Summary
المناعي تلطيخ من isoforms السلسلة الثقيلة الميوسين نشأ المميز من أحدث من نوع الألياف العضلية الهيكلية (أيالنوع الأول، اكتب معهد مراجعي الحسابات الداخليين، واكتب منظمة شات، اكتب الثاني باء). نقدم هنا، بروتوكول المصبوغة جنبا إلى جنب مع خوارزمية رواية شبه إليه التي تسهل تقييم سريع مورفولوجية نوع الألياف والألياف.
Abstract
لسنوات، كانت أفضل تصور الفروق بين أنواع الألياف العضلية الهيكلية تلطيخ الميوسين-ATPase. في الآونة الأخيرة، برز المناعي تلطيخ من isoforms السلسلة الثقيلة (ميك) الميوسين كمميز الدقيقة لنوع الألياف. النوع الأول، اكتب معهد مراجعي الحسابات الداخليين، اكتب منظمة شات ويمكن الآن تحديد نوع ألياف IIB بدقة استناداً إلى التشكيل الجانبي ميك؛ ومع ذلك، دليل تحليل هذه البيانات يمكن أن تكون بطيئة وأسفل يمين مملة. وفي هذا الصدد، تقييم سريعة ودقيقة لتكوين نوع الألياف ومورفولوجيا أداة مرغوب فيه جداً. نقدم هنا، على بروتوكول للدولة من أحدث المناعي تلطيخ من ميكس في الأجزاء المجمدة التي تم الحصول عليها من الماوس اللكتات العضلات في الحفل مع خوارزمية شبه الآلي رواية أن يسرع تحليلاً مورفولوجيا نوع الألياف والألياف. كما هو متوقع، عرض العضلات سوليوس تلطيخ للنوع الأول والنوع ألياف معهد مراجعي الحسابات الداخليين، ولكن ليس لنوع منظمة شات أو نوع ألياف IIB. من ناحية أخرى، كانت تتألف أساسا من الألياف نوع منظمة شات والنوع الثاني باء، جزء صغير من نوع الألياف معهد مراجعي الحسابات الداخليين العضلات الظنبوبي الأمامي وقليلاً أو لا النوع الأول من الألياف. واستخدمت عدة تحولات الصورة لتوليد خرائط احتمال غرض قياس جوانب مختلفة من الألياف مورفولوجيا (أيمساحة مقطعية (CSA)، قطرها فيرت القصوى والدنيا). القيم التي تم الحصول عليها لهذه المعلمات ثم قورنت مع القيم التي تم الحصول عليها يدوياً. لوحظت لا توجد اختلافات كبيرة بين أما طريقة التحليل فيما يتعلق بوكالة الفضاء الكندية، قطرها فيرت القصوى أو الدنيا (كل ف > 0.05)، مما يشير إلى دقة أسلوبنا. وبالتالي، يمكن تطبيق لدينا بروتوكول تحليل إيمونوستاينينج للتحقيق في الآثار على تكوين العضلات في العديد من النماذج للشيخوخة وعضلي.
Introduction
كان معروفا لبعض الوقت أن الهيكل العظمى والعضلات وتتألف من ألياف واحدة من العديد من أنواع1. في البداية، تميزت مجموعتان من الألياف استناداً إلى خصائصها الهوس واسمه، على النحو المناسب، بطيء نشل (النوع الأول) وسريع نشل (النوع الثاني). كذلك تتميز هذه الفئات على أساس التمثيل الغذائي من الألياف. النوع الأول من منذ ذلك الحين ألياف غنية في الميتوكوندريا وتعتمد على الأيض الأكسدة، تم توضيح ديافوراسي ريدكتيز (NADH-أون) tetrazolium نيكوتيناميد الأدنين dinucleotide قوة إيجابية2 أو succinate نازعة (SDH)3 تلوين. وفي المقابل، عرضت ألياف النوع الثاني أقل ودرجات متفاوتة من ديافوراسي NADH-TR أو المحددات تلطيخ، وتنقسم إلى مجموعتين فرعيتين سريع نشل (النوع IIA والنوع الثاني باء) نوعا ما بدائية تستند إلى قدراتها الأكسدة النسبي. وقد تم تصور هذه الفروق بين ألياف أكثر فعالية تلطيخ الميوسين-ATPase النوع الأول من حيث الألياف وصمة عار الظلام بعد حضانة قبل في pH 4.0 والنوع الثاني باء الألياف امتصاص المتعجل الحضانة قبل التالية في pH 10.0 مع نوع الألياف معهد مراجعي الحسابات الداخليين تلوين العولم4.
في الآونة الأخيرة، برز المناعي تلطيخ من isoforms السلسلة الثقيلة (ميك) الميوسين كمميز أدق من الألياف من نوع5. النوع الأول، اكتب معهد مراجعي الحسابات الداخليين، والنوع الثاني باء ألياف يمكن الجميع التعرف بدقة استناداً إلى التشكيل الجانبي ميهك. وباﻹضافة إلى ذلك، نوع آخر من الألياف أيضي-متوسط سريع نشل، اكتب منظمة شات، قد حددت6. كما كانت ألياف الهجين معربا عن ميهك أكثر من مؤكدة5،،من78. بعض الأنواع مثل القط والبابون معروفة لا للتعبير عن "النوع الثاني باء ميكس"6. على الرغم من إيمونوستينينج ميك حاليا على تقدير الدولة للفنون لتكوين العضلات، تحليل البيانات التي تم الحصول عليها عن طريق هذا الأسلوب مرهقة وتستغرق وقتاً طويلاً من دون مساعدة الآلي. وتحقيقا لهذه الغاية، كانت حفنة من أساليب شبه الآلي لتحليل هذه البيانات المتقدمة5،،من910. نقدم هنا، بروتوكول قياسي نسبيا لتحديد نوع الألياف العضلية5،،من78،10، المناعي جنبا إلى جنب مع رواية شبه الآلي الخوارزمية التي تسارع تحليل مورفولوجيا نوع الألياف والألياف بدقة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
جميع الإجراءات التي تنطوي على الفئران أقرتها لجنة جامعة كولورادو-انشوتز الحرم الجامعي المؤسسي الحيوان الرعاية الطبية واستخدام (91813(05)1D).
1. 1 يوم: الابتدائي (1°) إيمونوستاينينج مع حجب ألبومين المصل البقري (BSA)
- أيردري المقاطع المجمدة للماوس اللكتات العضلات (مثلاً، الظنبوبي الأمامي، سوليوس) التي شنت على الشرائح مشحونة ل ~ 30 دقيقة 11-رسم حد حول مقاطع باستخدام قلم PAP حاجز مسعور.
- مكان ~ 250 ميليلتر من 5% جيش صرب البوسنة/الفوسفات مخزنة المالحة (جيش صرب البوسنة/برنامج تلفزيوني) على كتلة جسم غير محددة ملزمة لكل شريحة. احتضان الشرائح في درجة حرارة الغرفة حاء 1
- حين وقف، إعداد 01:50 تخفيف جسم 1 ° طافية في 5% جيش صرب البوسنة/برنامج تلفزيوني (كلها بالماوس [مونوكلونل]؛ انظر الجدول 1 6 ، 12)؛ إعداد 250 ميليلتر من حل كل شريحة. الاحتفاظ بمخزون جسم 1° وتخفيف على مدت
الجدول 1: "الأجسام المضادة الأولية" المستخدمة "التمييز بين ميكس".
- عقب التطلع للحل حظر جيش صرب البوسنة/برنامج تلفزيوني 5 ٪، إضافة 250 ميليلتر لتمييع جسم 1° إلى الشرائح المناسبة. إضافة 250 ميليلتر من 5% جيش صرب البوسنة/برنامج تلفزيوني لمراقبة سلبية جسم فقط الثانوية (2°) الشرائح.
- إينكوباتي في 4 درجات مئوية عن ح 24-48 في بيئة رطبة.
ملاحظة: طبق بيتري المشمولة في رقائق الألومنيوم مع ورق الترشيح المبلل تكون بمثابة غرفة حضانة مناسبة.
2. يوم 2:2 ° إيمونوستينينج مع "الأجسام المضادة الفلورسنت"
- نضح 1° جسم الحل أو السيطرة على حل جيش صرب البوسنة/برنامج تلفزيوني 5%. أغسل جميع الشرائح ثلاث مرات، 10 دقيقة مع جيش صرب البوسنة 5 ٪.
- أثناء الغسيل، يعد تخفيف 1: 200 من الأجسام المضادة المنقاة، مترافق fluorophore 2 ° في 5% جيش صرب البوسنة/برنامج تلفزيوني (انظر الجدول 2، كلها الماعز المضادة الماوس). إعداد 250 ميليلتر لحل كل شريحة. تبقى الأجسام المضادة مترافق fluorophore 2° في الظلام على مدت
الجدول 2: مترافق Fluorophore "الثانوي الأجسام المضادة" المستخدمة "تصور الابتدائي جسم الاعتراف من ميكس".
- عقب التطلع لتطبيق حل حظر جيش صرب البوسنة/برنامج تلفزيوني 5% الثالثة، إضافة 250 ميليلتر لتمييع جسم 2° إلى كافة الشرائح. احتضان لمدة 90 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في بيئة رطبة ومظلمة.
- أسبيراتي 2° جسم الحل. أغسل جميع الشرائح ثلاث مرات، 10 دقيقة مع 5% جيش صرب البوسنة/برنامج تلفزيوني-
- شطف مع برنامج تلفزيوني. الجافة للحد الأدنى 10
- جبل كوفيرجلاس بوسط تصاعد مائي غير الدائمة، والمنخفضة اللزوجة.
- عندما تجف، ختم حواف الشريحة مع طلاء الأظافر. الجاف وتخزينها في سليديبوكس الظلام.
3. التصوير الشرائح مع الفحص المجهري ابيفلوريسسينسي
- تنظيف الشرائح مع صغيرة، 70% غارقة في الإيثانول مختبر المسحة.
- الحصول على الصور الرقمية من أقسام العضلات إيمونوستاينيد استخدام مجهر ابيفلوريسسينسي مزودة بجهاز التصوير فوتوغرافي (انظر الجدول للمواد).
- حدد مساحة حوالي 1 مم 2 (10 X الهدف، نا 1.4).
- عرض مترافق 488 أليكسا 2° جسم الأسفار عن طريق 505 نانومتر طويلة تمرير مرشح. عرض fluorescence المتولدة عن الإثارة من الأجسام المضادة مترافق أليكسا 594 2° عبر مرشح تمرير طويل 595 نانومتر. رقمنة الصور مع كمبيوتر مزودة برامج تصوير متوافقة. إدراج شريط مقياس من التصوير البرمجيات لتحليلها في وقت لاحق.
4. تحليل الصور مع فيجي
ملاحظة: يجب أن يكون مثبتاً قبل الشروع في تحليل، فيجي (متاحة بحرية من "المعاهد الوطنية للصحة في" بيثيسدا، ماريلاند) عن طريق https://imagej.net/Fiji/Downloads. أيضا، يتم توفير الماكرو المستخدمة في هذه العملية في ملف إضافي. ضع الملف الماكرو في دليل الوصول إليها بسهولة.
- تحميل برايتفيلد صورة لمقطع محدد في فيجي. انتقل إلى الإضافات → تجزئة → تجزئة المدربة Weka.
- من أجل المناطق الخلوية للقسم، وتنص على رسم خط على ألياف بصرية، وانقر فوق " إضافة إلى الفئة 1 ". رسم خط في الفضاء بين الألياف، ثم انقر فوق " إضافة إلى فئة 2 " لوضع علامة مجالات خارج الخلية. كرر حتى هناك تسميات 5-10 في كل فئة.
- فوق القطار المصنف. على تراكب الحمراء والخضراء الناتجة عن ذلك، إضافة تسميات أكثر يدوياً (راجع الخطوة 4، 2) لقطع مجزأة بشكل غير صحيح للصورة، وإذا لزم الأمر. كرر حتى يتم فصل الألياف (أحمر) على نحو ملائم من المسافة بين الألياف (الأخضر)-
- انقر فوق " "احتمال الحصول على" " وحفظ الصورة في مجلد مسمى حديثا-
- تكرار الإجراء أعلاه (خطوات 4.2-4.3) مع الصورة الفلورية المأخوذة من نفس الحقل. قم بتسمية ألياف إيمونوستينيد ك " الطبقة 1 " وجميع المناطق غير فلوري ك " الطبقة 2 ". حفظ مخطط الاحتمالات الناتجة في نفس المجلد حيث يتم تخزين الصورة برايتفيلد المجهزة.
- فتح أحد مخططات الاحتمال تم حفظها مسبقاً في فيجي. رسم خط مستقيم في شريط مقياس تقدمها برامج التصوير. الذهاب لتحليل → تعيين المقياس. تغيير المعلمات (أي المسافة المعروفة، وحدة للطول) إلى القيم المناسبة المعطى من قبل شريط مقياس، ثم تحقق من " العالمي " مربع لتوحيد جدول الأنصبة لكل صورة.
- انتقل إلى الإضافات → وحدات الماكرو → تشغيل → تياجى et al. الألياف الكمي macro.ijm (انظر الملف التكميلي). فورا، سوف تظهر في جزء تنقل. فتح الصورة ' s المجلد المضيف؛ سوف يظهر مربع حوار. لكل مربع الحوار، تغيير " الخلفية " قيمة القائمة المنسدلة ل " الضوء. "
ملاحظة: المجلد الآن سوف يتم ملؤها مع الصور للخطوط العريضة الألياف وملفات البرامج جدول النتائج (قطر وكالة الفضاء الكندية وفيرت الأكثر صلة التحديد الكمي مورفولوجية الألياف؛ يمكن تعديل المعلمات المقاسة في تحليل القياسات المحددة). سيتم نقل الألياف مورفولوجيا البيانات التي تم إنشاؤها بواسطة الدالة المسام-تحليل فيجي تلقائياً لملفات برنامج جدول بيانات لكل الصور الميدانية الفلورسنت ومشرق. - حساب جزء صغير ألياف معربا عن ميك معين في حقل بقسمة عدد ألياف نيون في الميدان بعدد إجمالي الألياف في صورة مشرقة الحقل المطابق.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وكانت العضلات اللكتات (أي، الظنبوبي الأمامي، سولاس) تشريح من ماوس C57BL/6 ذكور في سن غير معروفة فلاش المجمدة بغرق العفن بلاستيكية تحتوي على العضلات في أكتوبر مجمع في إيسوبينتاني تبريد النيتروجين السائل. ثم، استخدام كريوتومي، قطع في-20 درجة مئوية وتحويلها إلى شرائح مختلفة من الزجاج مشحونة بشكل إيجابي128-10 ميكرون مقاطع المسلسل.
اخترنا الظنبوبي الأمامي وسولاس لهذه العضلات تتكون أساسا من سريع وبطيء-نشل الألياف، على التوالي13،14. عقب المناعي تلطيخ لنوع الفرد الأول، معهد مراجعي الحسابات الداخليين ومنظمة شات ميهكس IIB، تم القبض على الصور برايتفيلد ونيون. لوحات الأيسر من الشكل 1 إظهار أقسام سولاس العضلات إيمونوستينيد مع النوع الأول، معهد مراجعي الحسابات الداخليين، أجسام مضادة منظمة شات والثاني باء ميك محددة مدرجة في الجدول 1.
الشكل 1 : المناعي تلطيخ من ميهك من النوع الأول، معهد مراجعي الحسابات الداخليين ومنظمة شات IIB في الماوس سوليوس العضلات. تظهر لوحات اليسار الفلورسنت الصور التي تم الحصول عليها من الفروع من العضلات سولاس الماوس سبر مع الأجسام المضادة الأولية الموجهة للنوع الأول (با-F8؛ A)، اكتب معهد مراجعي الحسابات الداخليين (SC-71؛ ب)، اكتب منظمة شات (6 ح 1؛ ج) واكتب الثاني باء (فرنك بلجيكي-F3؛ ميكس د). لوحات حق إظهار المقاطع التي أسقطت جسم الأولية التي استخدمت في التجربة المبينة في اللوحة اليسرى المقابلة. أشرطة = 100 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
على وجه التحديد، لاحظنا كسور كبيرة من ألياف معربا عن نوع (الشكل 1أ، اليسار) ونوع "ميهكس معهد مراجعي الحسابات الداخليين" (الشكل 1بمن اليسار) مع قدر لا بأس به من الألياف المتبقية عرض تلطيخ إيجابية لنوع منظمة شات ميكس (الشكل 1جمن اليسار). على النقيض من ذلك، كانت ألياف IIB لا نوع تقريبا واضح (الرقم 1دمن اليسار). هذه الملاحظات وتتسق مع التقارير السابقة التي عضلات سوليوس يتألف معظمها من النوع الأول، اكتب معهد مراجعي الحسابات الداخليين واكتب منظمة شات الألياف (أقل من ذلك) مع تقريبا لا نوع IIB ألياف5،،من1012. الأهم من ذلك، لوحظ لا تلطيخ في المقاطع التي قد أغفلت جسم الأساسي من البروتوكول، مما يدل على الطابع الخاص للأجسام المضادة (الشكل 1أ-د، لوحات الحق).
الشكل 2 : المناعي تلطيخ من ميك اكتب الثاني باء، منظمة شات، معهد مراجعي الحسابات الداخليين، وأنا في الماوس الظنبوبي الأمامي العضلات. تظهر لوحات اليسار الفلورسنت الصور التي تم الحصول عليها من الفروع من الماوس الظنبوبي الأمامي العضلات سبر مع الأجسام المضادة الأولية الموجهة لنوع الثاني باء (أ) واكتب منظمة شات (ب)، واكتب معهد مراجعي الحسابات الداخليين (ج) والنوع الأول ميكس (د). لوحات حق إظهار المقاطع التي أسقطت جسم الأولية المستخدمة في هذه التجربة التي صورت في اللوحة اليسرى المجاورة. أشرطة = 100 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
ونحن أيضا الملون العضلات الظنبوبي الأمامي مع الأجسام المضادة المشار إليها أعلاه. تتألف العضلات الظنبوبي الأمامي معظمها من نوع IIB ونوع الألياف منظمة شات ميك-إيجابية (الشكل 2أ-ب، غادر لوحات) مع مساهمات أصغر من ألياف معربا عن نوع "ميكس معهد مراجعي الحسابات الداخليين" (الشكل 2ج، اليسار)؛ تقريبا لا ألياف معربا عن نوع ميك قد لاحظت (الشكل 2دمن اليسار). البيانات المتوفرة لدينا تشير إلى أن الماوس الظنبوبي الأمامي يتكون أساسا من النوع سريع نشل معهد مراجعي الحسابات الداخليين، اكتب IIB ونوع الألياف منظمة شات تتسق مع دراسات سابقة5،،من1013. مرة أخرى، لوحظ لا تلطيخ في المقاطع التي قد أغفلت جسم الأساسي من البروتوكول (الشكل 2أ-د، لوحات الحق).
الشكل 3 : تجزئة الألياف المحوسبة تكريرها. برايتفيلد صورة لمقطع الماوس الظنبوبي الأمامي (A). التحول من نفس الصورة باستخدام خوارزمية لدينا شبه الآلي (ب). الفلورسنت الصورة من الجزء نفسه عرض إيمونوستينينج نوع IIA ميك (ج). تحويل صورة تبين نوع فقط الإعراب عن "معهد مراجعي الحسابات الداخليين ميك" الألياف (د). أشرطة = 100 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
غرض تحليل شكلي، وتم أيضا الحصول على صور برايتفيلد حقول إيمونوستينيد. المثال الموضح في الشكل 3ألف من باب العضلات أمامية الظنبوبي سبر مع اتفاقية استكهولم-71 الأجسام المضادة الموجهة لكتابة ميكس IIA13. باستخدام خوارزمية شبه الآلي لدينا الأصلي، استخدمت عدة تحولات الصورة لتوليد خرائط الاحتمال من الصور برايتفيلد. تحويل صورة نموذجية المستمدة من الصورة برايتفيلد هو مبين في الشكل 3ألف يرد في الشكل 3ب. استخدام التحويل ووظيفة تحليل المسام من فيجي، قمنا بقياس يعني وكالة الفضاء الكندية (891.4 ± 45.0 ميكرومتر2)، كحد أقصى (46.9 ± 1.3 ميكرومتر) والحد الأدنى (26.0 ± 0.8 ميكرومتر) يعني فيرت أقطار كل الألياف في الميدان. لاختبار دقة القياسات لدينا، ونحن أيضا بتقييم هذه المعلمات في الصورة برايتفيلد يدوياً. يعني وكالة الفضاء الكندية (867.0 ± 52.0 ميكرومتر2) والحد الأقصى (45.7 ± 3.5 ميكرومتر) والحد الأدنى (25.6 ± 1.9 ميكرومتر) يعني أقطار فيرت الحصول عليها باستخدام الأسلوب اليدوي اقتناء أكثر مملة لم تكن تختلف اختلافاً كبيرا عن الأسلوب شبه الآلي (جميع ف > 0.05، مزاوج تي-الاختبارات؛ الجدول 3).
= "//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56024/56024table3.jpg"/>
الجدول 3: الألياف مورفولوجيا وتكوين الظنبوبي الأمامي العضلات إيمونوستاينيد للنوع الأول، معهد مراجعي الحسابات الداخليين، وبنك الاستثمار الدولي، ومنظمة شات ميهكس كما تحددها أساليب تحليلية شبه التلقائي واليدوي- يعني الألياف وكالة الفضاء الكندية، يعني أقطار فيرت واكتب ميك ماوس الظنبوبي أمامي كمياً عن طريق التقييم اليدوية التقليدية مقابل عرض الخوارزمية. يرجى ملاحظة أن الكسور مجتمعة تتجاوز قيمة 1 بسبب وجود ألياف معربا عن نوع ميك واحد أو أكثر.
الشكل 3 ج يظهر صورة فلورسنت من إيمونوستينيد الحقل نفسه مع الأجسام المضادة الموجهة لكتابة "ميكس معهد مراجعي الحسابات الداخليين". ألياف الملطخة بشكل إيجابي في الميدان المحدد برقم (الشكل 3د) والمستخدمة لتحديد جزء صغير الألياف نوع التعبير عن "ميك معهد مراجعي الحسابات الداخليين" بقسمة مجموع عدد الألياف في ميدان التحول برايتفيلد (الجدول 3 ). متوسط وكالة الفضاء الكندية، الحد الأقصى والحد الأدنى كانت أقطار فيريت من النوع IIA الألياف ثم تقييم (الجدول 3). النسبة اكتب أنا، نوع منظمة شات ونوع ألياف IIB، فضلا عن أبعادها، وتحددت بتكرار هذا البروتوكول في مقاطع المسلسل إيمونوستينيد با-F8 وح 6 1 فرنك بلجيكي-F3 الأجسام المضادة، على التوالي6،12(الجدول 4 ; الشكل 4 أ-د).
الجدول 4: ميك المحتوى ومورفولوجيا سولاس الماوس والظنبوبي الأمامي. الألياف نوع التراكيب المقاطع التمثيلية سوليوس والظنبوبي الأمامي. التحديد الكمي لمتوسط وكالة الفضاء الكندية، أقطار فيرت الحد الأدنى والأقصى للنوع الأول، اكتب معهد مراجعي الحسابات الداخليين، اكتب منظمة شات ويبين نوع IIB في سولاس والظنبوبي الأمامي. وترد البيانات كمتوسط ±SEM.
ونحن أيضا بتقييم هذه المعلمات في حقل تم الحصول عليها من العضلات سولاس (الجدول 4؛ الشكل 4 أ-د). أحصى الألياف الفردية 3,052 و 2,876 الظنبوبي الأمامي والعضلات سوليوس، على التوالي. أخذت معا، هذه البيانات إثبات جدوى أسلوبنا في تحليل نوع الألياف وشكلي.
الشكل 4 : شكلي تحليل البيانات الموجزة. نوع الألياف التراكيب المقاطع التمثيلية الظنبوبي الأمامي والعضلات سولاس (A). التحديد الكمي لوكالة الفضاء الكندية في المتوسط، مينيميمال وأقطار فيرت القصوى من النوع الأول، اكتب معهد مراجعي الحسابات الداخليين، اكتب منظمة شات ويبين نوع IIB فيفيرس في كل من أنتيريورت الظنبوبي وسولاس (ب-د). يتم الإشارة إلى سولاس وتعطي البيانات كما يعني ±SEM-وجود اختلافات كبيرة بين الظنبوبي الأمامي (* يدل ف < 0.05: * * يدل ف < 0.01؛ * * * يدل ف < 0.005؛ واختبار t). أحصى الألياف الفردية 3,052 و 2,876 الظنبوبي الأمامي والعضلات سولاس، على التوالي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
"الملف التكميلي": الألياف الكمي الماكرو- اضغط هنا لتحميل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هنا، وقد قدمنا الاتجاه مفيدة للتعرف على أنواع الألياف العضلية الهيكلية. في القيام بذلك، يمكننا وصف خوارزمية جديدة لتحليل البيانات.
نظراً للنتائج التي توصلنا إليها إلى حد بعيد تأكيد تلك التقارير السابقة5،،من810 وتعكس القياسات اليدوية الخاصة بنا، يبدو الخوارزمية دقيقة. ومع ذلك، واجهنا بعض المزالق التجريبية نادرة بما في ذلك الحدود غير واضحة الألياف الناتجة عن تقطيع القطع الأثرية. يمكن التقليل من أثر هذه القطع الأثرية من خلال تمزيقها حذراً ويقظة فحص المقطع المجهزة قبل التحليل. على وجه الخصوص، يجوز التحايل على تجزئة الصورة أقل من الأمثل من خلال جولات متعددة من إعادة التصنيف في نفس الصورة لتحقيق التباين أكثر وضوحاً.
أن الخطوة الأكثر حسما في لدينا بروتوكول هو خطوة 4.2 التي نحن تنص على المناطق الخلوية وخارج الخلية في القسم برسم خط على ألياف بصرية معينة، وبالتالي التمييز بين "فئة 1" أو منطقة "الفئة 2". ومن الواضح أن هذا التمييز اليدوي ضروري لأنه يحدد حدود ألياف العضلات؛ خطأ في هذه الخطوة ستؤثر سلبا على تقييم أبعاد الألياف.
في هذه الدراسة، ونحن سبر أقسام ميك واحد فقط في قسم مسلسل معين. ومع ذلك، بعض الألياف، مثل الألياف الهجينة، التعبير عن نوعين من ميهك، يدل على تداخل التشكيلات الجانبية الأيضية/الوظيفية (مثلاً، اكتب منظمة شات واكتب الثاني باء). وهكذا، كسور قد لخص إلى قيمة من نوع الألياف > 1 لكل من سولاس والظنبوبي الأمامي (الشكل 4أ). يمكن التعرف على الألياف المختلطة مع مزدوجة، أو حتى ثلاثة إضعاف-، وسمها البروتوكولات مثل تلك التي وصفتها لي et al. 7و بلومبرج وكوادريلاتيرو5، على التوالي. الأهم من ذلك، لدينا أسلوب التحليل يمكن تطبيقها على هذه البروتوكولات المصبوغة أكثر تعقيداً. قيد آخر لأن البروتوكول أنه ليس التلقائي بالكامل؛ بيد أننا نعتقد أن هذا الامتياز طفيفة ويضمن أن لدينا طريقة لا تعرض للخطر الصرامة من أجل السرعة.
في حين أن التراكيب ميك عضلات سولاس والظنبوبي الأمامي، لوحظ في هذه الدراسة تعكس نتائج السابقة الدراسات5،،من67،،من1014 ، وهناك بعض التناقضات مع الدراسات السابقة فيما يتعلق بتقييم وكالة الفضاء الكندية. على سبيل المثال، لدينا قياسات متوسط وكالة الفضاء الكندية إلى حد ما أقل من تلك التي أبلغ عنها أما من بلومبيرج وكوادريلاتيرو5 والين وآخرون. 15 على وجه الخصوص، لدينا قياسات وكالة الفضاء الكندية تراوحت 539.86 ± 24.44 ميكرومتر2 1319.50 ± 57.47 ميكرومتر2 عبر أنواع الألياف بينما امتدت لهم تقريبا 735.7 ± 31.2 ميكرومتر2 إلى 3073.8 ± 51.3 ميكرومتر2. ومع ذلك، لدينا قيم أوثق تشبه تلك لاحظها أوغوستو et al. 13 ولوكاس et al. 6 الذين أبلغوا عن الضمانات المتوسط تتراوح ميكرومتر ± 605 4362 إلى 2404 ± 412.5 ميكرومتر2 و 815 ± 221 ميكرومتر2 إلى 1904 ± 570 ميكرومتر2، على التوالي. وهكذا، يوجد بعض التغير في تحليل شكلي لألياف اللكتات الماوس عبر الأدب.
إيمونوهيستوتشيميستري يقدم طريقة فعالة لتسمية وتصنيف ألياف العضلات على أساس مضمونها ميك. دقة القياس الكمي لتجارب المناعي ضروري لجعل استنتاجات ذات مغزى حول البيانات؛ وتحقيقا لهذه الغاية، هو أسلوب التي يمكن أتمتة أجزاء مملة من تحليل فكرة مفيدة، خاصة عندما المئات أو حتى الآلاف من الألياف تحتاج إلى قياس وتصنيف. بالإضافة إلى توفير قياسات مماثلة للملاحظات اليدوية، يوفر لنا خوارزمية تقييما دقيقا لهذه البيانات دون تحيز؛ ويضمن هذا ميزة على القياسات اليدوية الصرامة العلمية. وفي هذا الصدد، قد يكون من المفيد في وصف آثار التلاعبات الجينية والتجريبية التي تؤثر على سلامة العضلات منهجيتنا. على وجه التحديد، يجوز immunohistochemistry ميك يقترن لدينا طريقة للتحليل السريع تقييم التغيرات المورفولوجية والتمثيل الغذائي في العضلات لنماذج المرض مثل ضمور العضلات، دنف المرض والسرطان. وعلاوة على ذلك، يمكن أيضا تقييم فعالية التدخلات التي تمنع ضمور أو يتسبب في تضخم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب قد لا المصالح المتضاربة الكشف عن.
Acknowledgments
نحن ممتنون لمؤسسة بوتشير ورابطة التصلب العضلي الجانبي (#17--ثانيا-344) على دعمها لهذا البحث.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9418-100G | 5% in PBS |
| Hydrophobic Barrier Pap Pen | Scientific Device Laboratory | 9804-02 | |
| Microscope Slides | Globe Scientific | 1358W | |
| Coverglass | Fisher Scientific | 12-544-E | |
| Immumount | Thermo Scientific | 9990402 | |
| Nail Polish | L'Oreal | ||
| Nikon Eclipse TE-200 Inverted Fluorescence and Brightfield Microscope | Discontinued | ||
| SPOT RT/KE | SPOT Imaging Solutions | RT940 | |
| Dell Optiplex | |||
| BA-F8 Primary Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa | monoclonal mouse IgG2b; 1:50 | |
| SC-71 Primary Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa | monclonal mouse IgG1; 1:50 | |
| BF-F3 Primary Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa | monoclonal mouse IgGM; 1:50 | |
| 6H1 Primary Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa | monoclonal mouse IgGM; 1:50 | |
| Alexa Fluor 594 anti-IgG2b | Invitrogen | A21145 | goat anti-mouse; 1:200 |
| Alexa Fluor 488 anti-IgG1 | Invitrogen | A21121 | goat anti-mouse;1:200 |
| Alexa Fluor 594 anti-IgGM | Invitrogen | A21044 | goat anti-mouse;1:200 |
| OCT | Sakura Finetek | 4583 | |
| isopentane | Fisher Scientific | O3551-4 | cool with liguid nitrogen |
| PBS | Fisher Bioreagents | BP665-1 | 10x, dilute to 1x |
| Kim wipes | Kimberly-Clark | 06-666A |
References
- Engel, W. K. The essentiality of histo- and cytochemical studies of skeletal muscle in the investigation of neuromuscular disease. Neurol. 12, 778-784 (1962).
- Dobrowolny, G., et al. Skeletal muscle is a primary target of SOD1G93A-mediated toxicity. Cell Metab. 8, 425-436 (2008).
- Sultana, N., et al. Restricting calcium currents is required for correct fiber type specification in skeletal muscle. Development. 143 (9), 1547-1559 (2016).
- Guth, L., Samaha, F. J. Procedure for the histochemical demonstration of actomyosin ATPase. Exp Neurol. 28 (2), 365-367 (1970).
- Bloemberg, D., Quadrilatero, J. Rapid determination of myosin heavy chain expression in rat, mouse, and human skeletal muscle using multicolor immunofluorescence analysis. PLoS One. 7 (4), (2012).
- Lucas, C. A., Kang, L. H., Hoh, J. F. Monospecific antibodies against the three mammalian fast limb myosin heavy chains. Biochem Biophys Res Commun. 272 (1), 303-308 (2000).
- Lee, C. S., et al. Ca2+ permeation and/or binding to Cav1.1 fine-tunes skeletal muscle Ca2+ signaling to sustain muscle function. Skelet Muscle. 5 (4), (2015).
- Sawano, S., et al. A one-step immunostaining method to visualize rodent muscle fiber type within a single specimen. PLoS One. 11 (11), (2016).
- Meunier, B., Picard, B., Astruc, T., Labas, R. Development of image analysis tool for the classification of muscle fibre type using immunohistochemical staining. Histochem Cell Biol. 134 (3), 307-317 (2010).
- Kammoun, M., Casser-Malek, I., Meunier, B., Picard, B. A simplified immunohistochemical classification of skeletal muscle fibres in mouse. Eur J Histochem. 58 (2), 2254 (2014).
- Kumar, A., Accorsi, A., Rhee, Y., Girgenrath, M. Do's and don'ts in the preparation of muscle cryosections for histological analysis. J Vis Exp. (99), (2015).
- Schiaffino, S., et al. Three myosin heavy chain isoforms in type 2 skeletal muscle fibres. J Muscle Res Cell Motil. 10 (197), (1989).
- Augusto, V., Padovani, C. R., Campos, G. E. R. Skeletal muscle fiber types in C57Bl6j mice. Braz J Morphol Sci. 21 (2), 89-94 (2004).
- Schiaffino, S., Reggiani, C. Fiber types in mammalian skeletal muscles. Physiol Rev. 91 (4), 1447-1531 (2011).
- Allen, D. L., Harrison, B. C., Maass, A., Bell, M. L., Byrnes, W. C., Leinwand, L. A. Cardiac and skeletal muscle adaptations to voluntary wheel running in the mouse. J Appl Physiol. 90 (5), 1900-1908 (2001).
