Summary
Immunohistochemical मायोसिन भारी श्रृंखला isoforms के दाग कंकाल मांसपेशी फाइबर के राज्य के अत्याधुनिक भेदभाव के रूप में उभरा है-प्रकार (ie., प्रकार मैं, प्रकार आईआईए, प्रकार IIX, प्रकार IIB) । यहाँ, हम फाइबर प्रकार और फाइबर आकृति विज्ञान के तेजी से आकलन की सुविधा है कि एक उपंयास अर्द्ध स्वचालित एल्गोरिथ्म के साथ एक दाग प्रोटोकॉल उपस्थित ।
Abstract
साल के लिए, कंकाल मांसपेशी फाइबर प्रकार के बीच भेद सबसे अच्छा मायोसिन-ATPase धुंधला द्वारा visualized थे । हाल ही में, immunohistochemical मायोसिन भारी श्रृंखला के दाग (MyHC) isoforms फाइबर के एक महीन भेदभाव के रूप में उभरा है प्रकार । प्रकार I, प्रकार आईआईए, प्रकार IIX और प्रकार IIB फाइबर अब उनके MyHC प्रोफ़ाइल के आधार पर परिशुद्धता के साथ पहचाना जा सकता है; हालांकि, इन आंकड़ों के मैनुअल विश्लेषण धीमी और नीचे सही थकाऊ जा सकता है । इस संबंध में, फाइबर प्रकार संरचना और आकृति विज्ञान के तेजी से सटीक आकलन एक बहुत ही वांछनीय उपकरण है । यहां, हम राज्य के अत्याधुनिक immunohistochemical के लिए एक प्रोटोकॉल वर्तमान एक उपंयास अर्द्ध स्वचालित एल्गोरिथ्म है कि फाइबर प्रकार और फाइबर आकृति विज्ञान के विश्लेषण में तेजी लाने के साथ समारोह में माउस hindlimb मांसपेशी से प्राप्त जमे हुए वर्गों में MyHCs के धुंधला । के रूप में की उंमीद है, soleus मांसपेशी प्रकार मैं और प्रकार आईआईए फाइबर के लिए दाग प्रदर्शित, लेकिन प्रकार IIX या प्रकार IIB फाइबर के लिए नहीं । दूसरी ओर, tibialis पूर्वकाल मांसपेशी प्रकार IIX और प्रकार IIB फाइबर, प्रकार आईआईए फाइबर और कम या कोई प्रकार मैं फाइबर का एक छोटा सा अंश की मुख्य रूप से बना था । कई छवि रूपांतरणों फाइबर आकृति विज्ञान के विभिन्न पहलुओं (यानी, पार अनुभागीय क्षेत्र (CSA), अधिक से अधिक और न्यूनतम Feret व्यास) को मापने के प्रयोजन के लिए संभाव्यता नक्शे उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया गया. इन पैरामीटर्स के लिए प्राप्त मानों को तब मैंयुअल रूप से प्राप्त मानों से तुलना किया गया था । CSA, अधिक से अधिक या न्यूनतम Feret व्यास (सभी p & #62; ०.०५) के संबंध में विश्लेषण के किसी भी मोड के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं देखा गया, जो हमारी विधि की सटीकता का संकेत देता है । इस प्रकार, हमारे immunostaining विश्लेषण प्रोटोकॉल उंर बढ़ने और मायोपथी के कई मॉडलों में मांसपेशी संरचना पर प्रभाव की जांच करने के लिए लागू किया जा सकता है ।
Introduction
यह कुछ समय के लिए ज्ञात किया गया है कि कंकाल की मांसपेशी कई प्रकार के एक फाइबर से बना है1. शुरू में, फाइबर के दो समूहों उनके सिकुड़ा गुण और नाम, उचित रूप में, धीमी गति से चिकोटी (प्रकार मैं) और तेजी से चिकोटी (प्रकार द्वितीय) के आधार पर विशेषता थे । इन श्रेणियों के आगे फाइबर चयापचय के आधार पर प्रतिष्ठित किया गया । चूंकि प्रकार मैं फाइबर oxidative चयापचय पर mitochondria और निर्भर में अमीर हैं, वे मजबूती से सकारात्मक nicotinamide द्वारा आविर्भाव किया गया adenine dinucleotide-tetrazolium रिडक्टेस (नध-TR) diaphorase2 या succinate डिहाइड्रोजनेज (SDH)3 दाग. इसके विपरीत, प्रकार द्वितीय फाइबर नध के कम और चर डिग्री का प्रदर्शन-TR diaphorase या SDH धुंधला और दो तेजी से चिकोटी उपसमूह (प्रकार आईआईए और प्रकार IIB) में विभाजित किया गया कुछ हद तक कच्चे अपने रिश्तेदार oxidative क्षमताओं पर आधारित है । फाइबर के बीच ये भेद मायोसिन-ATPase धुंधला जहां प्रकार मैं एक पूर्व के बाद अंधेरे दाग फाइबर द्वारा और अधिक प्रभावी ढंग से कल्पना की गई है पीएच ४.० और प्रकार IIB फाइबर अवशोषित प्रकार आईआईए फाइबर के साथ पीएच १०.० पर पूर्व की गर्मी के बाद वेग सना हुआ मध्यवर्ती4.
हाल ही में, मायोसिन भारी श्रृंखला (MyHC) isoforms के immunohistochemical धुंधला फाइबर के एक महीन भेदभाव के रूप में उभरा है-प्रकार5। प्रकार मैं, प्रकार आईआईए और प्रकार IIB फाइबर सभी परिशुद्धता के साथ उनकी MyHC प्रोफ़ाइल के आधार पर पहचान की जा सकती है । इसके अलावा, एक और तेज-चयापचय मध्यवर्ती फाइबर प्रकार, प्रकार IIX,6की पहचान की गई है चिकोटी । संकर फाइबर एक से अधिक MyHC एक्सप्रेस भी5,7,8की पुष्टि की गई है । कुछ प्रजातियों जैसे बिल्ली और लंगूर को व्यक्त नहीं करने के लिए जाना जाता है प्रकार IIB MyHCs6। हालांकि MyHC immunostaining वर्तमान में मांसपेशी संरचना के राज्य के अत्याधुनिक आकलन है, इस तकनीक के माध्यम से प्राप्त डेटा का विश्लेषण बोझिल और समय लेने वाली स्वचालित सहायता के बिना है । इस अंत करने के लिए, अर्द्ध स्वचालित तरीकों का एक मुट्ठी भर इन आंकड़ों का विश्लेषण करने के लिए5,9,10विकसित किया गया है । यहां, हम मांसपेशी फाइबर की immunohistochemical पहचान के लिए एक अपेक्षाकृत मानक प्रोटोकॉल मौजूद-प्रकार5,7,8,10, साथ एक उपंयास अर्द्ध स्वचालित एल्गोरिथ्म कि फाइबर के विश्लेषण में तेजी लाने के प्रकार और सटीकता के साथ फाइबर आकृति विज्ञान.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
- एयर-ड्राई जमे हुए वर्गों के माउस hindlimb मांसपेशी ( जैसे , tibialis पूर्वकाल, soleus) पर चढ़कर के लिए चार्ज स्लाइड ~ 30 मिनट < सुप वर्ग = "xref" > ११ . एक hydrophobic बैरियर पीएपी पेन का उपयोग कर वर्गों के चारों ओर एक सीमा ड्रा ।
- जगह ~ २५० & #181; एल के 5% BSA/फास्फेट बफर खारा (BSA/पंजाब) प्रत्येक स्लाइड पर गैर-विशिष्ट एंटीबॉडी बाइंडिंग को अवरोधित करने के लिए । 1 एच के लिए कमरे के तापमान पर स्लाइड की मशीन
- को अवरुद्ध करते हुए, 1 & #176 के 1:50 कमजोर पड़ने की तैयारी करें; एंटीबॉडी supernatant in 5% BSA/पंजाबियों (सभी माउस मोनोक्लोनल एंटीबॉडी रहे हैं; देखें तालिका 1 < सुप class = "xref" > 6 , < सुप class = "xref" > 12 ); तैयार २५० & #181; L के प्रति स्लाइड समाधान । रख 1 & #176; एंटीबॉडी स्टॉक्स और बर्फ पर कमजोर पड़ने.
तालिका 1: प्राथमिक एंटीबॉडी भेद करने के लिए इस्तेमाल किया MyHCs. < राजभाषा प्रारंभ = "4" >
नोट: एक पेट्री डिश भीगा हुआ फिल्टर कागज के साथ एल्यूमीनियम पंनी में शामिल एक उपयुक्त मशीन चैंबर के रूप में सेवा कर सकते हैं ।
- महाप्राण 1 & #176; एंटीबॉडी समाधान या नियंत्रण 5% BSA/ धो सभी स्लाइड तीन बार, 10 मिनट के साथ 5% BSA.
- करते समय, शुद्धि की 1:200 कमजोरियां तैयार करें, fluorophore-संयुग्मित 2 & #176; एंटीबॉडी 5% BSA/पंजाबियों में (देखें तालिका 2 , सभी बकरी विरोधी माउस हैं) । प्रति स्लाइड समाधान के २५० & #181; L तैयार करें । 2 & #176 रखें; fluorophore-बर्फ पर अंधेरे में संयुग्मित एंटीबॉडी.
तालिका 2: Fluorophore-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी एंटीबॉडी की प्राथमिक MyHCs मान्यता कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया. < राजभाषा प्रारंभ = "3" >
- एक छोटे, ७०% इथेनॉल से लथपथ प्रयोगशाला के साथ स्लाइड साफ-पोंछना.
- एक फोटोग्राफिक तंत्र से सुसज्जित एक epifluorescence माइक्रोस्कोप का उपयोग कर immunostained मांसपेशी वर्गों के डिजिटल छवियों को प्राप्त (सामग्री की तालिका देखें).
- लगभग 1 मिमी 2 (10x उद्देश्य, १.४ ना) के क्षेत्र का चयन करें ।
- देखें Alexa ४८८-संयुग्मित 2 & #176; एंटीबॉडी प्रतिदीप्ति एक ५०५ एनएम के माध्यम से लंबे समय से गुजारें फिल्टर । Alexa ५९४ के उत्तेजना द्वारा उत्पंन प्रतिदीप्ति देखें-संयुग्मित 2 & #176; एक ५९५ एनएम के माध्यम से एंटीबॉडी लंबे समय से गुजारें फिल्टर । एक संगत इमेजिंग सॉफ्टवेयर के साथ सुसज्जित एक पीसी कंप्यूटर के साथ छवियों डिजिटलीकरण. बाद में विश्लेषण के लिए इमेजिंग सॉफ़्टवेयर से स्केल बार शामिल करें ।
- किसी चयनित अनुभाग की brightfield छवि को फिजी में लोड कर रहा है । Plugins के लिए नेविगेट & #8594; फॉल्ट & #160; & #8594; अप्रशिक्षित Weka फॉल्ट.
- अनुभाग के सेलुलर क्षेत्रों को निर्धारित करने के लिए, एक फाइबर पर एक लाइन ड्रा, और क्लिक करें & #34; वर्ग 1 में जोड़ें & #34;. फिर, फाइबर के बीच अंतरिक्ष पर एक लाइन ड्रा, और क्लिक करें & #34; वर्ग 2 में जोड़ें & #34 extracellular डोमेन को चिह्नित करने के लिए; दोहराएं जब तक वहां प्रत्येक कक्षा में 5-10 लेबल हैं ।
- क्लिक लेल वर्गीकारक । परिणामी लाल और हरे ओवरले पर, अधिक लेबल मैंयुअल रूप से जोड़ें (चरण ४.२ देखें) यदि आवश्यक हो, तो छवि के टुकड़ों को गलत तरीके से विभाजित करने के लिए । दोहराएं जब तक तंतुओं (लाल) उचित फाइबर (हरा) के बीच अंतरिक्ष से अलग कर रहे हैं ।
- Click & #34; प्रायिकता प्राप्त करें & #34; और छवि को किसी नए लेबल वाले फ़ोल्डर में सहेजें.
- ऊपर प्रक्रिया दोहराने (चरण ४.२-४.३) फ्लोरोसेंट एक ही क्षेत्र से लिया छवि के साथ । लैबल immunostained फाइबर के रूप में & #34; वर्ग 1 & #34; और सभी गैर-फ्लोरोसेंट क्षेत्रों के रूप में & #34; वर्ग 2 & #34;. परिणामी प्रायिकता मैप को उसी फ़ोल्डर में सहेजें जहां संसाधित brightfield छवि संग्रहीत है ।
- फिजी में पहले से सहेजे गए प्रायिकता मैप्स में से एक खोलें । इमेजिंग सॉफ़्टवेयर द्वारा प्रदान किए गए स्केल बार पर एक सीधी रेखा आरेखित करना । गो श्लेष & #160; & #8594; सेट स्केल । पैरामीटर्स ( अर्थात , ज्ञात दूरी, लंबाई की इकाई) को स्केल बार द्वारा दिए गए अनुसार उनके उपयुक्त मानों में परिवर्तित करें, फिर प्रत्येक छवि के लिए स्केल का मानकीकरण करने के लिए & #34; Global & #34; बॉक्स को चेक करें.
- नेविगेट करने के लिए प्लगइंस & #160; & #8594; मैक्रोज़ & #160; & #8594; रन & #160; & #8594; त्यागी एट अल. फायबर ठहराव मैक्रो. ijm (देखें पूरक फ़ाइल ). तुरंत, नेविगेशन फलक दिखाई देगा । छवि & #39; s होस्ट फ़ोल्डर खोलें; एक संवाद बॉक्स दिखाई देगा । प्रत् येक संवाद बॉक् स के लि ए, & #34; पृष् ठभूमि & #34; ड्रॉपडाउन मान को & #34; Light. & #34;
नोट: फ़ोल्डर अब फाइबर रूपरेखा की छवियों के साथ आबाद हो जाएगा और स्प्रेडशीट परिणामों के सॉफ्टवेयर फ़ाइलें (CSA और Feret व्यास सबसे अधिक प्रासंगिक हैं फाइबर आकृति विज्ञान को बढ़ाता; मापा मापदंडों का विश्लेषण सेट माप में समायोजित किया जा सकता है) । फिजी के ताकना-विश्लेषण समारोह द्वारा उत्पंन फाइबर आकृति विज्ञान डेटा स्वचालित रूप से दोनों फ्लोरोसेंट और चमकीले क्षेत्र छवियों के लिए स्प्रेडशीट सॉफ्टवेयर फ़ाइलों को हस्तांतरित किया जाएगा । - इसी उज्ज्वल क्षेत्र छवि में कुल फाइबर की संख्या से क्षेत्र में फ्लोरोसेंट फाइबर की संख्या विभाजित करके एक क्षेत्र में एक दिया MyHC व्यक्त फाइबर के अंश की गणना.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hindlimb मांसपेशियों (यानी, tibialis पूर्वकाल, soleus) एक पुरुष C57BL से विच्छेदित/अज्ञात उंर के 6 चूहे एक प्लास्टिक तरल नाइट्रोजन में अक्टूबर यौगिक में मांसपेशी-ठंडा isopentane युक्त मोल्ड डूब द्वारा जमे हुए थे । फिर, एक cryotome का उपयोग कर, 8-10 µm धारावाहिक वर्गों में कटौती की गई थी-20 ° c और अलग सकारात्मक आरोप लगाया ग्लास स्लाइड12पर स्थानांतरित ।
हम tibialis पूर्वकाल और soleus चुना है क्योंकि इन मांसपेशियों को मुख्य रूप से तेजी से बना रहे है और धीमी गति से चिकोटी फाइबर, क्रमशः13,14। immunohistochemical के बाद व्यक्तिगत प्रकार मैं, आईआईए, IIX और IIB MyHCs, brightfield और फ्लोरोसेंट छवियों के लिए दाग पर कब्जा कर लिया गया । चित्रा 1 के बाएं पैनलों प्रकार मैं, आईआईए, IIX और IIB MyHC-विशिष्ट एंटीबॉडी 1 तालिकामें सूचीबद्ध के साथ immunostained एक soleus मांसपेशी के वर्गों दिखाओ ।
चित्र 1 : MyHC टाइप के Immunohistochemical धुंधलान I, आईआईए, IIX और IIB में माउस soleus मांसपेशी । वाम पैनलों फ्लोरोसेंट एक माउस soleus मांसपेशी प्राथमिक प्रकार मैं (BA-F8 निर्देशित एंटीबॉडी के साथ जांच के वर्गों से प्राप्त छवियां दिखाएं; A), प्रकार आईआईए (SC-७१; B), प्रकार IIX (6H1; ग) और प्रकार IIB (BF-F3; घ) MyHCs । दायां पैनल उन अनुभागों को दिखाते है जिनमें संगत बाएं फलक में दर्शाए गए प्रयोग में प्राथमिक एंटीबॉडी का लोप किया गया था । सलाखों = १०० µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
विशेष रूप से, हम प्रकार मैं (चित्रा 1एक, बाएँ) और प्रकार आईआईए MyHCs (चित्रा 1बी, शेष फाइबर प्रकार के लिए सकारात्मक दाग प्रदर्शित की एक निष्पक्ष राशि के साथ छोड़ दिया) व्यक्त तंतुओं के पर्याप्त अंश मनाया IIX MyHCs (चित्रा १सी, लेफ्ट). इसके विपरीत, वस्तुतः कोई प्रकार IIB फाइबर स्पष्ट थे (चित्रा 1डी, छोड़ दिया) । इन टिप्पणियों soleus मांसपेशियों ज्यादातर प्रकार मैं, प्रकार आईआईए और प्रकार IIX फाइबर (कम तो) के साथ लगभग कोई प्रकार IIB फाइबर5,10,12से बना रहे हैं कि पहले की रिपोर्ट के साथ संगत कर रहे हैं. महत्वपूर्ण बात, कोई धुंधला वर्गों में देखा गया था जिसमें प्राथमिक एंटीबॉडी प्रोटोकॉल से लोप किया गया था, एंटीबॉडी की विशिष्टता का प्रदर्शन (चित्रा 1ए डी, सही पैनलों).
चित्र 2 : Immunohistochemical MyHC प्रकार के दाग IIB, IIX, आईआईए और मैं माउस tibialis पूर्वकाल मांसपेशी में । वाम पैनलों फ्लोरोसेंट एक माउस के वर्गों से प्राप्त छवियों को दिखाने tibialis पूर्वकाल मांसपेशी प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ जांच के लिए टाइप IIB (a), प्रकार IIX (B), प्रकार आईआईए (C) और प्रकार मैं (D) MyHCs । दायां पैनल उन अनुभागों को दिखाता है जिनमें सन्निकट बाएँ फलक में दर्शाए गए प्रयोग में प्रयुक्त प्राथमिक एंटीबॉडी का लोप किया गया था. सलाखों = १०० µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
हम भी aforementioned एंटीबॉडी के साथ tibialis पूर्वकाल मांसपेशियों दाग । Tibialis पूर्वकाल मांसपेशियों ज्यादातर प्रकार के IIB और प्रकार IIX MyHC-सकारात्मक तंतुओं (चित्रा 2A-B, बाएँ पैनलों) फाइबर से छोटे योगदान के साथ व्यक्त प्रकार आईआईए MyHCs (चित्रा 2सी, वाम) से बना रहे थे; वस्तुतः कोई प्रकार मैं MyHC व्यक्त तंतुओं (चित्रा 2डी, छोड़ दिया) मनाया गया । हमारे डेटा का संकेत है कि माउस tibialis पूर्वकाल मुख्य रूप से तेजी से चिकोटी प्रकार आईआईए, प्रकार IIB और प्रकार IIX फाइबर के पहले अध्ययन के साथ संगत कर रहे है बना है5,10,13। फिर, कोई दाग वर्गों जिसमें प्राथमिक एंटीबॉडी प्रोटोकॉल (चित्रा 2ए डी, सही पैनलों) से लोप किया गया था में मनाया गया ।
चित्र 3 : दोहराया कंप्यूटरीकृत फाइबर विभाजन । Brightfield एक माउस की छवि tibialis पूर्वकाल खंड (a) । हमारे अर्द्ध स्वचालित एल्गोरिथ्म (ख) का उपयोग कर एक ही छवि के परिवर्तन । एक ही खंड के फ्लोरोसेंट छवि प्रकार आईआईए MyHC के immunostaining दिखा (ग) । परिवर्तन छवि केवल प्रकार आईआईए MyHC-व्यक्त तंतुओं (D) दिखा रहा है । सलाखों = १०० µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
morphometric विश्लेषण के प्रयोजन के लिए, immunostained क्षेत्रों के brightfield छवियों को भी प्राप्त किया गया । चित्रा 3ए में दिखाया उदाहरण एक tibialis पूर्वकाल मांसपेशी धारा से है अनुसूचित जाति के साथ जांच-७१ एंटीबॉडी आईआईए MyHCs13प्रकार के निर्देश दिए । हमारे मूल अर्द्ध स्वचालित एल्गोरिथ्म का उपयोग कर, कई छवि रूपांतरणों brightfield छवियों से संभाव्यता नक्शे उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया गया. चित्रा 3ए में दिखाया brightfield छवि से व्युत्पंन एक ठेठ छवि परिवर्तन चित्रा 3बीमें प्रस्तुत किया है । परिवर्तन और फिजी की ताकना विश्लेषण समारोह का उपयोग करना, हम मापा मतलब CSA (८९१.४ ± ४५.० µm2), अधिकतम (४६.९ ± १.३ µm) और ंयूनतम (२६.० ± ०.८ µm) मतलब क्षेत्र में प्रत्येक फाइबर के Feret व्यास । हमारे माप की निष्ठा का परीक्षण करने के लिए, हम भी brightfield छवि में इन मापदंडों को मैंयुअल रूप से मूल्यांकन किया । मतलब CSA (८६७.० ± ५२.० µm2), अधिकतम (४५.७ ± ३.५ µm) और न्यूनतम (२५.६ ± १.९ µm) मतलब Feret व्यास अधिक थकाऊ मैनुअल अधिग्रहण विधि का उपयोग कर प्राप्त अर्द्ध स्वचालित विधि से काफी अलग नहीं थे (सभी p & #62; ०.०५, ख़राब टी-टेस्ट; तालिका 3) ।
= "//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56024/56024table3.jpg"/>
तालिका 3: प्रकार मैं, आईआईए, IIB और IIX MyHCs के रूप में मैनुअल और अर्द्ध स्वचालित विश्लेषणात्मक तरीकों द्वारा निर्धारित के लिए tibialis पूर्वकाल मांसपेशी immunostained की फाइबर आकृति विज्ञान और संरचना. मतलब फाइबर CSA, Feret व्यास और एक माउस में MyHC प्रकार का मतलब है tibialis द्वारा प्रस्तुत एल्गोरिथ्म बनाम पारंपरिक मैनुअल मूल्यांकन के माध्यम से पूर्वकाल मात्रा । कृपया ध्यान दें कि संयुक्त अंशों एक से अधिक MyHC प्रकार व्यक्त तंतुओं की उपस्थिति के कारण 1 के एक मूल्य से अधिक है ।
चित्र 3 सी आईआईए MyHCs प्रकार के लिए निर्देशित एंटीबॉडी के साथ एक ही क्षेत्र immunostained के एक फ्लोरोसेंट छवि से पता चलता है । क्षेत्र में सकारात्मक दाग फाइबर संख्या (चित्रा 3डी) द्वारा चयनित थे और brightfield परिवर्तन क्षेत्र में फाइबर की कुल संख्या के द्वारा विभाजित द्वारा प्रकार आईआईए MyHC-व्यक्त फाइबर के अंश का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया (तालिका 3 ). इस प्रकार आईआईए तंतुओं के औसत CSA, अधिकतम और न्यूनतम Feret व्यास का मूल्यांकन तो किया गया (तालिका 3) । प्रकार मैं, प्रकार IIX और प्रकार IIB फाइबर, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अपने आयामों के अनुपात, बीए के साथ धारावाहिक वर्गों immunostained में इस प्रोटोकॉल दोहरा द्वारा निर्धारित किया गया-F8, 6H1 और BF-F3 एंटीबॉडी, क्रमशः6,12(तालिका 4 ; चित्र 4 A-D) ।
तालिका 4: माउस में MyHC सामग्री और आकृति विज्ञान soleus और tibialis पूर्वकाल. soleus और tibialis पूर्वकाल के प्रतिनिधि वर्गों की फाइबर प्रकार रचनाएं । ठहराव का औसत CSA, टाइप I के न्यूनतम और अधिक से अधिक Feret व्यास, टाइप आईआईए, टाइप IIX और टाइप IIB दोनों में soleus और tibialis पूर्वकाल दिखाया गया है । डाटा अर्थ ± SEM के रूप में दिया जाता है ।
हम भी एक soleus मांसपेशी से प्राप्त क्षेत्र में इन मापदंडों का आकलन (तालिका 4; चित्र 4 A-D) । ३,०५२ और २,८७६ व्यक्तिगत तंतुओं tibialis पूर्वकाल और soleus मांसपेशियों, क्रमशः के लिए गिना गया । एक साथ लिया, इन आंकड़ों फाइबर प्रकार और morphometric विश्लेषण में हमारे विधि की व्यवहार्यता प्रदर्शित करता है ।
चित्र 4 : Morphometric विश्लेषण डेटा सारांश. फाइबर-tibialis पूर्वकाल और soleus मांसपेशियों (ए) के प्रतिनिधि वर्गों के प्रकार रचनाओं. प्रकार I के औसत CSA, minimimal और अधिक से अधिक Feret व्यास का ठहराव, टाइप आईआईए, टाइप IIX और टाइप IIB fivers दोनों में tibialis anteriort और soleus में दर्शाए गए हैं (B-D) । डाटा अर्थ ± SEM के रूप में दिया जाता है । tibialis पूर्वकाल और soleus के बीच महत्वपूर्ण अंतर संकेत कर रहे हैं (* नोट p & #60; ०.०५: * * नोट p & #60; ०.०१; * * * नोट p & #60; ०.००५; t-test). ३,०५२ और २,८७६ व्यक्तिगत तंतुओं tibialis पूर्वकाल और soleus मांसपेशियों, क्रमशः के लिए गिना गया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
पूरक फ़ाइल: फाइबर ठहराव मैक्रो. इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
यहाँ, हम कंकाल मांसपेशी फाइबर प्रकार की पहचान के लिए उपयोगी दिशा प्रदान की है । ऐसा करने में, हम डेटा के विश्लेषण के लिए एक उपंयास एल्गोरिथ्म का वर्णन ।
हमारे परिणामों के बाद से मोटे तौर पर पिछले रिपोर्टों के उन5,8,10 की पुष्टि और हमारे अपने मैनुअल माप को प्रतिबिंबित, एल्गोरिथ्म सही प्रतीत होता है । फिर भी, हम अस्पष्ट फाइबर विरूपण साक्ष्य के परिणामस्वरूप सीमाओं सहित कुछ निराला प्रयोगात्मक नुकसान का सामना करना पड़ा । इन कलाकृतियों के प्रभाव को विश्लेषण करने से पहले संसाधित अनुभाग के सावधान अनुभाग और सजग परीक्षा के माध्यम से कम किया जा सकता है । विशेष रूप से, कम से इष्टतम छवि विभाजन एक ही छवि पर reवर्गीकरण के कई दौर के माध्यम से दरकिनार किया जा सकता है तेज विपरीत प्राप्त करने के लिए ।
हमारे प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण कदम चरण ४.२ जिसमें हम एक दिया फाइबर पर एक लाइन ड्राइंग द्वारा खंड के सेलुलर और extracellular क्षेत्रों निर्धारित है, जिससे एक "वर्ग 1" या "वर्ग 2" क्षेत्र भेद है । जाहिर है, इस मैनुअल भेद महत्वपूर्ण है क्योंकि यह मांसपेशी फाइबर की सीमाओं को निर्धारित करता है; इस चरण में कोई त्रुटि फाइबर आयाम के आकलन को प्रतिकूल रूप से प्रभावित करेगी ।
इस अध्ययन में, हम एक दिए गए धारावाहिक अनुभाग में केवल एक MyHC के लिए वर्गों की जांच की । हालांकि, कुछ फाइबर, जैसे संकर फाइबर, MyHC के दो प्रकार व्यक्त, अतिव्यापी चयापचय का संकेत/कार्यात्मक प्रोफाइल (उदा., प्रकार IIX और प्रकार IIB) । इस प्रकार, फाइबर के अंश-प्रकार एक मान के लिए अभिव्यक्त & #62; soleus और tibialis पूर्वकाल (चित्रा 4) दोनों के लिए 1. संकर फाइबर डबल के साथ पहचाना जा सकता है, या यहां तक कि ट्रिपल-, लेबलिंग प्रोटोकॉल ऐसे ली एट अल द्वारा वर्णित के रूप में । 7और Bloemberg और Quadrilatero5, क्रमशः । महत्वपूर्ण बात, विश्लेषण के हमारे विधि इन अधिक जटिल दाग प्रोटोकॉल के लिए लागू किया जा सकता है । हमारे प्रोटोकॉल की एक और सीमा है कि यह पूरी तरह से स्वचालित नहीं है; हालांकि, हमें विश्वास है कि यह मामूली रियायत सुनिश्चित करती है कि हमारी विधि गति के लिए कठोरता से समझौता नहीं करता है ।
जबकि इस अध्ययन में मनाया दोनों soleus और tibialis पूर्वकाल मांसपेशियों की MyHC रचनाओं पिछले अध्ययन के परिणामों को प्रतिबिंबित5,6,7,10,14 , CSA के मूल्यांकन के बारे में पहले के अध्ययनों के साथ कुछ विरोधाभासों हैं । उदाहरण के लिए, औसत CSA के हमारे माप या तो Bloemberg और Quadrilatero5 और एलन एट अलद्वारा सूचित उन लोगों से कुछ छोटे हैं । 15 विशेष रूप से, हमारे CSA माप ५३९.८६ ± २४.४४ µm2 से लेकर १३१९.५० ± ५७.४७ µm फाइबर प्रकार भर में2 whilst उनके मोटे तौर पर फैले ७३५.७ ± ३१.२ µm2 ३०७३.८ ± ५१.३ µm2के लिए । हालांकि, हमारे मूल्यों को और अधिक बारीकी से Augusto एट अल द्वारा मनाया उन जैसा दिखता है । 13 और लुकास एट अल । 6 जो की सूचना दी औसत CSAs से लेकर ४३६ ± ६०५ µm2 से २४०४ ± ४१२.५ µm2 और ८१५ ± २२१ µm2 १९०४ ± ५७० µm2, क्रमशः । इस प्रकार, माउस hindlimb तंतुओं के morphometric विश्लेषण में कुछ परिवर्तनशीलता साहित्य भर में मौजूद है ।
Immunohistochemistry लेबल और उनके MyHC सामग्री के आधार पर मांसपेशी फाइबर वर्गीकृत करने के लिए एक कुशल तरीका प्रस्तुत करता है । immunohistochemical प्रयोगों का सटीक ठहराव डेटा के बारे में सार्थक निष्कर्ष बनाने के लिए आवश्यक है; इस अंत करने के लिए, एक तरीका है जो विश्लेषण के थकाऊ भागों को स्वचालित कर सकते है एक उपयोगी एक है, खासकर जब सैकड़ों, या हजारों, फाइबर की जरूरत है मापा और वर्गीकृत । मैनुअल टिप्पणियों के समान माप प्रदान करने के अलावा, हमारे एल्गोरिथ्म पूर्वाग्रह के बिना इन डेटा का एक सटीक आकलन प्रदान करता है; मैनुअल माप पर यह लाभ वैज्ञानिक कठोरता सुनिश्चित करता है । इस संबंध में, हमारी कार्यप्रणाली आनुवंशिक और प्रयोगात्मक जोड़तोड़ के प्रभाव के लक्षण वर्णन है कि प्रभाव मांसपेशियों की अखंडता में उपयोगी हो सकता है । विशेष रूप से, MyHC immunohistochemistry तेजी से विश्लेषण की हमारी विधि के साथ युग्मित इस तरह के पेशी dystrophies, एस और कैंसर cachexia के रूप में रोग मॉडल की मांसपेशी में रूपात्मक और चयापचय परिवर्तन का आकलन करने के लिए नियोजित किया जा सकता है । इसके अलावा, जो शोष या कारण अतिवृद्धि को रोकने के उपायों की प्रभावकारिता भी मूल्यांकन किया जा सकता है ।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
लेखकों के पास कोई परस्पर विरोधी हितों का खुलासा नहीं है.
Acknowledgments
हम इस अनुसंधान के उनके समर्थन के लिए Boettcher फाउंडेशन और पेशीशोषी पार्श्व स्केलेरोसिस एसोसिएशन (#17-II-३४४) के लिए आभारी हैं ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9418-100G | 5% in PBS |
| Hydrophobic Barrier Pap Pen | Scientific Device Laboratory | 9804-02 | |
| Microscope Slides | Globe Scientific | 1358W | |
| Coverglass | Fisher Scientific | 12-544-E | |
| Immumount | Thermo Scientific | 9990402 | |
| Nail Polish | L'Oreal | ||
| Nikon Eclipse TE-200 Inverted Fluorescence and Brightfield Microscope | Discontinued | ||
| SPOT RT/KE | SPOT Imaging Solutions | RT940 | |
| Dell Optiplex | |||
| BA-F8 Primary Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa | monoclonal mouse IgG2b; 1:50 | |
| SC-71 Primary Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa | monclonal mouse IgG1; 1:50 | |
| BF-F3 Primary Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa | monoclonal mouse IgGM; 1:50 | |
| 6H1 Primary Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa | monoclonal mouse IgGM; 1:50 | |
| Alexa Fluor 594 anti-IgG2b | Invitrogen | A21145 | goat anti-mouse; 1:200 |
| Alexa Fluor 488 anti-IgG1 | Invitrogen | A21121 | goat anti-mouse;1:200 |
| Alexa Fluor 594 anti-IgGM | Invitrogen | A21044 | goat anti-mouse;1:200 |
| OCT | Sakura Finetek | 4583 | |
| isopentane | Fisher Scientific | O3551-4 | cool with liguid nitrogen |
| PBS | Fisher Bioreagents | BP665-1 | 10x, dilute to 1x |
| Kim wipes | Kimberly-Clark | 06-666A |
References
- Engel, W. K. The essentiality of histo- and cytochemical studies of skeletal muscle in the investigation of neuromuscular disease. Neurol. 12, 778-784 (1962).
- Dobrowolny, G., et al. Skeletal muscle is a primary target of SOD1G93A-mediated toxicity. Cell Metab. 8, 425-436 (2008).
- Sultana, N., et al. Restricting calcium currents is required for correct fiber type specification in skeletal muscle. Development. 143 (9), 1547-1559 (2016).
- Guth, L., Samaha, F. J. Procedure for the histochemical demonstration of actomyosin ATPase. Exp Neurol. 28 (2), 365-367 (1970).
- Bloemberg, D., Quadrilatero, J. Rapid determination of myosin heavy chain expression in rat, mouse, and human skeletal muscle using multicolor immunofluorescence analysis. PLoS One. 7 (4), (2012).
- Lucas, C. A., Kang, L. H., Hoh, J. F. Monospecific antibodies against the three mammalian fast limb myosin heavy chains. Biochem Biophys Res Commun. 272 (1), 303-308 (2000).
- Lee, C. S., et al. Ca2+ permeation and/or binding to Cav1.1 fine-tunes skeletal muscle Ca2+ signaling to sustain muscle function. Skelet Muscle. 5 (4), (2015).
- Sawano, S., et al. A one-step immunostaining method to visualize rodent muscle fiber type within a single specimen. PLoS One. 11 (11), (2016).
- Meunier, B., Picard, B., Astruc, T., Labas, R. Development of image analysis tool for the classification of muscle fibre type using immunohistochemical staining. Histochem Cell Biol. 134 (3), 307-317 (2010).
- Kammoun, M., Casser-Malek, I., Meunier, B., Picard, B. A simplified immunohistochemical classification of skeletal muscle fibres in mouse. Eur J Histochem. 58 (2), 2254 (2014).
- Kumar, A., Accorsi, A., Rhee, Y., Girgenrath, M. Do's and don'ts in the preparation of muscle cryosections for histological analysis. J Vis Exp. (99), (2015).
- Schiaffino, S., et al. Three myosin heavy chain isoforms in type 2 skeletal muscle fibres. J Muscle Res Cell Motil. 10 (197), (1989).
- Augusto, V., Padovani, C. R., Campos, G. E. R. Skeletal muscle fiber types in C57Bl6j mice. Braz J Morphol Sci. 21 (2), 89-94 (2004).
- Schiaffino, S., Reggiani, C. Fiber types in mammalian skeletal muscles. Physiol Rev. 91 (4), 1447-1531 (2011).
- Allen, D. L., Harrison, B. C., Maass, A., Bell, M. L., Byrnes, W. C., Leinwand, L. A. Cardiac and skeletal muscle adaptations to voluntary wheel running in the mouse. J Appl Physiol. 90 (5), 1900-1908 (2001).
