Summary
Иммуногистохимическое окрашивание изоформ тяжелой цепи миозина стала-искусство дискриминатора скелетных мышечных волокон-типа (т.е., I типа, типа IIA, введите IIX, типа IIB). Здесь мы представляем окрашивание протокола наряду с Роман полуавтоматические алгоритм, который способствует быстрой оценки морфологии тип волокна и волокна.
Abstract
Лет различия между типами скелетных мышечных волокон были лучше визуализированы пятнать миозин АТФазы. Совсем недавно иммуногистохимическое окрашивание изоформ миозин тяжелой цепи (MyHC) стала тоньше дискриминатора волоконно-типа. Тип I, IIA, введите IIX и тип IIB волокна теперь могут быть определены с точностью на основе их MyHC профиля; Однако, ручной анализ этих данных может быть медленным и вниз вправо утомительно. В этой связи Быстрая, точная оценка волоконно тип композиции и морфология является весьма желательным инструментом. Здесь мы представляем протокол-искусство иммуногистохимическое окрашивание MyHCs в Замороженные разделы, полученные от мыши задних конечностей мышцы в концерте с Роман полуавтоматические алгоритм, который ускоряет анализ морфологии тип волокна и волокна. Как и ожидалось, камбаловидной мышце отображается пятная для типа I и типа IIA волокна, но не для типа IIX или типа IIB волокон. С другой стороны мышцы передней tibialis состояла преимущественно из типа IIX и тип IIB волокон, небольшая часть волокон типа IIA и мало или вообще не типа волокна. Несколько преобразований изображения были использованы для составления карт вероятностей для измерения различных аспектов волокна морфологии (т.е., площадь поперечного сечения (CSA), максимальный и минимальный диаметр Ферэ). Значения, полученные для эти параметры были затем по сравнению с вручную полученных значений. Были замечены никаких существенных различий между либо режим анализа отношении CSA, максимальное или минимальное Ферэ диаметр (все p > 0,05), указывающее точность нашего метода. Таким образом протокол анализа наши иммуноокрашивания могут применяться к исследованию воздействия на мышцы состава во многих моделях старения и миопатии.
Introduction
Он был известен на некоторое время, что скелетных мышц состоит из одного волокна многих типов1. Первоначально, две группы волокон были охарактеризованы на основе их сократительных свойств и с именем, соответствующим образом, медленно дергаться (тип I) и быстро дергаться (тип II). Далее, эти категории были отделены на основе волокна метаболизма. С тех пор типа волокна богаты в митохондриях и зависят от окислительного метаболизма, они были раскрыты устойчиво положительных Никотинамидадениндинуклеотид tetrazolium редуктаза (NADH-TR) диафоразы2 или сукцината дегидрогеназа (SDH)3 пятнать. Наоборот, тип II волокна выставлены меньшей и переменных степеней NADH-TR диафоразы или SDH окрашивание и были разделены на две подгруппы быстро дергаться (тип IIA и IIB типа) несколько грубо на основе их относительных окислительного потенциала. Эти различия между волокнами была визуализирована более эффективно путем пятнать миозин АТФазы где типа волокна пятно темно после предварительной инкубации при pH 4.0 и тип IIB волокна поглощают осадок следующим предварительной инкубации при рН 10,0 волокнами типа IIA пятнать промежуточно4.
Совсем недавно иммуногистохимическое окрашивание изоформ миозин тяжелой цепи (MyHC) стала тоньше дискриминатора волоконно тип5. Тип I, тип IIA и IIB типа волокна могут быть все определены с точностью на основе их MyHC профиля. Кроме того другой тип быстро дергаться метаболически промежуточные волокна, тип IIX, были определены6. Гибридные волокон, выражая более чем одного MyHC были также подтверждено5,,78. Некоторые виды, такие как кошка и павиан известны не Экспресс тип IIB MyHCs6. Несмотря на то, что MyHC иммуноокрашивания в настоящее время состояние искусства оценки состава мышц, анализ данных, полученных через этот метод является громоздким и длительным без автоматизированной помощи. С этой целью горсть полу автоматизированных методов для анализа этих данных были развитые5,9,10. Здесь мы представляем относительно стандартный протокол для идентификации иммуногистохимических мышечных волокон типа5,,78,10, вместе с полуавтоматическим Роман алгоритм, который ускоряет анализ морфологии тип волокна и волокна с точностью.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
все процедуры, связанные с мышей были утверждены университета Колорадо-Anschutz медицинской кампуса помощи для институционального животных и использования Комитетом (91813(05)1D).
1. день 1: начального (1°) иммуноокрашивания с бычьим сывороточным альбумином (БСА) блокирование
- воздушно-сухой Замороженные разделы мыши задних конечностей мышцы (например, tibialis anterior, камбаловидной) смонтированы на заряженных слайды для ~ 30 мин 11. нарисовать границу вокруг разделов с помощью пера Пап гидрофобный барьер.
- Место ~ 250 мкл 5% BSA/фосфатный буфер (BSA/PBS) на каждый слайд, чтобы блокировать неспецифической антитела связывая. Инкубируйте слайды при комнатной температуре в течение 1 ч.
- Блокирует, готовят 1:50 разведениях 1° антитела супернатант в 5% BSA/PBS (все являются мышиных моноклональных антител; см. таблицу 1 6 , 12) подготовить 250 мкл решение каждого слайда. Держите 1° антитела запасов и разведения на ice.
Таблица 1: первичного антитела, которые используются для отличить MyHCs.
- после аспирации блокировки раствор 5% BSA/PBS, добавить 250 мкл антител разбавления 1° в соответствующие слайды. Добавить 250 мкл 5% BSA/PBS для средних (2°) антител только отрицательный контроль слайды.
- Инкубировать на 4 ° C в течение 24-48 ч в влажной среде.
Примечание: Петри в алюминиевой фольги с смоченной фильтровальная бумага может служить подходящим инкубации камеры.
2. День 2:2 ° иммуноокрашивания с флуоресцентных антител
- аспирационная раствор антител 1°, или 5% BSA/PBS решение управления. Вымойте все слайды в три раза, 10 мин с 5% BSA.
- Время стирки, готовят разведения 1: 200 очищенный, конъюгированных Флюорофор 2 ° антител в 5% BSA/PBS (см. таблицы 2, все козы анти мыши). Подготовка 250 мкл раствора на слайд. Держать 2° Флюорофор конъюгированных антител в темноте на льду
Таблица 2: Флюорофор конъюгированных вторичные антитела используются для визуализации первичного антитела признание от MyHCs.
- после аспирации третьего приложения 5% BSA/PBS блокирования решения, добавьте 250 мкл 2° разбавления антитела ко всем слайдам. Инкубируйте 90 мин при комнатной температуре в темной и влажной среде.
- Раствор антител аспирата 2°. Вымойте все слайды в три раза, 10 мин с 5% BSA/PBS.
- Полоскание с PBS. Сухой для 10 мин
- Горы coverglass с средой непостоянных, низкой вязкость водной монтажа.
- Когда сух, уплотнение края слайд с ногтей. Высушить и хранить в темной slidebox.
3. Обработка изображений слайдов с помощью эпифлуоресцентного
- очистить слайды с небольшой, 70% этанола, пропитанной лаборатории оботрите.
- Цифровых изображений получить immunostained мышцы разделов с помощью эпифлуоресцентного микроскопа с Фотографический аппарат (см. Таблицу материалов).
- Выберите область примерно 1 мм 2 (10 X цель, 1.4 NA).
- Просмотр Alexa 488-конъюгированных 2° флуоресцентным антитела через 505 нм Лонг-фильтр. Просмотр флуоресценции, порожденных возбуждения Alexa 594-конъюгированных 2° антител через фильтр Лонг перевал 595 Нм. Оцифровки изображения с PC компьютер, оснащенный совместимый изображений программное обеспечение. Включают в себя линейку из обработки изображений программное обеспечение для последующего анализа.
4. Анализ изображений с Фиджи
Примечание: прежде чем продолжить с анализом, Фиджи (доступна свободно от национальных институтов здравоохранения, Бетесда, MD) должен быть установлен через https://imagej.net/Fiji/Downloads. Кроме того макрос, используемый в этом процессе предоставляется в Дополнительный файл. Поместите файл макроса в легко доступной директории.
- Нагрузки brightfield изображение выбранного раздела в Фиджи. Перейдите к плагины → сегментации → сегментации обучаемая Weka.
- Целях предусматривается области сотовой секции, рисовать линии на волокна и нажмите кнопку " добавить в класс 1 ". Затем, нарисуйте линию на пространство между волокнами и нажмите кнопку " добавить к классу 2 " в ознаменование внеклеточных доменов. Повторяйте до тех пор, пока есть 5-10 метки в каждом классе.
- Нажмите поезд классификатора. В результате наложения красный и зеленый, добавить больше меток вручную (см. шаг 4.2) неправильно сегментирована части изображения, если необходимо. Повторяйте до тех пор, пока волокон (красный) надлежащим образом отделены от пространство между волокнами (зелёный).
- Нажмите " получить вероятность " и сохранить изображение в недавно помеченной папке.
- Повторите описанную выше процедуру (шаги 4.2-4.3) с флуоресцентные изображение взято из того же поля. Метка immunostained волокна как " 1 класса " и все не люминесцентные регионы как " класса 2 ". Сохранить полученный вероятность карту в ту же папку, где хранится образ обработанные brightfield.
- Открыть один из ранее сохраненные вероятности карт в Фиджи. Рисование прямой линии на панели шкалы, предоставляемый изображений программное обеспечение. Перейти к анализу → задать масштаб. Изменить параметры (то есть, известный расстояние, единица длины) в их соответствующие значения как предоставленные линейки шкалы, а затем проверить " глобального " поле на шкале для каждого изображения.
- Перейдите к плагины → макросы → запустить → Тьяги et al. волокна количественной оценки macro.ijm (см. Дополнительный файл). Сразу же появится на панели навигации. Откройте изображение ' s принимающей папки; появится диалоговое окно. Для каждого диалогового окна, измените " фон " значение dropdown " света. "
Примечание: папка теперь будет заполняться с изображениями волокна контуры и файлы программного обеспечения таблицы результатов (диаметр CSA и Ферэ самое непосредственное отношение к количественное определение морфологии волокна; измеряемых параметров может быть скорректирована в анализировать набор измерений). Волокно морфология данных, генерируемых поры анализ функции Фиджи будут автоматически переведены в таблицу файлы программного обеспечения для обоих флуоресцентные и светлые области изображения. - Вычислить долю волокна, выражая данной MyHC в поле, разделив количество флуоресцентные волокна в поле количество всего волокон в соответствующие светлые области изображения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Задних конечностей мышцы (то есть, tibialis anterior, камбаловидной), расчлененный от мужчины C57BL/6 мыши неизвестного возраста были флэш-замороженные путем тонуть пластиковые формы, содержащие мышцы в OCT смеси в жидкий азот охлажденный изопентана. Затем с помощью cryotome, 8-10 мкм серийный разделы были вырезать при-20 ° C и переданы различные стекла положительно заряженных слайды12.
Мы выбрали tibialis передней и камбаловидной, потому что эти мышцы состоят преимущественно из быстро и медленно сокращающиеся волокна, соответственно13,14. После иммуногистохимическое окрашивание для индивидуального типа I, IIA, IIX и IIB MyHCs, brightfield и флуоресцентных изображений были захвачены в плен. Левой панели Рисунок 1 Показать разделы immunostained мышц камбаловидной типа I, IIA, IIX и IIB MyHC специфические антитела, перечисленных в таблице 1.
Рисунок 1 : Иммуногистохимическое окрашивание MyHC типа I, IIA, IIX и IIB в мыши камбаловидной мышце. Левой панели показывают флуоресцентных изображений, полученных с участков мышц камбаловидной мыши, исследовали с первичного антитела, направленные типа I (BA-F8; A), тип IIA (SC-71; B), введите IIX (6 H 1; C) и тип IIB (BF-F3; D) MyHCs. Правой панели показывают разделы, в которых первичного антитела, используемые в эксперименте, изображенные в левой панели соответствующий был опущен. Бары = 100 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
В частности мы наблюдали существенной доли волокон, выражая тип I (рис. 1А, слева) и типа IIA MyHCs (рис. 1Б, слева) с изрядное количество оставшихся волокон, отображение положительный пятнать для типа IIX MyHCs (рис. 1C, слева). Напротив практически не тип IIB волокна были очевидны (рис. 1D, слева). Эти наблюдения согласуются с предыдущими докладами, которые мышц камбаловидной состоит главным образом из типа I, тип IIA и тип волокна IIX (менее так) с почти нет типа IIB волокон5,10,12. Важно отметить, что без пятнать было отмечено в разделах, в которых основное антитело было исключено из протокола, демонстрируя Специфичность антител (рис. 1А-D, правой панели).
Рисунок 2 : Иммуногистохимическое окрашивание MyHC тип IIB, IIX, Ива и я в мышцах передней tibialis мышь. Левой панели показывают флуоресцентных изображений, полученных от секции мышцы передней tibialis мыши исследован с первичных антител для типа IIB (A), введите IIX (B), типа IIA (C) и типа (D) MyHCs. Правой панели показывают разделы, в которых первичного антитела, используемые в эксперименте, изображенные в левой панели рядом был опущен. Бары = 100 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Мы также витражи tibialis передней мышцы с вышеупомянутым антител. Мышцы передней Tibialis были состоит в основном из типа IIB и тип IIX MyHC позитивных волокон (рис. 2A-B, левой панели) с небольших взносов от волокна, выражая типа IIA MyHCs (рис. 2C, слева); практически не волокон, выражая типа я MyHC были замечены (Рисунок 2D, слева). Наши данные, указав, что мышь tibialis передней преимущественно состоит из быстро сокращающиеся типа IIA, IIB типа и типа IIX волокна согласуются с более ранних исследований5,10,13. Опять же не пятнать было отмечено в разделах, в которых основное антитело было исключено из протокола (рис. 2A-D, правый панелей).
Рисунок 3 : Итерированных компьютеризированной волокна сегментации. Brightfield изображение мыши tibialis передней секции (A). Преобразование этого же изображения с помощью полуавтоматического алгоритма (B). Флуоресцентный изображение того же раздела показаны иммуноокрашивания типа IIA MyHC (C). Преобразование изображения показаны только типа IIA MyHC-выражая волокон (D). Бары = 100 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Для целей анализа морфометрических также были получены изображения brightfield immunostained полей. Пример, показанный на рисунке 3A — из tibialis мышц передней секции исследовали с SC-71 антител для типа IIA MyHCs13. Используя наши оригинальные полуавтоматические алгоритм, несколько преобразований изображения были использованы для создания карт вероятностей от brightfield изображения. Типичный образ преобразования, производный от brightfield изображения, показанный на рисунке 3A представлена на рисунке 3B. Использование преобразования и функцию анализа поры Фиджи, мы измерили средний CSA (891.4 ± 45,0 мкм2), максимум (46.9 ± 1,3 мкм) и минимального (26,0 ± 0,8 мкм) означает Ферэ диаметров каждого волокна в области. Чтобы проверить верность наших измерений, мы также оценили эти параметры в brightfield изображения вручную. Средняя CSA (867.0 ± 52,0 мкм2), максимум (45.7 ± 3,5 мкм) и минимальной (25.6 ± 1,9 мкм) означает Ферэ диаметров, полученные с помощью метода более утомительной ручной приобретение не были значительно отличается от метода полуавтоматические (все p > 0,05, непарные t-тесты; Таблица 3).
= "/ files/ftp_upload/56024/56024table3.jpg» / >
Таблица 3: морфология волокна и состав tibialis мышц передней immunostained для типа I, IIA, IIB и IIX MyHCs определяется ручной и полуавтоматической аналитических методов. Означать волокна CSA, означает Ферэ диаметров и MyHC типа в мыши tibialis передней количественно через традиционной ручной оценки по сравнению с представленной алгоритм. Пожалуйста, обратите внимание, что комбинированные фракций превышает значение 1 из-за наличия волокон, выражая более чем один тип MyHC.
Рисунок 3 C показывает флуоресцентные образ же поле immunostained с антителами, направленных типа IIA MyHCs. Положительно окрашенных волокон в области были отобраны по номеру (рис. 3D) и используется для определения доли волокон типа IIA MyHC-выражая путем деления на общее количество волокон в области трансформации brightfield (в таблице 3 ). Средний CSA, максимальные и минимальные диаметры Ферэ типа IIA волокон были затем оценены (Таблица 3). Доля типа я, типа IIX и тип IIB волокна, а также их размеры, были определены, повторив этот протокол в последовательных секций immunostained с ба-F8, 6H 1 и BF-F3 антител, соответственно6,12(Таблица 4 ; Рисунок 4 A-D).
Таблица 4: MyHC содержание и морфология в камбаловидной мыши и передней tibialis. Волокно тип композиции представительных слоев камбаловидной и tibialis передней. Количественная оценка среднего CSA, минимальный и максимальный диаметры Ферэ тип, тип IIA, введите IIX и показаны тип IIB в камбаловидной и tibialis передней. Данные представлены как средние ±SEM.
Мы также оценили эти параметры в поле, полученные из мышц камбаловидной (Таблица 4; Рисунок 4 A-D). 3052 и 2,876 отдельные волокна были подсчитаны для tibialis передней и мышц камбаловидной, соответственно. Взятые вместе, эти данные продемонстрировать возможности нашего метода тип волокна и морфометрического анализа.
Рисунок 4 : Сводные данные анализа морфометрических. Тип волокна композиции представительных слоев tibialis передней и мышц камбаловидной (A). Количественная оценка среднего CSA, минимальная и максимальная Ферэ диаметров типа I, тип IIA, тип IIX и тип IIB fivers в tibialis anteriort и камбаловидной приведены в (B-D). Данные представлены как означает ±SEM. существенные различия между tibialis передней и указаны камбаловидной (* обозначает p < 0,05: ** обозначает p < 0,01; *** обозначает p < 0,005; t тест). 3052 и 2,876 отдельные волокна были подсчитаны для tibialis передней и мышц камбаловидной, соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Дополнительный файл: волокно количественного определения макроса. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы предоставили полезные направления для идентификации типов скелетных мышечных волокон. Поступая таким образом, мы опишем новый алгоритм для анализа данных.
Так как наши результаты во многом подтверждают те из предыдущих докладах5,8,10 и отражают наши собственные ручных измерений, алгоритм, как представляется, быть точным. Тем не менее мы столкнулись некоторые редкие экспериментальной ловушки, включая границы неясной волокна, результате секционирование артефакт. Влияние эти артефакты можно минимизировать путем тщательного секционирование и бдительность экспертизы обработанной секции до анализа. В частности менее чем оптимальной сегментации изображений могут быть обойдены через несколько раундов реклассификации на то же изображение для достижения более резким контрастом.
Наиболее важным в нашей протокол является step 4.2, в которой мы предусматривают области клеточной и внеклеточной секции путем рисования линии на данной волокна, тем самым отличительный «класс 1» или «класс 2"области. Очевидно это ручной различие имеет решающее значение, потому что он определяет границы мышечных волокон; Ошибка в этом шаге отрицательно скажется на оценки аспектов волокна.
В этом исследовании мы исследовали разделы для только одной MyHC в данной секции серийный. Однако некоторые волокон, таких, как гибридные волокон, Экспресс два типа MyHC, свидетельствует о перекрывающихся метаболических/функциональные профили (например, типа IIX и типа IIB). Таким образом, фракций волоконно типа суммируются в значение > 1 для камбаловидной и tibialis переднего (рис. 4A). Гибридные волокна могут быть идентифицированы с двойной-, или даже тройной-, маркировки протоколы, такие, как описанные в Lee et al. 7и Bloemberg и Римский5, соответственно. Важно отметить, что наш метод анализа может применяться для этих более сложных пятная протоколы. Еще одним ограничением нашего протокола является то, что не полностью автоматический; Однако мы считаем, что это незначительные Концессия гарантирует, что наш метод не компромисс строгости ради скорости.
Хотя композиции MyHC передней мышц камбаловидной и tibialis в этом исследовании, отражают результаты предыдущих исследований5,6,7,10,14 , есть некоторые контрастирует с более ранних исследований, касающихся оценки CSA. Например наши измерения среднего CSA несколько меньше, чем те, которые сообщили Bloemberg и Римский5 и Аллен и др. 15 в частности, наши измерения CSA варьировались от 539.86 ± 24,44 мкм2 1319.50 ± 57.47 мкм2 разных типов волокна во время их охватывала примерно 735.7 ± 31.2 мкм2 3073.8 ± 51.3 мкм2. Однако наши ценности больше напоминают те, отмеченные Аугусто et al. 13 и Лукас и др. 6 , который сообщил средняя СВГ, начиная от 436 ± 605 мкм2 2404 ± 412.5 мкм2 и 815 ± 221 мкм2 до 1904 ± 570 мкм2, соответственно. Таким образом некоторые изменчивость морфометрический анализ мыши задних конечностей волокон существует по литературе.
Иммуногистохимия представляет эффективный способ для обозначения и классификации мышечных волокон на основе их MyHC содержание. Точная количественная оценка иммуногистохимических экспериментов необходимо сделать достоверные выводы о данных; с этой целью метод, который можно автоматизировать утомительные части анализа является полезной, особенно, когда сотни или даже тысячи, волокна должны быть измерены и классифицированы. Помимо измерения похож на ручной наблюдений, наш алгоритм обеспечивает точную оценку этих данных без предвзятости; Это преимущество над ручного измерения обеспечивает научной строгости. В этой связи наша методология может быть полезным в характеризации последствий генетических и экспериментальных манипуляций, влияющих мышц целостности. В частности, MyHC иммуногистохимии, в сочетании с нашим методом быстрого анализа могут быть использованы для оценить морфологические и метаболических изменений в мышечной болезни моделей, таких как мышечная дистрофия, ALS и рака кахексии. Кроме того могут также оценить эффективность вмешательств, которые предотвращения атрофии или вызвать гипертрофия.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы имеют не конфликтующие интересы раскрыть.
Acknowledgments
Мы благодарны Фонду Бйотхер и Ассоциация боковой амиотрофический склероз (#17-II-344) за их поддержку этого исследования.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9418-100G | 5% in PBS |
| Hydrophobic Barrier Pap Pen | Scientific Device Laboratory | 9804-02 | |
| Microscope Slides | Globe Scientific | 1358W | |
| Coverglass | Fisher Scientific | 12-544-E | |
| Immumount | Thermo Scientific | 9990402 | |
| Nail Polish | L'Oreal | ||
| Nikon Eclipse TE-200 Inverted Fluorescence and Brightfield Microscope | Discontinued | ||
| SPOT RT/KE | SPOT Imaging Solutions | RT940 | |
| Dell Optiplex | |||
| BA-F8 Primary Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa | monoclonal mouse IgG2b; 1:50 | |
| SC-71 Primary Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa | monclonal mouse IgG1; 1:50 | |
| BF-F3 Primary Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa | monoclonal mouse IgGM; 1:50 | |
| 6H1 Primary Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa | monoclonal mouse IgGM; 1:50 | |
| Alexa Fluor 594 anti-IgG2b | Invitrogen | A21145 | goat anti-mouse; 1:200 |
| Alexa Fluor 488 anti-IgG1 | Invitrogen | A21121 | goat anti-mouse;1:200 |
| Alexa Fluor 594 anti-IgGM | Invitrogen | A21044 | goat anti-mouse;1:200 |
| OCT | Sakura Finetek | 4583 | |
| isopentane | Fisher Scientific | O3551-4 | cool with liguid nitrogen |
| PBS | Fisher Bioreagents | BP665-1 | 10x, dilute to 1x |
| Kim wipes | Kimberly-Clark | 06-666A |
References
- Engel, W. K. The essentiality of histo- and cytochemical studies of skeletal muscle in the investigation of neuromuscular disease. Neurol. 12, 778-784 (1962).
- Dobrowolny, G., et al. Skeletal muscle is a primary target of SOD1G93A-mediated toxicity. Cell Metab. 8, 425-436 (2008).
- Sultana, N., et al. Restricting calcium currents is required for correct fiber type specification in skeletal muscle. Development. 143 (9), 1547-1559 (2016).
- Guth, L., Samaha, F. J. Procedure for the histochemical demonstration of actomyosin ATPase. Exp Neurol. 28 (2), 365-367 (1970).
- Bloemberg, D., Quadrilatero, J. Rapid determination of myosin heavy chain expression in rat, mouse, and human skeletal muscle using multicolor immunofluorescence analysis. PLoS One. 7 (4), (2012).
- Lucas, C. A., Kang, L. H., Hoh, J. F. Monospecific antibodies against the three mammalian fast limb myosin heavy chains. Biochem Biophys Res Commun. 272 (1), 303-308 (2000).
- Lee, C. S., et al. Ca2+ permeation and/or binding to Cav1.1 fine-tunes skeletal muscle Ca2+ signaling to sustain muscle function. Skelet Muscle. 5 (4), (2015).
- Sawano, S., et al. A one-step immunostaining method to visualize rodent muscle fiber type within a single specimen. PLoS One. 11 (11), (2016).
- Meunier, B., Picard, B., Astruc, T., Labas, R. Development of image analysis tool for the classification of muscle fibre type using immunohistochemical staining. Histochem Cell Biol. 134 (3), 307-317 (2010).
- Kammoun, M., Casser-Malek, I., Meunier, B., Picard, B. A simplified immunohistochemical classification of skeletal muscle fibres in mouse. Eur J Histochem. 58 (2), 2254 (2014).
- Kumar, A., Accorsi, A., Rhee, Y., Girgenrath, M. Do's and don'ts in the preparation of muscle cryosections for histological analysis. J Vis Exp. (99), (2015).
- Schiaffino, S., et al. Three myosin heavy chain isoforms in type 2 skeletal muscle fibres. J Muscle Res Cell Motil. 10 (197), (1989).
- Augusto, V., Padovani, C. R., Campos, G. E. R. Skeletal muscle fiber types in C57Bl6j mice. Braz J Morphol Sci. 21 (2), 89-94 (2004).
- Schiaffino, S., Reggiani, C. Fiber types in mammalian skeletal muscles. Physiol Rev. 91 (4), 1447-1531 (2011).
- Allen, D. L., Harrison, B. C., Maass, A., Bell, M. L., Byrnes, W. C., Leinwand, L. A. Cardiac and skeletal muscle adaptations to voluntary wheel running in the mouse. J Appl Physiol. 90 (5), 1900-1908 (2001).
