Summary
La coloración de Immunohistochemical de las isoformas de cadena pesada de miosina ha surgido como discriminador de estado de la técnica del tipo de fibra del músculo esquelético (es decir, tipo I, tipo IIA, tipo IIX, tipo IIB). Aquí, presentamos un protocolo de tinción junto con un algoritmo novela semi-automatizado que facilita la rápida evaluación de la morfología del tipo de fibra y fibra.
Abstract
Durante años, distinciones entre tipos de fibras de músculo esquelético se visualizaron mejor manchando de la miosina-ATPasa. Más recientemente, la coloración de immunohistochemical de las isoformas de miosina cadena pesada (MyHC) ha emergido como un discriminador más fino de tipo de fibra. Tipo I, tipo IIA, tipo IIX y fibras de tipo IIB ahora pueden ser identificadas con precisión basada en su perfil de MyHC; sin embargo, manual análisis de estos datos puede ser lento y abajo-derecha tedioso. En este sentido, rápida y precisa evaluación de morfología y composición del tipo de fibra es una herramienta muy accesible. Aquí, presentamos un protocolo para la coloración de immunohistochemical de la estado-de-arte de MyHCs en secciones congeladas de músculo de ratón trasera junto con un algoritmo novela semi-automatizado que acelera el análisis de la morfología del tipo de fibra y fibra. Como era de esperar, el músculo de soleus muestra coloración para tipo I y tipo las fibras IIA, pero no para las fibras tipo IIX o tipo IIB. Por otro lado, el músculo anterior de tibialis fue compuesto predominante de fibras de tipo IIX y tipo IIB, una pequeña fracción de fibras de tipo IIA y poca o ninguna tipo I fibras. Varias transformaciones de imagen fueron utilizadas para generar mapas de probabilidad con el fin de medir diferentes aspectos de la morfología de la fibra (es decir, área de sección transversal (CSA), diámetro de Feret máximo y mínimo). Los valores obtenidos para estos parámetros entonces fueron comparados con los valores obtenidos manualmente. No hubo diferencias significativas se observaron entre ambos modos de análisis con respecto a la CSA, máxima o mínima diámetro de Feret (todos p > 0.05), indicando la precisión de nuestro método. Así, nuestro protocolo de análisis de inmunotinción puede aplicarse a la investigación de los efectos en la composición de músculo en muchos modelos de envejecimiento y miopatía.
Introduction
Se ha sabido por una cierta hora que músculo esquelético se compone de fibras individuales de muchos tipos1. Inicialmente, dos grupos de fibras se caracterizaron basado en sus propiedades contráctiles y llamado, apropiadamente, contracción lenta (tipo I) y de contracción rápida (tipo II). Estas categorías se distinguen sobre la base de metabolismo de la fibra. Desde el tipo I fibras son ricas en mitocondrias y dependen del metabolismo oxidativo, se aclarado por sólidamente positiva de nicotinamida-adenin-dinucleótido-tetrazolio reductasa (NADH-TR) diaphorase2 o Succinato deshidrogenasa (SDH)3 de tinción. Por el contrario, exhiben menor fibras de tipo II y grados variables de NADH-TR diaphorase o SDH la coloración y se dividieron en dos subgrupos de contracción rápida (tipo IIA y tipo IIB) algo crudamente basados en su relativa capacidad oxidativa. Estas distinciones entre las fibras han sido visualizadas más eficazmente por miosina-ATPasa la coloración donde el tipo I fibras de manchan oscuras después de una preincubación a pH 4.0 y fibras de tipo IIB absorben precipitado siguiente preincubación a pH 10.0 con fibras de tipo IIA la coloración intermedio4.
Más recientemente, la coloración de immunohistochemical de las isoformas de miosina cadena pesada (MyHC) ha emergido como un discriminador más fino de fibra tipo5. Tipo I, tipo IIA y tipo IIB fibras pueden ser todos identificadas con precisión basada en su perfil de MyHC. Además, otro tipo metabólico intermedio fibra de contracción rápida, tipo IIX, ha sido identificado6. Las fibras híbridas expresando más MyHC también han sido confirmados5,7,8. Algunas especies como el gato y el Babuino se saben expresa tipo IIB MyHCs6. Aunque MyHC inmunotinción es actualmente la evaluación de estado de la técnica de la composición del músculo, el análisis de los datos obtenidos mediante esta técnica es engorrosa y requiere mucho tiempo sin asistencia automática. Para ello, un puñado de métodos semiautomáticos para analizar estos datos han sido desarrollados5,9,10. Aquí, presentamos un protocolo relativamente estándar para la identificación inmunohistoquímica de fibra muscular tipo5,7,8,10, junto con una novela semi-automatizada algoritmo que acelera el análisis de la morfología del tipo de fibra y fibra con precisión.
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Protocol
todos los procedimientos que involucran ratones fueron aprobados por la Universidad de Colorado-Anschutz Medical Campus institucional Animal Care y uso (91813(05)1D).
1. día 1: primaria (1°) Immunostaining con albúmina sérica bovina (BSA) bloqueo
- al aire secciones congeladas del músculo del miembro posterior de ratón (por ejemplo, tibial anterior, sóleo) montado en diapositivas cargadas de ~ 30 min 11. dibujar un borde alrededor de las secciones usando una barrera hidrofóbica PAP pluma.
- Lugar ~ 250 μl de 5% BSA/tampón de fosfato salino (PBS/BSA) en cada diapositiva para bloquear la Unión de anticuerpos no específicos. Incube los portaobjetos a temperatura ambiente durante 1 h.
- Al bloqueo, preparar 1:50 las diluciones del anticuerpo 1 ° sobrenadante en el 5% BSA/PBS (todos son anticuerpos monoclonales de ratón; ver tabla 1 6 , 12) preparar 250 μl de solución por diapositiva. Mantener las poblaciones de anticuerpos de 1° y diluciones en hielo.
tabla 1: anticuerpos primarios utilizados para distinguir MyHCs.
- después de la aspiración de la solución al bloqueo 5% BSA/PBS, Añadir 250 μl de la dilución de anticuerpos de 1° a las diapositivas correspondientes. Añadir 250 μl de 5% BSA/PBS para secundaria (2°) anticuerpo negativo de control que sólo desliza.
- Incubar a 4 ° C durante 24-48 h en un ambiente húmedo.
Nota: Un plato de Petri cubiertas en papel de aluminio con papel de filtro humedecido puede servir como una cámara de incubación adecuada.
2. Día 2:2 ° Immunostaining con los anticuerpos fluorescentes
- aspirar 1° solución de anticuerpo o 5% BSA/PBS solución de control. Lave todo desliza tres veces, 10 minutos con 5% de BSA.
- Al lavarse, preparar diluciones 1: 200 de los anticuerpos purificados, conjugados fluoróforo 2 ° de 5% BSA/PBS (véase el cuadro 2, todos son cabra anti-ratón). Preparar 250 μl de solución por diapositiva. Mantener anticuerpos conjugados fluoróforo 2° en la oscuridad en hielo.
tabla 2: anticuerpos secundarios conjugados fluoróforo se usan para visualizar primario anticuerpo reconocimiento de MyHCs.
- después de la aspiración de la tercera aplicación de la solución al bloqueo 5% BSA/PBS, Añadir 250 μl de dilución de anticuerpo de 2° a todas las diapositivas. Incubar durante 90 minutos a temperatura ambiente en un ambiente oscuro y húmedo.
- Solución de aspirado 2° anticuerpo. Lave todo desliza tres veces, 10 minutos con 5% BSA/PBS.
- Enjuague con PBS. Seca durante 10 minutos
- Montar el cubreobjetos con un medio de montaje acuoso no permanente, de baja viscosidad.
- Cuando esté seco, sellar los bordes de la diapositiva con esmalte de uñas. Secar y guardar en un oscuro slidebox.
3. Diapositivas con microscopía de epifluorescencia de imágenes
- limpiar los portaobjetos con un trapo de laboratorio empapado en etanol 70% pequeñas,.
- Obtener imágenes digitales de las secciones de músculo immunostained usando un microscopio de epifluorescencia equipado con un aparato fotográfico (ver la Tabla de materiales).
- Seleccione un área de aproximadamente 1 mm 2 (objetivo de 10 X, NA 1.4).
- Ver fluorescencia de anticuerpos conjugados con Alexa 488 2° vía un 505 nm largo filtro. Ve la fluorescencia generada por excitación de anticuerpos conjugados con Alexa 594 2° a través de un filtro de paso de largo 595 nm. Digitalizar imágenes con un ordenador PC equipado con un software de tratamiento de imágenes compatible. Incluyen la barra de escala del software para su posterior análisis de imágenes.
4. Análisis de imágenes con Fiji
Nota: antes de proceder con el análisis, Fiji (disponible libremente de los institutos nacionales de salud, Bethesda, MD) debe ser instalado a través de https://imagej.net/Fiji/Downloads. También, la macro utilizada en este proceso se proporciona en el Archivo suplementario. Coloque el archivo de macro en un directorio accesible.
- Carga un brightfield imagen de una sección seleccionada en Fiji. Desplácese hasta Plugins → segmentación → segmentación de Weka Trainable.
- Con el fin de establecer las áreas celulares de la sección, trace una línea en una fibra y haz clic " Agregar clase 1 ". A continuación, trace una línea en el espacio entre las fibras y haga clic en " añadir a la clase 2 " para marcar los dominios extracelulares. Repita hasta que hay etiquetas de 5-10 en cada clase.
- Haga clic en clasificador de tren. En la superposición de roja y verde resultante, agregar más etiquetas manualmente (ver paso 4.2) para piezas mal segmentados de la imagen, si es necesario. Repita hasta que las fibras (rojo) se separan adecuadamente el espacio entre las fibras (verde).
- Clic " probabilidad de conseguir " y guardar la imagen en una carpeta recién etiquetada.
- Repita el procedimiento anterior (pasos de 4.2-4.3) con la imagen fluorescente del mismo campo. Etiqueta immunostained fibras como " clase 1 " y todas las regiones no fluorescente como " clase 2 ". Guardar el mapa de probabilidad resultante en la misma carpeta donde se almacena la imagen procesada brightfield.
- Abrir uno de los mapas de probabilidad previamente guardado en Fiji. Trazar una línea recta en la barra de escala proporcionada el software de imágenes. Ir a analizar → establecer escala. Cambiar los parámetros (es decir, distancia conocida, unidad de longitud) a sus valores apropiados según lo dado por la barra de escala, a continuación, compruebe el " Global " caja para estandarizar la escala para cada imagen.
- Vaya a Plugins → Macros → ejecutar → Tyagi et al. fibra cuantificación macro.ijm (véase el Archivo suplementario). Inmediato, aparecerá un panel de navegación. Abre la imagen ' carpeta de host s; aparecerá un cuadro de diálogo. Para cada cuadro de diálogo, cambie el " fondo " desplegable valor a " luz. "
Nota: la carpeta ahora se popularán con imágenes de los contornos de la fibra y archivos de software de hoja de cálculo de los resultados (diámetro de Feret y CSA son más pertinentes para cuantificar la morfología de la fibra; parámetros medidos pueden ajustarse en analizar las mediciones de conjunto). Datos de la morfología de fibra generados por la función del poro-análisis de Fiji serán transferidos automáticamente a los archivos de software de hoja de cálculo para ambas imágenes de campo fluorescente y brillante. - Calcular la fracción de fibras expresando un determinado MyHC en un campo al dividir el número de fibras fluorescentes en el campo por el número de fibras totales en la correspondiente imagen de campo brillante.
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Representative Results
Miembro posterior los músculos (es decir, tibial anterior, sóleo) disecados de un ratón C57BL/6 Masculino de edad desconocida eran flashes congelado por hundir un molde de plástico que contiene el músculo en OCT en isopentano enfriado en nitrógeno líquido. Luego, usando un cryotome, secciones seriales de 8-10 μm fueron a-20 ° C y transferidas a vidrio cargado positivamente diferentes diapositivas12.
Elegimos tibial anterior y sóleo porque estos músculos se componen predominantemente de fibras de contracción rápida y lenta, respectivamente13,14. Tras la coloración immunohistochemical para los tipo I, IIA, IIX y IIB MyHCs, capturaron imágenes brightfield y fluorescente. Los paneles de la izquierda de la figura 1 muestran las secciones de un immunostained del Músculo sóleo con el tipo I, IIA, IIX y IIB MyHC específicos los anticuerpos mencionados en la tabla 1.
Figura 1 : La coloración de Immunohistochemical de la MyHC tipo I, IIA, IIX y IIB en músculo de ratón soleus. Paneles de la izquierda muestran imágenes fluorescentes de secciones de un músculo de soleus ratón sondeado con anticuerpos primarios dirigidos a tipo I (BA-F8; A), tipo IIA (SC-71; B), tipo IIX (6 H 1; C) y tipo IIB (BF-F3; MyHCs D). Paneles de la derecha muestran las secciones en las que el anticuerpo primario utilizado en el experimento representado en el panel de la izquierda correspondiente fue omitido. Bares = 100 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Específicamente, observamos importantes fracciones de fibras expresando tipo I (figura 1A, izquierda) y tipo IIA MyHCs (figura 1B, izquierda) con una buena cantidad de las fibras restantes mostrando la coloración positiva para el tipo MyHCs IIX (figura 1C, izquierda). Por el contrario, prácticamente no hay fibras de tipo IIB fueron evidentes (figura 1D, izquierda). Estas observaciones son consistentes con informes anteriores que músculos sóleo se compone sobre todo de tipo I, tipo IIA y tipo IIX fibras (no tanto) con casi ningún tipo IIB fibras5,10,12. Lo importante, ninguna coloración se observó en secciones en las que el anticuerpo primario se han omitido en el protocolo, demostrando la especificidad de los anticuerpos (figura 1A, D, paneles de la derecha).
Figura 2 : La coloración de Immunohistochemical de la MyHC tipo IIB, IIX y IIA en el músculo anterior de tibialis ratón. Paneles de la izquierda muestran imágenes fluorescentes de secciones de un músculo anterior de tibialis ratón sondeado con anticuerpos primarios dirigidos a tipo IIB (A), tipo IIX (B), tipo IIA (C) y (D) MyHCs de tipo I. Paneles de la derecha muestran las secciones en las que el anticuerpo primario utilizado en el experimento descrito en el panel izquierdo adyacente fue omitido. Bares = 100 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
También nos mancharon tibialis anterior músculos con los anticuerpos antes mencionados. Tibialis anteriores músculos fueron compuestos sobre todo de las fibras tipo IIB y tipo IIX MyHC-positivos (figura 2A-B, los paneles a la izquierda) con contribuciones más pequeñas de fibras expresando tipo IIA MyHCs (figura 2C, izquierda); prácticamente ningunas fibras expresando tipo MyHC estuviera observé (figura 2D, izquierda). Nuestros datos indicando que el ratón tibial anterior se compone predominante de contracción rápida tipo IIA, tipo IIB y tipo IIX fibras son consistentes con estudios anteriores5,de10,13. Otra vez, ninguna coloración se observó en las secciones en las que el anticuerpo primario se han omitido en el protocolo (figura 2A, D, paneles de la derecha).
Figura 3 : Segmentación de fibra computarizado iterada. Imagen trasmitida de una sección anterior de tibialis de ratón (A). Transformación de la misma imagen usando nuestro algoritmo semiautomático (B). Imagen fluorescente de la misma sección mostrando inmunotinción de tipo IIA MyHC (C). Transformación imagen único tipo expresando IIA MyHC fibras (D). Bares = 100 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Con el fin de análisis morfométrico, también se obtuvieron imágenes de brightfield de los campos immunostained. El ejemplo mostrado en la figura 3 es de una sección del músculo anterior de tibialis sondada con SC-71 anticuerpos dirigidos a tipo IIA MyHCs13. Usando nuestro algoritmo semiautomático original, varias transformaciones de imagen fueron utilizadas para generar mapas de probabilidad de las imágenes de brightfield. Una transformación típica imagen derivada de la imagen trasmitida que se muestra en la figura 3A se presenta en la figura 3B. Usando la transformación y la función de análisis de poro de Fiji, medimos la CSA media (± 891.4 45.0 μm2), máximo (46,9 ± 1,3 μm) y mínimo (26.0 ± 0.8 μm) media Feret diámetros de cada fibra en el campo. Para probar la fidelidad de nuestras mediciones, se evaluaron también estos parámetros en la imagen de brightfield manualmente. La media CSA (867.0 ± 52,0 μm2), máximo (45,7 ± 3,5 μm) y mínimo (25,6 ± 1.9 μm) significan diámetros de Feret obtenidos mediante el método de adquisición manual más tedioso no fueron significativamente diferentes desde el método semiautomático (todos los p > 0.05, t-pruebas; Tabla 3).
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Tabla 3: morfología de la fibra y la composición del músculo anterior de tibialis immunostained para tipo I, IIA, IIB y IIX MyHCs determinado por métodos analíticos manuales y semiautomáticos. Quiere decir fibra CSA, significa diámetros de Feret y tipo de la MyHC, en un ratón de tibial anterior, cuantificado mediante evaluación manual tradicional versus el algoritmo presentado. Tenga en cuenta que fracciones combinados excedan un valor de 1 debido a la presencia de expresar más de un tipo de MyHC fibras.
Figura 3 C muestra una imagen fluorescente de lo mismo campo immunostained con anticuerpos dirigidos a tipo IIA MyHCs. Fibras teñidas positivamente en el campo fueron seleccionadas por número (figura 3D) y permite determinar la fracción de fibras de tipo IIA MyHC-expresar dividiendo por el número total de fibras en el campo de la transformación de brightfield (tabla 3 ). La media CSA, máximo y mínimo diámetros de Feret de fibras de tipo IIA fueron luego evaluadas (tabla 3). La proporción del tipo I, las fibras tipo IIX y tipo IIB, así como sus dimensiones, se determinaron mediante la repetición de este protocolo en serie secciones immunostained con BA-F8, 6H 1 y BF-F3 anticuerpos, respectivamente6,12(tabla 4 ; Figura 4 A-D).
Tabla 4: MyHC contenido y morfología en sóleo de ratón y tibial anterior. Composiciones de tipo fibra de secciones representativas del sóleo y tibial anterior. Cuantificación de la CSA promedio, mínimo y máximo diámetro de Feret de tipo I, tipo IIA, tipo IIX y aparecen tipo IIB en el sóleo y tibial anterior. Los datos se dan como media ±SEM.
También se evaluaron estos parámetros en un campo que se obtiene del Músculo sóleo (tabla 4; Figura 4 A-D). 3.052 y 2.876 fibras individuales fueron contadas para el tibial anterior y los músculos sóleo, respectivamente. Tomados en conjunto, estos datos demuestran la viabilidad de nuestro método de análisis morfométricos y tipo de fibra.
Figura 4 : Datos de análisis morfométricos Resumen. Composiciones de fibra tipo de secciones representativas de la tibial anterior y los músculos sóleo (A). Cuantificación de media CSA, minimimal y diámetros de Feret máximos de tipo I, tipo IIA, tipo IIX y tipo IIB fivers en la anteriort tibial y el sóleo se muestran en (B-D). Los datos se dan como media ±SEM. diferencias significativas entre el tibial anterior y sóleo se indican (* denota p < 0.05: ** denota p < 0.01; *** denota p < 0.005; prueba t). 3.052 y 2.876 fibras individuales fueron contadas para el tibial anterior y los músculos sóleo, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Archivo suplementario: macro de cuantificación de fibra. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
Aquí, hemos proporcionado una dirección útil para la identificación de tipos de fibras de músculo esquelético. De esta manera, se describe un nuevo algoritmo para el análisis de los datos.
Puesto que en gran parte, nuestros resultados los anteriores informes5,8,10 confirman y reflejan nuestras propias mediciones manuales, el algoritmo parece ser exacta. Aún así, nos encontramos con algunas trampas experimentales poco frecuentes incluyendo fronteras claro fibra resultantes de seccionar el artefacto. El impacto de estos artefactos puede minimizarse a través de la sección cuidado y examen vigilante de la sección procesada antes del análisis. En particular, menos óptima segmentación puede eludirse a través de múltiples rondas de reclasificación en la misma imagen para conseguir más contraste.
El paso más crucial en nuestro protocolo se paso 4.2 en el que estipulan las áreas celulares y extracelulares de la sección dibujando una línea en una fibra determinada, distinguir de tal modo un área "clase 2" o "clase 1". Evidentemente, esta distinción manual es fundamental porque determina los límites de las fibras musculares; un error en este paso afectará negativamente la evaluación de las dimensiones de la fibra.
En este estudio, hemos sondeado las secciones de sola MyHC en una sección dada de la serie. Sin embargo, algunas fibras, como las fibras híbridas, expresan dos tipos de MyHC, indicativo de superposición de perfiles metabólicos funcionales (p. ej., tipo IIX y tipo IIB). Así, las fracciones de fibra tipo sumadas a un valor > 1 para el sóleo y tibial anterior (figura 4A). Las fibras híbridas pueden ser identificadas con doble o incluso triple-, etiquetado protocolos tales como los descritos por Lee et al. 7y Bloemberg y Quadrilatero5, respectivamente. Lo importante, nuestro método de análisis puede aplicarse a estos protocolos de tinción más complejos. Otra limitación de nuestro protocolo es que no es completamente automática; sin embargo, creemos que esta concesión menor asegura que nuestro método no compromete el rigor por el bien de velocidad.
Mientras que las composiciones de MyHC de los músculos sóleo y tibial anteriores observadas en este estudio reflejan los resultados de anteriores estudios5,6,7,10,14 , hay algunos contrasta con estudios anteriores sobre la evaluación de la CSA. Por ejemplo, nuestras mediciones de CSA promedio son algo menores que los reportados por Bloemberg y Quadrilatero5 y Allen et al. 15 en particular, nuestras mediciones de CSA oscilan entre 539.86 ± 24.44 μm2 y 1319.50 ± 57.47 μm2 tipos de fibra mientras ellos abarcó aproximadamente 735.7 ± 31,2 μm2 a 3073.8 ± 51,3 μm2. Sin embargo, nuestros valores más de cerca se asemejan a los observados por Augusto et al. 13 y Lucas et al. 6 que media CSAs desde 436 ± 605 μm2 2404 ± 412.5 μm2 815 ± 221 μm2 1904 ± 570 μm2, respectivamente. Así, cierta variabilidad en el análisis morfométrico de las fibras de trasera de ratón existe a través de la literatura.
Inmunohistoquímica presenta una manera eficiente de etiquetar y clasificar las fibras musculares en base a su contenido de MyHC. Cuantificación exacta de immunohistochemical experimentos es esencial para hacer conclusiones significativas sobre los datos; para ello, un método el cual puede automatizan las partes tediosas de análisis es útil, especialmente cuando cientos o incluso miles, de fibras deben ser medidos y clasificados. Además de proporcionar mediciones similares a las observaciones manual, nuestro algoritmo proporciona una evaluación precisa de los datos sin prejuicios; esta ventaja sobre mediciones manuales garantiza rigor científico. En este sentido, nuestra metodología puede ser útil en la caracterización de los efectos de manipulaciones experimentales y genéticos que afectan la integridad del músculo. Específicamente, immunohistochemistry de MyHC juntada con nuestro método de análisis rápido puede emplearse para evaluar los cambios morfológicos y metabólicos en el músculo de los modelos de enfermedad como distrofias musculares, ALS y cáncer caquexia. Por otra parte, se puede evaluar la eficacia de las intervenciones que prevenir atrofia o causar hipertrofia.
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Disclosures
Los autores tienen intereses contradictorios a revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a la Fundación Boettcher y la Asociación de Esclerosis Lateral Amiotrófica (#17-II-344) su apoyo a esta investigación.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9418-100G | 5% in PBS |
| Hydrophobic Barrier Pap Pen | Scientific Device Laboratory | 9804-02 | |
| Microscope Slides | Globe Scientific | 1358W | |
| Coverglass | Fisher Scientific | 12-544-E | |
| Immumount | Thermo Scientific | 9990402 | |
| Nail Polish | L'Oreal | ||
| Nikon Eclipse TE-200 Inverted Fluorescence and Brightfield Microscope | Discontinued | ||
| SPOT RT/KE | SPOT Imaging Solutions | RT940 | |
| Dell Optiplex | |||
| BA-F8 Primary Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa | monoclonal mouse IgG2b; 1:50 | |
| SC-71 Primary Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa | monclonal mouse IgG1; 1:50 | |
| BF-F3 Primary Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa | monoclonal mouse IgGM; 1:50 | |
| 6H1 Primary Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa | monoclonal mouse IgGM; 1:50 | |
| Alexa Fluor 594 anti-IgG2b | Invitrogen | A21145 | goat anti-mouse; 1:200 |
| Alexa Fluor 488 anti-IgG1 | Invitrogen | A21121 | goat anti-mouse;1:200 |
| Alexa Fluor 594 anti-IgGM | Invitrogen | A21044 | goat anti-mouse;1:200 |
| OCT | Sakura Finetek | 4583 | |
| isopentane | Fisher Scientific | O3551-4 | cool with liguid nitrogen |
| PBS | Fisher Bioreagents | BP665-1 | 10x, dilute to 1x |
| Kim wipes | Kimberly-Clark | 06-666A |
References
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