Summary
Marquage immunohistochimique des isoformes de la chaîne lourde de myosine a émergé comme le discriminant de l’état-of-the-art des fibres musculaires squelettiques de type (c'est-à-direde type I, type IIA, tapez IIX, type IIB). Nous présentons ici un protocole de coloration avec un nouvel algorithme semi automatisé qui facilite l’évaluation rapide de la morphologie de type fibre et fibre.
Abstract
Pendant des années, distinctions entre les types de fibres musculaires squelettiques ont été mieux visualisées par la souillure de la myosine-ATPase. Plus récemment, la coloration immunohistochimique des isoformes de myosine lourde chaîne (chaîne) a émergé comme un discriminateur plus fin des fibres de type. De type I, type IIA, le type IIX et de fibres de type IIB peuvent être identifiés avec précision selon leur profil de chaîne ; Cependant, l’analyse manuelle de ces données peut être lent et bas-droite fastidieux. À cet égard, une évaluation rapide et précise de la composition de la fibre de type et de la morphologie est un outil très souhaitable. Nous présentons ici un protocole pour une coloration immunohistochimique de l’état-of-the-art de chaînes lourdes de myosine dans les coupes congelées provenant du muscle du membre postérieur souris en concert avec un nouvel algorithme semi-automatisé qui accélère l’analyse de la morphologie de type fibre et fibre. Comme prévu, le muscle soléaire affiche une coloration pour type I et type fibres IIA, mais pas pour les fibres de type IIX ou type IIB. En revanche, le muscle jambier antérieur était essentiellement composé de fibres IIB type IIX et le type, une petite fraction des fibres de type IIA et peu ou pas fibres de type I. Plusieurs transformations d’image ont été utilisées pour générer des cartes de probabilité dans le but de mesurer les différents aspects de la morphologie de la fibre (c.-à-d., section transversale (CSA), diamètre de Feret maximal et minimal). Les valeurs obtenues pour ces paramètres ont ensuite été comparées avec les valeurs obtenues manuellement. Pas de différences significatives ont été observées entre deux modes d’analyse en ce qui concerne les CSA, maximal ou minimal diamètre Feret (tous p > 0,05), indiquant la précision de notre méthode. Ainsi, notre protocole d’analyse immuno-coloration peut être appliquée à l’étude des effets sur la composition de muscle dans de nombreux modèles de vieillissement et de la myopathie.
Introduction
On sait depuis longtemps que le muscle squelettique est composé de fibres isolées de nombreux types1. Au départ, deux groupes de fibres ont été caractérisées selon leurs propriétés contractiles et nommé, convenablement, contraction lente (type I) et rapides (type II). Ces catégories sont distinguent encore sur la base du métabolisme de la fibre. Depuis de type I fibres sont riches en mitochondries et tributaire de métabolisme oxydatif, ils ont été élucidées par robustement positive nicotinamide adénine dinucléotide-tétrazolium réductase (NADH-TR) diaphorase2 ou succinate déshydrogénase (SDH)3 la coloration. En revanche, les fibres de type II exposé moindre et des degrés variables de TR-NADH diaphorase ou SDH coloration et ont été divisés en deux sous-groupes de contraction rapide (types IIA et IIB) un peu grossièrement basée sur leur capacité oxydative relative. Ces distinctions entre les fibres ont été visualisées plus efficacement par la myosine-ATPase coloration où de type I fibres tachent sombres après une pré incubation à pH 4,0 et absorbent les fibres de type IIB précipitée après incubation préalable à pH 10,0 avec des fibres de type IIA la coloration moyennement4.
Plus récemment, la coloration immunohistochimique des isoformes de myosine lourde chaîne (chaîne) a émergé comme un discriminateur plus fin des fibres de type5. De type I, type IIA et les fibres de type IIB peuvent être tous identifiés avec précision selon leur profil de chaîne. En outre, un autre type de contraction rapide métaboliquement intermédiaire fibre, tapez IIX, a été identifié6. Les fibres hybrides exprimant plus d’une chaîne ont également été confirmés5,7,8. Certaines espèces comme le chat et le babouin n’est pas connues de myosine de Type IIB express6. Si la chaîne immunostaining est actuellement à l’évaluation de l’état-of-the-art de la composition du muscle, l’analyse des données obtenues par l’intermédiaire de cette technique est lourd et fastidieux sans aide automatisée. À cette fin, une poignée de méthodes semi-automatisé pour analyser ces données ont été développés5,9,10. Nous présentons ici un protocole relativement standard pour l’identification immunohistochimique des fibres musculaires de type5,7,8,10, avec un roman semi-automatisé algorithme qui accélère l’analyse de la morphologie de type fibre et fibre avec précision.
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Protocol
toutes les procédures impliquant des souris ont été approuvés par l’Université du Colorado-Anschutz médicale Campus institutionnels et animalier Comité d’urbanisme (91813(05)1D).
1. jour 1 : primaires (1°) immunomarquage avec blocage Bovine Serum Albumin (BSA)
- sechage coupes congelées de muscle du membre postérieur de la souris (par exemple, jambier antérieur, muscle soléaire) montés sur des diapositives chargées pour ~ 30 min 11. dessiner une bordure autour les sections à l’aide d’un stylo PAP barrière hydrophobe.
- Place ~ 250 µL de solution saline tamponnée au phosphate/BSA 5 % (BSA/PBS) sur chaque diapositive pour bloquer la liaison de l’anticorps non spécifiques. Incuber les lames à température ambiante pendant 1 h.
- Tout en bloquant, préparer à 01:50 les dilutions de l’anticorps 1 ° surnageant dans 5 % BSA/PBS (tous sont des anticorps monoclonaux de souris ; voir tableau 1 6 , 12) préparer 250 µL de solution par diapositive. Garder des stocks d’anticorps de 1° et des dilutions sur Ice.
tableau 1 : anticorps primaires utilisés pour distinguer les chaînes lourdes de myosine.
- suite à l’aspiration de la solution de saturation 5 % BSA/PBS, ajouter 250 µL de dilution de 1° anticorps aux diapositives appropriés. Ajouter 250 µL de 5 % BSA/PBS au secondaire (2°) anticorps seule témoin négatif glisse.
- Incuber à 4 ° C pendant 24 à 48 heures dans une atmosphère humide.
Remarque : Une boîte de Pétri couvert de papier d’aluminium avec du papier filtre imbibé peut servir une chambre d’incubation approprié.
2. Jour 2:2 ° immunohistochimie avec des anticorps fluorescents
- aspirer la solution d’anticorps 1° ou 5 % BSA/PBS solution de contrôle. Lavez tout glisse trois fois, 10 min avec 5 % de BSA.
- Tout laver, préparer des dilutions de 1 : 200 des anticorps purifiés, conjugué à un fluorophore 2 ° 5 % BSA/PBS (voir tableau 2, tous sont chèvre anti-souris). Préparez 250 µL de solution par diapositive. Garder les anticorps conjugué à un fluorophore 2° dans l’obscurité sur la glace
tableau 2 : anticorps secondaire conjugué à un Fluorophore utilisé pour visualiser les principaux anticorps reconnaissance de chaînes lourdes de myosine.
- suite à l’aspiration de la troisième demande de solution de saturation 5 % BSA/PBS, ajouter 250 µL de dilution d’anticorps de 2° à toutes les diapositives. Incuber pendant 90 min à température ambiante dans un environnement sombre et humide.
- Solution d’anticorps obtenus par aspiration 2°. Lavez tout glisse trois fois, 10 min avec 5 % BSA/PBS.
- Rinçage avec du PBS. Sécher pendant 10 min.
- Monter la lamelle avec un milieu de montage aqueux non permanents, de faible viscosité.
- Une fois sec, sceller les bords de la diapositive avec vernis à ongles. Sécher et mettre dans un sombre slidebox.
3. Imagerie des diapositives avec la microscopie à épifluorescence
- nettoyer les lames avec une petit, 70 % éthanol imbibé lab-lingette.
- Obtenir des images numériques des sections de muscle d’immunomarquage à l’aide d’un microscope à épifluorescence équipé d’un appareil photographique (voir la Table des matières).
- Sélectionnez une zone d’environ 1 mm 2 (objectif 10 X, NA 1,4). Filtre
- vue fluorescence anticorps conjugué Alexa 488 2° via une 505 nm long-pass. Découvre la fluorescence générée par l’excitation des anticorps conjugué Alexa 594 2° via un filtre de passe longue 595 nm. Numériser des images avec un ordinateur PC équipé d’un logiciel d’imagerie compatible. Inclure l’échelle graphique du logiciel pour une analyse ultérieure d’imagerie.
4. Analyse d’Images avec les îles Fidji
Remarque : avant de procéder à l’analyse, les Fidji (disponible gratuitement sur le National Institutes of Health, Bethesda, MD) doit être installé par l’intermédiaire de https://imagej.net/Fiji/Downloads. En outre, la macro utilisée dans ce processus est fournie dans le Fichier supplémentaires. Placez le fichier de macro dans un répertoire facilement accessible.
Image de- charge un fond clair d’une section sélectionnée dans les îles Fidji. Accédez au Plugins → Segmentation → Segmentation Weka Trainable.
- Afin de préciser les zones cellulaires de la section, tracez une ligne sur une fibre et cliquez sur " ajouter à la classe 1 ". Puis, tracez une ligne sur l’espace entre les fibres, puis cliquez sur " ajouter à la classe 2 " pour marquer les domaines extracellulaires. Répétez jusqu'à ce qu’il y a 5-10 étiquettes dans chaque classe.
- Cliquez sur Train classifieur. Sur la superposition rouge et verte qui en résulte, ajouter des étiquettes plus manuellement (Voir l’étape 4.2) aux pièces mal segmentées de l’image, si nécessaire. Répétez jusqu'à ce que les fibres (rouge) sont bien séparées de l’espace entre les fibres (vert).
- Cliquez " probabilité d’obtenir " et enregistrez l’image dans un dossier nouvellement étiqueté.
- Répéter la procédure ci-dessus (étapes 4.2 et 4.3) avec l’image fluorescente prise sur le même terrain. Immunomarquage fibres comme l’étiquette " classe 1 " et toutes les régions non fluorescent comme " classe 2 ". Enregistrer la carte de probabilité résultante dans le même dossier où l’image de fond clair transformés est stockée.
- Ouvrir une des cartes probabilité enregistré précédemment à Fidji. Dessiner une ligne droite sur la barre d’échelle fournie par le logiciel d’imagerie. Aller à analyser → définissez échelle. Modifier les paramètres (p. ex., distance connue, unité de longueur) à leurs valeurs appropriées telle que donnée par la barre d’échelle, puis vérifiez le " Global " boîte de normaliser l’échelle pour chaque image.
- Accédez à Plugins → Macros → Run → Tyagi et coll. fibre quantification macro.ijm (voir le Fichier supplémentaire). Immédiatement, un volet de navigation s’affiche. Ouvrez l’image ' dossier d’hôte s ; une boîte de dialogue apparaîtra. Pour chaque boîte de dialogue Modifier le " fond " valeur dropdown à " lumière. "
Remarque : le dossier est maintenant rempli avec des images des contours fibre et fichiers logiciel tableur des résultats (CSA et Feret diamètre sont plus pertinents dans quantifier la morphologie des fibres ; paramètres mesurés peuvent être ajustées à analyser les mesures de la valeur). Données de morphologie de fibre générées par la fonction de pore-analyse des Fidji seront automatiquement transférées à fichiers logiciel tableur pour les deux images de champ fluo et lumineux. - Calculer la fraction de fibres exprimant une chaîne donnée dans un champ en divisant le nombre de fibres fluorescentes dans le domaine par le nombre de fibres totales dans l’image correspondante du champ lumineux.
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Representative Results
Muscles postérieurs (p. ex., jambier antérieur, muscle soléaire), disséqués de souris C57BL/6 mâles d’âge inconnu ont été flash congelés en fonçant un moule en plastique contenant le muscle en OCT composé dans l’isopentane refroidi à l’azote liquide. Puis, coupes sériées de 8-10 µm en utilisant un cryotome, ont été coupés à-20 ° C et transférés à différents verre chargé positivement diapositives12.
Nous avons choisi le jambier antérieur et soléaire parce que ces muscles sont composées principalement de fibres de contraction rapide ou lente, respectivement13,14. Suite d’immunohistochemical souillant pour individuel type I, IIA, IIX et chaînes lourdes de myosine IIB, images de fond clair et fluorescentes ont été capturés. Les panneaux de gauche de la Figure 1 montrent des sections d’un immunomarquage de muscle soléaire avec le type I, IIA, anticorps IIX et IIB chaîne spécifique figurant au tableau 1.
Figure 1 : Coloration immunohistochimique de chaîne de type I, IIA et IIB dans le muscle soléaire de souris, de IIX. Panneaux de gauche montre les images fluorescentes obtenus à partir des sections d’un muscle soléaire de souris avec un anticorps primaires dirigés vers de type I (BA-F8 ; ( A), de type IIA (SC-71 ; ( B), de type IIX (6 H 1 ; C) et de type IIB (BF-F3 ; Chaînes lourdes de myosine D). Panneaux de droite montre les sections dans lesquelles l’anticorps primaire utilisé dans l’expérience décrite dans le panneau de gauche correspondant a été omis. Barres = 100 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Plus précisément, nous avons observé des fractions importantes de fibres exprimant type I (Figure 1A, à gauche) et type IIA chaînes lourdes de myosine (Figure 1B, gauche) avec une bonne quantité de fibres restantes affichant une coloration positive pour type IIX chaînes lourdes de myosine (Figure 1C, gauche). En revanche, pratiquement sans fibres de type IIB étaient évidents (Figure 1D, gauche). Ces observations s’accordent avec des rapports antérieurs qui muscle soléaire est composées principalement de type I, type IIA et IIX fibres de type (moins donc) avec presque aucun type IIB fibres5,10,12. Ce qui est important, aucune coloration a été observée dans les sections dans lesquelles l’anticorps primaire a été omis dans le protocole, démontrant la spécificité de l’anticorps (Figure 1A-D, panneaux de droite).
Figure 2 : Coloration immunohistochimique de la chaîne de type IIB, IIX, IIA et j’ai dans le muscle jambier antérieur de souris. Panneaux de gauche montre les images fluorescentes obtenus à partir des sections d’un jambier antérieur de souris avec un anticorps primaires de type IIB (A), de type IIX (B), de type IIA (C) et de chaînes lourdes de myosine (D) de type I. Panneaux de droite montre les sections dans lesquelles l’anticorps primaire utilisé dans l’expérience décrite dans le panneau gauche adjacent a été omis. Barres = 100 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Nous avons également teinté tibialis anterior muscles avec les anticorps susmentionnés. Tibialis anterior muscles étaient composés principalement de type IIB et type IIX MyHC séropositifs fibres (Figure 2A-B, panneaux à gauche) avec des petites contributions de fibres de type IIA chaînes lourdes de myosine (Figure 2C, à gauche) ; pratiquement aucun fibres exprimant type j’ai chaîne devais observé (Figure 2D, gauche). Nos données indiquent que le souris jambier antérieur est composé principalement de contraction rapide de type IIA, IIB de type et type IIX fibres sont compatibles avec les précédentes études5,10,13. Encore une fois, aucune coloration a été observée dans les sections dans lesquelles l’anticorps primaire a été omis dans le protocole (Figure 2A-D, panneaux de droite).
Figure 3 : Fibre informatisé itéré segmentation. Image de fond clair d’une section antérieure de souris tibialis (A). Transformation de la même image à l’aide de notre algorithme semi-automatisé (B). Image fluorescente du même article montrant l’immunomarquage de type IIA MyHC (C). Transformation, l’image seul type fibres exprimant un IIA (D). Barres = 100 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Aux fins de l’analyse morphométrique, images de fond clair des champs immunomarquage ont aussi été obtenus. L’exemple illustré à la Figure 3A provient d’une section de muscle antérieur de tibialis sondée avec SC-71 anticorps dirigés à taper des chaînes lourdes de myosine II a13. En utilisant notre algorithme semi-automatisé original, plusieurs transformations d’image ont été utilisées pour générer des cartes de probabilité à partir des images de fond clair. Une transformation de l’image typique dérivée de l’image de fond clair, illustré à la Figure 3A est présentée à la Figure 3B. À l’aide de la transformation et la fonction d’analyse de pore de Fidji, nous avons mesuré l’ASC moyenne (891,4 ± 45,0 µm2), maximum (46,9 ± 1,3 µm) et minimale (26.0 ± 0,8 µm) moyenne Feret diamètres de chaque fibre dans le domaine. Pour tester la fidélité de nos mesures, nous avons également évalué ces paramètres à l’image de fond clair manuellement. CSA (± 867.0 52,0 µm2) moyenne, maximale (45,7 ± 3,5 µm) et minimale (25,6 ± 1,9 µm) signifient Feret diamètres obtenus à l’aide de la méthode d’acquisition manuelle plus fastidieuse n’étaient pas significativement différentes de la méthode semi-automatisée (tous p > non-appariés 0,05, t-teste ; Le tableau 3).
= "/ files/ftp_upload/56024/56024table3.jpg » / >
Tableau 3 : fibre morphologie et la composition du tibialis anterior muscle immunocolorées pour type I, IIA, IIB et chaînes lourdes de myosine IIX telle que déterminée par des méthodes d’analyse manuelles et semi-automatique. Moyenne fibre CSA, moyenne Feret diamètres et le type de la chaîne, dans une souris jambier antérieur, quantifiée par une évaluation manuelle traditionnelle par rapport à l’algorithme présenté. Veuillez noter que les fractions combinées dépassent la valeur de 1 en raison de la présence de fibres exprimant plus d’un type de chaîne.
Figure 3 C montre une image fluorescente de l’immunomarquage de champ même avec des anticorps dirigés à taper des chaînes lourdes de myosine IIA. Les fibres colorées positivement dans le domaine ont été sélectionnés par numéro (Figure 3D) et utilisées pour déterminer la fraction de fibres de type IIA chaîne exprimant en divisant par le nombre total des fibres dans le domaine de transformation de fond clair (tableau 3 ). La moyenne CSA, maxima et minima Feret diamètres des fibres de type IIA ont ensuite étés évaluées (tableau 3). La proportion de type I, type IIX et du type des fibres IIB, ainsi que leurs dimensions, ont été déterminées en répétant ce protocole en coupes sériées immunomarquage avec BA-F8, 6H 1 et des anticorps de BF-F3, respectivement de6,12(tableau 4 ; Figure 4 A-D).
Tableau 4 : chaîne contenu et la morphologie dans le soléaire de souris et tibialis anterior. Compositions de type fibre de sections représentatives du muscle soléaire et jambier antérieur. Quantification de l’ASC moyenne, minimales et maximales des diamètres Feret de type I, type IIA, tapez IIX et type IIB dans le soléaire et le jambier antérieur sont indiqués. Données sont données comme moyen ±ét.
Nous avons également évalué ces paramètres dans un champ provenant du muscle soléaire (tableau 4; Figure 4 A-D). 3 052 et 2 876 fibres individuelles ont été comptés pour le jambier antérieur et le muscle soléaire, respectivement. Pris ensemble, ces résultats démontrent la faisabilité de notre méthode en fibre de type analyse morphométrique.
Figure 4 : Sommaire des données d’analyse morphométrique. Compositions de type fibre de sections représentatives du jambier antérieur et soléaire (A). Quantification de moyenne CSA, les minimimal et les diamètres de Feret maximales du type I, type IIA, tapez IIX et type IIB fivers dans le muscle jambier anteriort et soléaire sont indiqués en (B-D). Données sont données en moyenne ±ét. des différences significatives entre le jambier antérieur et soléaire sont indiqués (* dénote p < 0,05 : ** dénote p < 0,01 ; *** dénote p < 0,005 ; t-test). 3 052 et 2 876 fibres individuelles ont été comptés pour le jambier antérieur et le muscle soléaire, respectivement. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Fichier supplémentaire : macro de quantification fibre. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
Ici, nous avons fourni une orientation utile pour l’identification des types de fibres musculaires squelettiques. Ce faisant, les auteurs décrivent un nouvel algorithme pour l’analyse des données.
Étant donné que dans une large mesure, nos résultats confirment ceux des précédents rapports5,8,10 et reflètent nos propres mesures manuelles, l’algorithme semble être précis. Pourtant, nous avons rencontré quelques pièges expérimentaux rares comprenant fibre peu claires limites résultant de l’artefact de sectionnement. L’impact de ces artefacts peut être réduite par le biais de sectionnement prudent et vigilant examen de la partie traitée avant l’analyse. En particulier, les moins-que-optimale segmentation d’image peut-être être contournée grâce à plusieurs séries de reclassement sur la même image pour atteindre contraste plus nette.
L’étape la plus cruciale dans notre protocole est l’étape 4.2 dans lequel nous précisent les zones cellulaires et extracellulaires de la section en traçant une ligne sur une fibre donnée, distinguant ainsi une « classe 1 » ou « classe 2"zone. Évidemment, cette distinction manuelle est essentielle car elle détermine les limites des fibres musculaires ; une erreur dans cette étape affectera négativement l’évaluation de la dimension de la fibre.
Dans cette étude, nous avons sondé sections pour qu’une chaîne dans une section donnée de série. Cependant, certaines fibres, tels que les fibres de l’hybride, expriment deux types de chaîne, indicative du recoupement des profils métaboliques et fonctionnels (p. ex., de type IIX et de type IIB). Ainsi, les fractions d’additionnées à une valeur de type de fibre > 1 pour le soléaire et le jambier antérieur (Figure 4A). Les fibres hybride peuvent être identifiés avec le double ou même triple-, à l’étiquetage des protocoles tels que ceux décrits par Lee et al. 7et5Bloemberg et Quadrilatero, respectivement. Important, notre méthode d’analyse peut être appliqué à ces protocoles de coloration plus complexes. Une autre limitation de notre protocole est qu’il n’est pas entièrement automatique ; Cependant, nous croyons que cette concession mineure s’assure que notre méthode ne compromet pas la rigueur dans un souci de vitesse.
Alors que la composition de la chaîne des soléaires tibialis anterior muscles et observée dans cette étude reflètent les résultats des précédentes études5,6,7,10,14 , il y a certains contrastes avec des études antérieures concernant l’évaluation du CSA. Par exemple, nos mesures de l’ASC moyenne sont légèrement plus petits que ceux rapportés par Bloemberg et Quadrilatero5 et Allen et al. 15 en particulier, nos mesures de CSA variaient de 539.86 ± 24.44 µm2 à 1319.50 ± 57,47 µm2 dans l’ensemble de types de fibres alors qu’eux s’étend sur environ 735,7 ± 31,2 µm2 à 3073.8 ± 51,3 µm2. Cependant, nos valeurs ressemblent davantage à celles observées par Augusto al. 13 et Lucas et al. 6 ayant déclaré AP moyenne allant de 436 ± 605 µm2 2404 ± 412,5 µm2 et 815 ± 221 µm2 à 1904 ± 570 µm2, respectivement. Certaine variabilité dans l’analyse morphométrique des fibres du membre postérieur souris existe donc, dans l’ensemble de la littérature.
Immunohistochemistry présente un moyen efficace d’étiqueter et de classer les fibres musculaires après leur teneur en chaîne. Une quantification précise d’immunohistochemical expériences est essentielle pour aboutir à des conclusions significatives sur les données ; à cette fin, une méthode qui permet d’automatiser les parties fastidieux d’analyse est utile, surtout quand des centaines ou même des milliers de fibres doivent être mesurés et classés. En plus de fournir des mesures semblables aux observations manuelles, notre algorithme fournit une évaluation précise de ces données sans partialité ; cet avantage sur mesures manuelles garantit la rigueur scientifique. À cet égard, notre méthodologie peut être utile dans la caractérisation des effets des manipulations génétiques et expérimentales qui touchent l’intégrité musculaire. Plus précisément, chaîne immunohistochimie couplé avec notre méthode d’analyse rapide peut-être être employée pour évaluer les changements morphologiques et métaboliques dans le muscle des modèles de maladies comme la dystrophie musculaire, cachexie ALS et le cancer. En outre, l’efficacité des interventions qui empêchent l’atrophie ou provoquer une hypertrophie peut également être évaluée.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun intérêt contradictoires de divulguer.
Acknowledgments
Nous sommes reconnaissants à la Fondation de Boettcher et l’Association de la sclérose latérale amyotrophique (#17-II-344) pour leur soutien à cette recherche.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9418-100G | 5% in PBS |
| Hydrophobic Barrier Pap Pen | Scientific Device Laboratory | 9804-02 | |
| Microscope Slides | Globe Scientific | 1358W | |
| Coverglass | Fisher Scientific | 12-544-E | |
| Immumount | Thermo Scientific | 9990402 | |
| Nail Polish | L'Oreal | ||
| Nikon Eclipse TE-200 Inverted Fluorescence and Brightfield Microscope | Discontinued | ||
| SPOT RT/KE | SPOT Imaging Solutions | RT940 | |
| Dell Optiplex | |||
| BA-F8 Primary Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa | monoclonal mouse IgG2b; 1:50 | |
| SC-71 Primary Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa | monclonal mouse IgG1; 1:50 | |
| BF-F3 Primary Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa | monoclonal mouse IgGM; 1:50 | |
| 6H1 Primary Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa | monoclonal mouse IgGM; 1:50 | |
| Alexa Fluor 594 anti-IgG2b | Invitrogen | A21145 | goat anti-mouse; 1:200 |
| Alexa Fluor 488 anti-IgG1 | Invitrogen | A21121 | goat anti-mouse;1:200 |
| Alexa Fluor 594 anti-IgGM | Invitrogen | A21044 | goat anti-mouse;1:200 |
| OCT | Sakura Finetek | 4583 | |
| isopentane | Fisher Scientific | O3551-4 | cool with liguid nitrogen |
| PBS | Fisher Bioreagents | BP665-1 | 10x, dilute to 1x |
| Kim wipes | Kimberly-Clark | 06-666A |
References
- Engel, W. K. The essentiality of histo- and cytochemical studies of skeletal muscle in the investigation of neuromuscular disease. Neurol. 12, 778-784 (1962).
- Dobrowolny, G., et al. Skeletal muscle is a primary target of SOD1G93A-mediated toxicity. Cell Metab. 8, 425-436 (2008).
- Sultana, N., et al. Restricting calcium currents is required for correct fiber type specification in skeletal muscle. Development. 143 (9), 1547-1559 (2016).
- Guth, L., Samaha, F. J. Procedure for the histochemical demonstration of actomyosin ATPase. Exp Neurol. 28 (2), 365-367 (1970).
- Bloemberg, D., Quadrilatero, J. Rapid determination of myosin heavy chain expression in rat, mouse, and human skeletal muscle using multicolor immunofluorescence analysis. PLoS One. 7 (4), (2012).
- Lucas, C. A., Kang, L. H., Hoh, J. F. Monospecific antibodies against the three mammalian fast limb myosin heavy chains. Biochem Biophys Res Commun. 272 (1), 303-308 (2000).
- Lee, C. S., et al. Ca2+ permeation and/or binding to Cav1.1 fine-tunes skeletal muscle Ca2+ signaling to sustain muscle function. Skelet Muscle. 5 (4), (2015).
- Sawano, S., et al. A one-step immunostaining method to visualize rodent muscle fiber type within a single specimen. PLoS One. 11 (11), (2016).
- Meunier, B., Picard, B., Astruc, T., Labas, R. Development of image analysis tool for the classification of muscle fibre type using immunohistochemical staining. Histochem Cell Biol. 134 (3), 307-317 (2010).
- Kammoun, M., Casser-Malek, I., Meunier, B., Picard, B. A simplified immunohistochemical classification of skeletal muscle fibres in mouse. Eur J Histochem. 58 (2), 2254 (2014).
- Kumar, A., Accorsi, A., Rhee, Y., Girgenrath, M. Do's and don'ts in the preparation of muscle cryosections for histological analysis. J Vis Exp. (99), (2015).
- Schiaffino, S., et al. Three myosin heavy chain isoforms in type 2 skeletal muscle fibres. J Muscle Res Cell Motil. 10 (197), (1989).
- Augusto, V., Padovani, C. R., Campos, G. E. R. Skeletal muscle fiber types in C57Bl6j mice. Braz J Morphol Sci. 21 (2), 89-94 (2004).
- Schiaffino, S., Reggiani, C. Fiber types in mammalian skeletal muscles. Physiol Rev. 91 (4), 1447-1531 (2011).
- Allen, D. L., Harrison, B. C., Maass, A., Bell, M. L., Byrnes, W. C., Leinwand, L. A. Cardiac and skeletal muscle adaptations to voluntary wheel running in the mouse. J Appl Physiol. 90 (5), 1900-1908 (2001).
