Summary
Immunohistochemical farging av myosin tunge kjeden isoformene har dukket opp som den state-of-the-art diskriminator skjelettlidelser muskel fiber-type (dvs.type I-, skriver IIA, Skriv inn IIX, skriver IIB). Her presenterer vi en fargeprotokoll sammen med en roman halvautomatisk algoritme som muliggjør rask vurdering av fiber-type og fiber morfologi.
Abstract
I år, var det beste visualisere forskjellene mellom skjelettlidelser muskel fiber av myosin-ATPase flekker. Nylig har immunohistochemical farging av myosin tunge kjede (MyHC) isoformene framstått som en finere diskriminator fiber-type. Type I, type IIA, skriver IIX og type IIB Fibre kan nå bli identifisert med presisjon sine MyHC profiler; men manuelle analyser av disse dataene kan være langsom og ned-høyre kjedelig. I denne forbindelse, er rask, nøyaktig vurdering av fiber-type sammensetning og morfologi et svært ønskelig verktøy. Her presenterer vi en protokoll for state-of-the-art immunohistochemical farging av MyHCs i frosne snitt fra musen hindlimb muskler sammen med en roman halvautomatisk algoritme som akselererer analyse av fiber-type og fiber morfologi. Som forventet, soleus muskelen vises flekker type I og type IIA fibre, men ikke for typen IIX eller type IIB fibre. På den annen side, tibialis fremre muskelen besto hovedsakelig av typen IIX og type IIB fibre, en liten brøkdel av typen IIA fiber og lite eller ingen type jeg fibrer. Flere bilde transformasjoner ble brukt til å generere sannsynlighet kart for å måle ulike aspekter av fiber morfologi (i.e.tverrsnitt (CSA), maksimal og minimal Feret diameter). Verdiene innhentet for disse parameterne ble deretter sammenlignet med manuelt fått verdier. Ingen signifikante forskjeller ble observert mellom enten analyse med hensyn til CSA, maksimal eller minimal Feret diameter (alle p > 0,05), som angir nøyaktigheten av vår metode. Dermed kan våre immunostai-analyse-protokollen brukes å undersøke virkningene på muskel komposisjon i mange modeller av aldring og muskeldystrofi.
Introduction
Det har vært kjent en tid at Skjelettmuskel består av én fibre av mange typer1. I utgangspunktet to grupper av fibrene var preget basert på kontraktile egenskapene og kalt, riktig, bremse-trekning (type jeg) og raske-trekning (type II). Disse kategoriene videre ut basert på fiber metabolisme. Siden type jeg fibrer er rike på mitokondrier og avhengige oksidativt metabolisme, de var belyst av robust positiv nikotinamid adenine dinucleotide-tetrazolium reductase (NADH-TR) diaphorase2 eller succinate dehydrogenase (SDH)3 flekker. Derimot type II fibrer utstilt mindre og varierende grader av NADH-TR diaphorase eller SDH flekker og ble delt inn i to raske-trekning undergrupper (Skriv inn IIA og IIB) noe primitivt basert på deres relative oksidativt kapasiteter. Disse visualisere forskjellene mellom fiber har vært mer effektivt ved myosin-ATPase flekker hvor skriver jeg fiber flekker mørk etter en pre-inkubering ved pH 4.0 og type IIB fiber absorbere bunnfall følgende pre-inkubering ved pH 10.0 med type IIA fiber farging intermediately4.
Nylig har immunohistochemical farging av myosin tunge kjede (MyHC) isoformene framstått som en finere diskriminator fiber-type5. Type I, type IIA og type IIB Fibre kan alle identifiseres med presisjon sine MyHC profiler. I tillegg en annen raske-trekning metabolically mellomliggende fiber type, type IIX, har vært identifisert6. Hybrid fiber uttrykke flere MyHC har også blitt bekreftet5,7,8. Noen arter som katten og bavian er kjent for ikke å uttrykke Type IIB MyHCs6. Om MyHC immunostaining er state-of-the-art vurdering av muskel komposisjon, er analyse av dataene innhentet via denne teknikken tungvint og tidkrevende uten automatisert hjelp. Dette er en håndfull halvautomatisk metoder for å analysere disse dataene utviklet5,9,10. Her presenterer vi en relativt standardprotokoll for immunohistochemical identifikasjon av muskel fiber-type5,7,8,10, med en roman halvautomatisk algoritme som akselererer analyse av fiber-type og fiber morfologi med nøyaktighet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
alle prosedyrer som involverer mus ble godkjent av University of Colorado-Anschutz medisinsk Campus institusjonelle Animal Care og bruk Committee (91813(05)1D).
1. dag 1: primær (1°) Immunostaining med bovin Serum Albumin (BSA) blokkerer
- Air-dry frosne deler av musen hindlimb muskler (f.eks, tibialis fremre, soleus) montert på ladet lysbilder for ~ 30 min 11. tegne en kantlinje rundt delene bruke en hydrofobe barriere PAP.
- Sted ~ 250 µL 5% BSA/fosfat bufret saltoppløsning (BSA/PBS) på hvert lysbilde til å blokkere ikke-spesifikke antistoffer bindende. Inkuber lysbilder ved romtemperatur for 1 h.
- Mens blokkerer, forberede 1:50 fortynninger av 1° antistoffer supernatant på 5% BSA/PBS (alle er musen monoklonale antistoffer, se tabell 1 6 , 12); forberede 250 µL av løsning per lysbilde. Holde 1° antistoff aksjer og fortynninger på ice.
tabell 1: primære antistoffer brukes til å skille MyHCs.
- etter aspirasjon av 5% BSA/PBS blokkerer løsningen, legge til 250 µL av 1° antistoff fortynning aktuelle lysbildene. Legge til 250 µL på 5% BSA/PBS videregående (2°) antistoff-bare negative kontroll lysbilder.
- Incubate på 4 ° C i 24-48 timer i et fuktig miljø.
Merk: En Petriskål dekket i aluminiumsfolie med dempet filter papir kan tjene som en egnet inkubasjon kammer.
2. Dag 2:2 ° immunostai-med fluorescerende antistoffer
- Sug opp 1° antistoff løsning eller BSA/PBS kontrolløsning for 5%. Vask alle lysbilder tre ganger, 10 min med 5% BSA.
- Under vasking, forberede 1:200 fortynninger av renset, fluorophore-konjugerte 2 ° antistoffer i 5% BSA/PBS (se tabell 2, alle er geit anti-mus). Forberede 250 µL løsning per lysbilde. Holde 2° fluorophore-konjugerte antistoffer i mørket på ice.
tabell 2: Fluorophore-konjugerte sekundære antistoffer brukes til å visualisere primære antistoff anerkjennelse av MyHCs.
- etter aspirasjon av tredje 5% BSA/PBS blokkerer løsning, legge 250 µL av 2° antistoff fortynning på alle lysbildene. Inkuber for 90 min i romtemperatur i mørke, fuktige omgivelser.
- Leveringstanken 2° antistoff løsning. Vask alle lysbilder tre ganger, 10 min med 5% BSA/PBS.
- Skyll med PBS. Tørr for 10 min.
- Montere coverglass med en ikke-permanente, lav viskositet vannbasert montering medium.
- Når tørr, forsegle kantene lysbildet med neglelakk. Tørr og lagre i en mørk slidebox.
3. Imaging lysbilder med Epifluorescence mikroskopi
- ren lysbildene med en liten, 70% etanol-gjennomvåt lab-tørk.
- Motta digitale bilder av immunostained muskel inndelinger ved hjelp av en epifluorescence mikroskop utstyrt med en fotografisk apparater (se Tabell for materiale).
- Velg ca 1 mm 2 (10 X mål, 1,4 NA).
- Vis Alexa 488-konjugerte 2° antistoff fluorescens via en 505 nm lange pass-filteret. Vis fluorescens generert av magnetisering av Alexa 594-konjugerte 2° antistoffer via et 595 nm lang-pass filter. Digitalisere bilder med en PC utstyrt med en kompatibel programvare. Inkluderer baren skala fra tenkelig programvare for senere analyse.
4. Analyse av bilder med Fiji
Merk: før du utfører analyse, Fiji (tilgjengelig fritt fra National Institutes of Health, Bethesda, MD) må installeres via https://imagej.net/Fiji/Downloads. Makroen denne prosessen er også gitt i Supplerende fil. Plasser makrofilen i en enkelt tilgjengelig mappe.
- Last en brightfield bilde av en merket inndeling i Fiji. Naviger til Plugins → segmentering → Trainable Weka segmentering.
- For å fastsette mobilnettet områdene delen tegne en linje på en fiber, og klikk " legge til klasse 1 ". Deretter trekke en linje på plass mellom fiber og klikk " legge til klasse 2 " merke ekstracellulære domenene. Gjenta til det er 5-10 etiketter i hver klasse.
- Klikk tog klassifisereren. Resulterende røde og grønne overlayet, legge flere etiketter manuelt (se trinn 4.2) til feil segmentert deler av bildet, om nødvendig. Gjenta til fiber (rød) er riktig atskilt fra avstanden mellom fiber (grønn).
- Klikk " få sannsynlighet " og lagre bildet i en nylig merket mappe.
- Gjenta den ovenstående prosedyren (trinn 4.2-4.3) med fluorescerende bildet tatt fra feltet. Merke immunostained fiber som " klasse 1 " og alle ikke-fluorescerende regioner som " klasse 2 ". Lagre resulterende sannsynlighet kartet til den samme mappen der behandlet brightfield bildet lagres.
- Åpne en tidligere lagret sannsynlighet Maps i Fiji. Tegne en rett linje i skala-feltet fra bildebehandlingsprogramvare. Gå til å analysere → angi skala. Endre parameterne (dvs., kjent distanse, måleenhet) til de riktige verdiene som gitt av baren skala, så sjekk den " Global " for å standardisere skalaen for hvert bilde.
- Naviger til Plugins → makroer → kjøre → Tyagi et al. fiber kvantifisering macro.ijm (se Ekstra fil). Umiddelbart, vises en navigasjonsruten. Åpne bildet ' s vert mappe. en dialogboks vil vises. For hver dialogboksen endre på " bakgrunn " dropdown verdi " lys. "
Merk: mappen vil nå fylles med bilder av fiber konturene og programvare regnearkfiler resultatene (CSA og Feret diameter er mest relevant for kvantifisere fiber morfologi; målte parametere kan justeres i analysere sette mål). Fiber morfologi data generert av funksjonen pore-analyse i Fiji, overføres automatisk til regnearkfiler programvare for både fluorescerende og lyse bilder. - Beregner brøkdelen av fiber uttrykke en gitt MyHC i et felt ved å dele antall fluorescerende fiber i feltet antall totale fiber i tilsvarende lyse feltet bildet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hindlimb musklene (dvs., tibialis fremre, soleus) dissekert fra en mannlig C57BL/6 mus ukjent alder var flash frossen ved å senke en plast mold som inneholder muskelen i OCT compound i flytende nitrogen-avkjølt isopentane. Deretter ble bruker en cryotome, 8-10 µm føljetong delene kuttet ved 20 ° C og overført til forskjellige positivt ladet glass lysbilder12.
Vi valgte tibialis fremre og soleus fordi disse musklene hovedsakelig består av raske - og bremse-trekning fibre, henholdsvis13,14. Etter immunohistochemical flekker for individuelle type I, IIA, IIX og IIB MyHCs, brightfield og fluorescerende bilder ble tatt. Venstre panelene i figur 1 viser deler av en soleus muskel immunostained med type I, IIA, IIX og IIB MyHC-spesifikke antistoffer oppført i tabell 1.
Figur 1 : Immunohistochemical farging av MyHC skriver I, IIA, IIX og IIB i musen soleus muskler. Venstre panel Vis fluorescerende profilen oppnådd fra deler av en mus soleus muskel analysert med primære antistoffer mot type I (BA-F8;- A), Skriv inn IIA (SC-71; B), Skriv inn IIX (6 H 1; C) og skriv IIB (BF-F3; D) MyHCs. Høyre panel viser inndelingene der primære antistoffer i eksperimentet avbildet i tilsvarende informasjonsvinduet ble utelatt. Barer = 100 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Spesielt observerte vi betydelige deler av fiber uttrykke type I (figur 1A, venstre) og type IIA MyHCs (figur 1B, venstre) med en god mengde gjenværende fibrene viser positive flekker for typen IIX MyHCs (figur 1C, venstre). Derimot var nesten ingen type IIB fibrene tydelig (figur 1D, venstre). Disse observasjonene er i samsvar med tidligere rapporter som soleus muskler består stort sett av type jeg, skriver du inn IIA og IIX fiber (mindre så) med nesten ingen type IIB fiber5,10,12. Viktigere, ble ingen flekker observert i delene som det primære antistoffet hadde blitt utelatt fra protokollen, demonstrere spesifisitet av antistoffer (figur 1A-D, høyre panel).
Figur 2 : Immunohistochemical farging av MyHC skriver IIB, IIX, IIA og jeg i musen tibialis fremre muskler. Venstre panel viser fluorescerende profilen oppnådd fra deler av en mus tibialis fremre muskel analysert med primære antistoffer regissert skriver IIB (A), Skriv inn IIX (B), Skriv inn IIA (C) og type I-(D) MyHCs. Høyre panel viser inndelingene der primære antistoffer i eksperimentet avbildet i tilstøtende informasjonsvinduet ble utelatt. Barer = 100 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Vi har også farget tibialis fremre muskler med nevnte antistoffer. Tibialis fremre musklene var består hovedsakelig av typen IIB og type IIX MyHC-positive fiber (figur 2A-Bigjen paneler) med mindre bidrag fra fibre uttrykke type IIA MyHCs (figur 2C, venstre); nesten ingen fiber uttrykke type jeg MyHC ble observert (figur 2D, venstre). Våre data indikerer at musen tibialis fremre består hovedsakelig av fast twitch type IIA, skriver IIB og type IIX fiber er i samsvar med tidligere studier5,10,13. Igjen, ingen flekker ble observert i delene som det primære antistoffet hadde blitt utelatt fra protokollen (figur 2A-D, høyre panel).
Figur 3 : Iterated datastyrt fiber segmentering. Brightfield bilde av en mus tibialis fremre del (A). Transformasjon av samme bilde med våre halvautomatisk algoritme (B). Fluorescerende bilde av samme delen viser immunostaining av typen IIA MyHC (C). Transformasjon bildet viser bare type IIA MyHC-uttrykke fiber (D). Barer = 100 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
For morphometric analyse, ble brightfield bilder av feltene immunostained også innhentet. I eksemplet i Figur 3A er fra en tibialis fremre muskel delen analysert med SC-71 antistoffer mot type IIA MyHCs13. Bruker vår opprinnelige halvautomatisk algoritme, ble flere bilde transformasjoner brukt til å generere sannsynlighet kart fra brightfield bilder. En typisk image transformasjon avledet fra brightfield bildet vises i Figur 3A vises i Figur 3B. Bruke transformasjon og pore analyse funksjon Fiji, målt vi mener CSA (891.4 ± 45,0 µm2), maksimum (46,9 ± 1.3 µm) og minimum (26.0 ± 0,8 µm) betyr Feret diameter hver fiber i feltet. For å teste gjengivelsen av våre målinger, vurdert vi også disse parametrene i brightfield bildet manuelt. Mener CSA (867.0 ± 52.0 µm2), maksimum (45,7 ± 3.5 µm) og minimum (25.6 ± 1,9 µm) mener Feret diameter får mer kjedelig manuell anskaffelsesmetoden ikke var signifikant forskjellig fra metoden halvautomatisk (alle p > 0,05, hender t-tester; Tabell 3).
= "/ files/ftp_upload/56024/56024table3.jpg" / >
Tabell 3: Fiber morfologi og sammensetningen av tibialis fremre muskel immunostained for type I, IIA, IIB og IIX MyHCs som bestemmes av manuell og halvautomatisk analytiske metoder. Mener fiber CSA, mener Feret diameter og MyHC type i en mus tibialis fremre kvantifisert via tradisjonell manuell vurdering versus presentert algoritmen. Vær oppmerksom på at kombinert fraksjoner overskrider verdien 1 av fiber uttrykke mer enn én MyHC type.
Figur 3 Viser et fluorescerende bilde av den samme feltet immunostained med antistoffer mot skriver IIA MyHCs. Positivt-farget fiber i feltet ble valgt av antall (Figur 3D) og brukes til å bestemme brøkdel av typen IIA MyHC-uttrykke fiber ved å dele antall fiber i feltet for brightfield transformasjon (tabell 3 ). Den gjennomsnittlige CSA, maksimum og minimum Feret diameter av typen IIA fiber var så vurdert (tabell 3). Andelen type jeg, type IIX og type IIB fiber, samt sine dimensjoner, ble fastsatt av gjenta denne protokollen i seriell deler immunostained med BA-F8, 6H 1 og BF-F3 antistoffer, henholdsvis6,12(Tabell 4 ; Figur 4 A-D).
Tabell 4: MyHC innhold og morfologi musen soleus og tibialis fremre. Fiber type komposisjoner av representant soleus og tibialis fremre. Kvantifisering av gjennomsnittlig CSA, minimal og maksimal Feret diameter på type I, type IIA, Skriv inn IIX og type IIB i både soleus og tibialis fremre vises. Data er oppgitt som betyr ±SEM.
Vi har også vurdert disse parameterne i felt fra soleus muskelen (Tabell 4; Figur 4 A-D). 3,052 og 2,876 personlige fibre ble regnet for tibialis fremre og soleus muskler, henholdsvis. Sammen viser disse dataene muligheten for vår metode i fiber-type og morphometric.
Figur 4 : Morphometric analyse datasammendrag. Fiber-type komposisjoner av representative tibialis fremre og soleus muskler (A). Kvantifisering av gjennomsnittlig CSA, minimimal og maksimal Feret diameter på type I, type IIA, skriver IIX og type IIB fivers i både tibialis anteriort og soleus vises i (B-D). Dataene er gitt som betyr ±SEM. betydelige forskjeller mellom tibialis i fremre og soleus angis (* angir p < 0,05: ** angir p < 0.01; *** angir p < 0.005; t-test). 3,052 og 2,876 personlige fibre ble regnet for tibialis fremre og soleus muskler, henholdsvis. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Ekstra filen: Fiber kvantifisering makro. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her har vi gitt nyttig retning for identifikasjon av skjelettlidelser muskel fiber. Dermed beskriver vi en ny algoritme for analyse av dataene.
Siden resultatene hovedsakelig bekrefte de tidligere rapporter5,8,10 og reflekterer våre egne manuelle målinger, synes algoritmen å være nøyaktig. Likevel, møtte vi noen sjeldne eksperimentelle fallgruver inkludert uklart fiber grenser fra snitting gjenstand. Virkningen av disse gjenstander kan reduseres gjennom nøye snitting og årvåken undersøkelse av den bearbeidede delen før analyse. Spesielt kan mindre enn optimal bildesegmentering omgås gjennom flere runder med omklassifiseringen på det samme bildet å oppnå skarpere kontrast.
Det mest avgjørende skrittet i våre protokollen er trinn 4.2 som fastsetter vi mobilnettet og ekstracellulære områdene delen ved å tegne en linje på en gitt fiber, dermed skille et "klasse 1" eller "klasse 2". Selvfølgelig er denne manuell forskjellen viktig fordi den avgjør grensene for muskelfibre; en feil i dette trinnet vil påvirke vurdering av fiber dimensjonene.
I denne studien analysert vi deler for bare ett MyHC i seriell avdeling. Men uttrykke noen fiber, som hybrid fibre, to typer MyHC, indikativ av overlappende metabolske/funksjonelle profiler (f.eks, skriver du inn IIX og IIB). Dermed fraksjoner av fiber-type oppsummerte en verdi > 1 for både soleus og tibialis fremre (Figur 4A). Hybrid Fibre kan identifiseres med dobbel- eller selv trippel-, merking protokoller som beskrevet av Lee et al. 7og Bloemberg og Quadrilatero5, henholdsvis. Viktigst, kan vår metode for analyse brukes på disse mer komplekse fargeprotokollene. En annen begrensning av våre protokollen er at det ikke er helt automatisk; Vi tror imidlertid at dette mindre konsesjon sikrer at vår metode ikke kompromiss rigor for hastighet.
Selv MyHC komposisjoner av både soleus og tibialis fremre observert i denne studien gjenspeile resultatene av tidligere studier5,6,7,10,14 , det er noen kontraster med tidligere studier om vurdering av CSA. For eksempel er våre målinger av gjennomsnittlig CSA litt mindre enn Bloemberg og Quadrilatero5 og Allen et al. 15 spesielt våre CSA målinger varierte 539.86 ± 24.44 µm2 1319.50 ± 57.47 µm2 over fiber typer mens deres varte omtrent 735.7 ± 31.2 µm2 til 3073.8 ± 51,3 µm2. Men ligne våre verdier nærmere de observert av Augusto et al. 13 og Lucas et al. 6 som rapporterte gjennomsnittlig CSAs spenner fra 436 ± 605 µm2 2404 ± 412.5 µm2 og 815 ± 221 µm2 til 1904 ± 570 µm2, henholdsvis. Dermed finnes noen variasjon i morphometric analyse av musen hindlimb fiber i litteraturen.
Immunohistochemistry presenterer en effektiv måte å merke og klassifisere muskelfibre basert på deres MyHC innhold. Nøyaktig kvantifisering immunohistochemical eksperimenter er viktig å gjøre meningsfulle konklusjoner om data; Dette er en metode som kan automatisere de kjedelige delene av analyse en nyttig spesielt når hundrevis eller kanskje tusenvis, av fibre må måles og klassifisert. I tillegg til å gi målinger ligner på manuell observasjoner, gir vår algoritme en nøyaktig vurdering av disse dataene uten bias; denne fordelen over manuelle målinger sikrer vitenskapelig rigor. I denne forbindelse, kan vår metode være nyttig i karakterisering av effekten av genetiske og eksperimentelle manipulasjoner som påvirker muskel integritet. Spesielt MyHC immunohistochemistry kombinert med vår metode for rask analyse kan være ansatt å vurdere morfologiske og metabolske endringer i muskel sykdom modeller som muscular dystrophies, ALS og kreft cachexia. Videre kan også effekten av intervensjoner som hindre atrofi eller skape hypertrofi vurderes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen motstridende interesser å avsløre.
Acknowledgments
Vi er takknemlige for Boettcher stiftelsen og amyotrofisk Lateral sklerose Association (#17-II-344) for deres støtte i denne forskningen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9418-100G | 5% in PBS |
| Hydrophobic Barrier Pap Pen | Scientific Device Laboratory | 9804-02 | |
| Microscope Slides | Globe Scientific | 1358W | |
| Coverglass | Fisher Scientific | 12-544-E | |
| Immumount | Thermo Scientific | 9990402 | |
| Nail Polish | L'Oreal | ||
| Nikon Eclipse TE-200 Inverted Fluorescence and Brightfield Microscope | Discontinued | ||
| SPOT RT/KE | SPOT Imaging Solutions | RT940 | |
| Dell Optiplex | |||
| BA-F8 Primary Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa | monoclonal mouse IgG2b; 1:50 | |
| SC-71 Primary Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa | monclonal mouse IgG1; 1:50 | |
| BF-F3 Primary Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa | monoclonal mouse IgGM; 1:50 | |
| 6H1 Primary Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa | monoclonal mouse IgGM; 1:50 | |
| Alexa Fluor 594 anti-IgG2b | Invitrogen | A21145 | goat anti-mouse; 1:200 |
| Alexa Fluor 488 anti-IgG1 | Invitrogen | A21121 | goat anti-mouse;1:200 |
| Alexa Fluor 594 anti-IgGM | Invitrogen | A21044 | goat anti-mouse;1:200 |
| OCT | Sakura Finetek | 4583 | |
| isopentane | Fisher Scientific | O3551-4 | cool with liguid nitrogen |
| PBS | Fisher Bioreagents | BP665-1 | 10x, dilute to 1x |
| Kim wipes | Kimberly-Clark | 06-666A |
References
- Engel, W. K. The essentiality of histo- and cytochemical studies of skeletal muscle in the investigation of neuromuscular disease. Neurol. 12, 778-784 (1962).
- Dobrowolny, G., et al. Skeletal muscle is a primary target of SOD1G93A-mediated toxicity. Cell Metab. 8, 425-436 (2008).
- Sultana, N., et al. Restricting calcium currents is required for correct fiber type specification in skeletal muscle. Development. 143 (9), 1547-1559 (2016).
- Guth, L., Samaha, F. J. Procedure for the histochemical demonstration of actomyosin ATPase. Exp Neurol. 28 (2), 365-367 (1970).
- Bloemberg, D., Quadrilatero, J. Rapid determination of myosin heavy chain expression in rat, mouse, and human skeletal muscle using multicolor immunofluorescence analysis. PLoS One. 7 (4), (2012).
- Lucas, C. A., Kang, L. H., Hoh, J. F. Monospecific antibodies against the three mammalian fast limb myosin heavy chains. Biochem Biophys Res Commun. 272 (1), 303-308 (2000).
- Lee, C. S., et al. Ca2+ permeation and/or binding to Cav1.1 fine-tunes skeletal muscle Ca2+ signaling to sustain muscle function. Skelet Muscle. 5 (4), (2015).
- Sawano, S., et al. A one-step immunostaining method to visualize rodent muscle fiber type within a single specimen. PLoS One. 11 (11), (2016).
- Meunier, B., Picard, B., Astruc, T., Labas, R. Development of image analysis tool for the classification of muscle fibre type using immunohistochemical staining. Histochem Cell Biol. 134 (3), 307-317 (2010).
- Kammoun, M., Casser-Malek, I., Meunier, B., Picard, B. A simplified immunohistochemical classification of skeletal muscle fibres in mouse. Eur J Histochem. 58 (2), 2254 (2014).
- Kumar, A., Accorsi, A., Rhee, Y., Girgenrath, M. Do's and don'ts in the preparation of muscle cryosections for histological analysis. J Vis Exp. (99), (2015).
- Schiaffino, S., et al. Three myosin heavy chain isoforms in type 2 skeletal muscle fibres. J Muscle Res Cell Motil. 10 (197), (1989).
- Augusto, V., Padovani, C. R., Campos, G. E. R. Skeletal muscle fiber types in C57Bl6j mice. Braz J Morphol Sci. 21 (2), 89-94 (2004).
- Schiaffino, S., Reggiani, C. Fiber types in mammalian skeletal muscles. Physiol Rev. 91 (4), 1447-1531 (2011).
- Allen, D. L., Harrison, B. C., Maass, A., Bell, M. L., Byrnes, W. C., Leinwand, L. A. Cardiac and skeletal muscle adaptations to voluntary wheel running in the mouse. J Appl Physiol. 90 (5), 1900-1908 (2001).
