscopy | Zeiss Oberkochen | Zeiss LSM 5 | filters: BP 495 - 555 nm |
| Stereoscope | Zeiss Oberkochen | Axio Zoom V16 | camera: AxioCam MRc5 |
| nutrient-rich soil | KLASMANN, Germany | ||
| 50-mL tube | Corning Inc. | ||
| 1.5-mL tube | Corning Inc. | ||
| 10% sodium hypochlorite solution | Domestic analytical reagent | ||
| sucrose | Domestic analytical reagent | ||
| KOH | Domestic analytical reagent | ||
| glycerol | Domestic analytical reagent | ||
| culture dish | Domestic supplies | ||
| vermiculite | Domestic supplies | ||
| glass slide | Domestic supplies | ||
| syringe needle | Domestic supplies | ||
| fine-tipped tweezers | Domestic supplies | ||
| super clean bench | Domestic equipment |
References
- Jenik, P. D., Gillmor, C. S., Lukowitz, W.
- Lau, S., Slane, D., Herud, O., Kong, J., Jurgens, G. Early embryogenesis in flowering plants: setting up the basic body pattern. Annu Rev Plant Biol. 63, 483-506 (2012).
- Wendrich, J. R., Weijers, D. The Arabidopsis embryo as a miniature morphogenesis model. New Phytol. 199 (1), 14-25 (2013).
- ten Hove, C. A., Lu, K. J., Weijers, D. Building a plant: cell fate specification in the early Arabidopsis embryo. Development. 142 (3), 420-430 (2015).
- Feng, J., et al. Protein N-terminal acetylation is required for embryogenesis in Arabidopsis. J Exp Bot. 67 (15), 4779-4789 (2016).
- Berleth, T., Jurgens, G. The role of the monopteros gene in organising the basal body region of the Arabidopsis embryo. Development. 118, 575-587 (1993).
- Luo, Y., et al. D-myo-inositol-3-phosphate affects phosphatidylinositol-mediated endomembrane function in Arabidopsis and is essential for auxin-regulated embryogenesis. Plant Cell. 23 (4), 1352-1372 (2011).
- Nodine, M. D., Yadegari, R., Tax, F. E. RPK1 and TOAD2 are two receptor-like kinases redundantly required for Arabidopsis embryonic pattern formation. Dev Cell. 12 (6), 943-956 (2007).
- Ulmasov, T., Murfett, J., Hagen, G., Guilfoyle, T. J. Aux/IAA proteins repress expression of reporter genes containing natural and highly active synthetic auxin response elements. Plant Cell. 9 (11), 1963-1971 (1997).
- Friml, J., et al. Efflux-dependent auxin gradients establish the apical-basal axis of Arabidopsis. Nature. 426 (6963), 147-153 (2003).
- Clough, S. J., Bent, A. F. Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Plant J. 16 (16), 735-743 (1998).
- Fiume, E., Fletcher, J. C. Regulation of Arabidopsis embryo and endosperm development by the polypeptide signaling molecule CLE8. Plant Cell. 24 (3), 1000-1012 (2012).
- Jurkuta, R. J., Kaplinsky, N. J., Spindel, J. E., Barton, M. K. Partitioning the apical domain of the Arabidopsis embryo requires the BOBBER1 NudC domain protein. Plant Cell. 21 (21), 1957-1971 (2009).
