Summary
肌球蛋白重链异构体的免疫组织化学染色已成为骨骼肌纤维型 (即、i 型、类型 IIA、类型 IIX、类型 IIB) 的最先进的鉴别器。在这里, 我们提出了一个染色协议和一个新的半自动算法, 促进纤维型和纤维形态的快速评估。
Abstract
近年来, 肌球蛋白-atp 酶染色法对骨骼肌纤维类型的差异进行了最佳的可视化。近年来, 肌球蛋白重链 (MyHC) 异构体的免疫组织化学染色逐渐成为纤维型的一种较细的鉴别。I 型, 类型 IIA, 类型 IIX 和类型 IIB 纤维现在可以根据他们的 MyHC 轮廓精确识别;但是, 手动分析这些数据可能是缓慢和向下-右单调乏味的。在这方面, 快速、准确地评估纤维类成分和形态是一个非常理想的工具。在这里, 我们提出了一项协议的最先进的免疫组化染色的 MyHCs 在冰冻切片从小鼠后肢肌肉与一个新的半自动算法, 加速分析纤维型和纤维形态。正如预期的, 比目鱼肌显示染色 I 型和类型 IIA 纤维, 但不是类型 IIX 或类型 IIB 纤维。另一方面, 胫骨前肌主要由 IIX 型和 IIB 纤维组成, 一小部分的 IIA 型纤维和很少或没有 I 型纤维。为了测量纤维形态的不同方面 (即、横截面积 (CSA)、最大和最小 Feret 直径), 采用了几种图像变换来生成概率图。然后将这些参数获得的值与手动获取的值进行比较。在 CSA、最大或最小 Feret 直径 (全部为p和 #62; 0.05) 中, 两种分析方法均无显著性差异, 说明了本法的准确性。因此, 我们的免疫分析协议可以应用于对许多衰老和肌病模型中肌肉组成的影响的研究。
Introduction
众所周知, 骨骼肌是由多种类型的单纤维组成的1。最初, 两组纤维的特点是根据其收缩特性和命名, 适当, 慢抽搐 (i 型) 和快速抽搐 (II 型)。这些类别在纤维新陈代谢的基础上进一步被区别。由于 I 型纤维富含线粒体, 并依赖于氧化代谢, 它们由稳健的正烟酰胺腺嘌呤核苷酸-唑还原酶 (NADH) 酶2或琥珀酸脱氢酶 (SDH)3染色.相比之下, II 型纤维表现出较小的和可变程度的 NADH TR 酶或 SDH 染色, 分为两个快速抽搐亚组 (类型 IIA 和类型 IIB) 有些粗略的基础上, 他们的相对氧化能力。纤维的这些区别通过肌球蛋白-atp 酶染色更有效地被形象化了在 pre-incubation 在 ph 值4.0 和类型 IIB 纤维以后吸收沉淀在 ph 10.0 与类型 IIA 纤维的 I 型纤维染黑。染色中等4。
最近, 肌球蛋白重链 (MyHC) 异构体的免疫组织化学染色已经成为纤维型5的更精细的鉴别器。I 型, 类型 IIA 和类型 IIB 纤维都可以根据他们的 MyHC 轮廓精确识别。此外, 另一种快速抽搐新陈代谢-中间纤维类型, 类型 IIX, 已被确定为6。表示多个 MyHC 的混杂光纤也已被确认5,7,8。一些物种, 如猫和狒狒已知不表达类型 IIB MyHCs6。虽然 MyHC 免疫是目前最先进的评估肌肉组成, 通过这种技术获得的数据的分析是繁琐和耗时, 没有自动援助。为此, 少数的半自动方法来分析这些数据已经开发了5,9,10。在这里, 我们提出了一个相对标准的协议的肌肉纤维的免疫组织化学鉴定类型5,7,8,10,以及一个新的半自动加速分析纤维型和纤维形态的算法。
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Protocol
所有涉及小鼠的程序均由科罗拉多大学-安舒兹医学院校园机构动物护理和使用委员会批准 (91813 (05) 1 d).
1. 1 天: 初级 (1 和 #176;) 免疫与牛血清白蛋白 (BSA) 阻断
- 小鼠后肢肌肉的空气干燥冰冻切片 (如 、胫骨前、比目鱼) 安装在带电的幻灯片上为 ~ 30 分钟 11 . 使用疏水性屏障 PAP 笔在剖面周围绘制边框.
- 在每张幻灯片上放置250和 #181; 5% bsa/磷酸盐缓冲盐水 (bsa/PBS), 以阻止非特异性抗体结合。在室温下孵育1小时的幻灯片
- 在阻塞时, 准备1:50 稀释1和 #176; 抗体上清 5% BSA/PBS (均为小鼠单克隆抗体; 请参阅 表 1 6 , 12 ); 准备250和 #181;每张幻灯片的解决方案。保持1和 #176; 抗体储存和稀释在冰上.
表 1: 用于区分 MyHCs 的主要抗体.
- 跟随 5% BSA/PBS 拦截解决方案的愿望, 添加250和 #181; L 1 和 #176; 抗体稀释到适当的幻灯片。添加250和 #181; L 5% BSA/PBS 到次要 (2 和 #176;) 抗体仅阴性控制幻灯片.
- 在潮湿环境中孵育4和 #176; C 为 24-48 h.
注: 用带有湿滤纸的铝箔盖的培养皿可以作为合适的孵化室.
2。2天: 2 和 #176; 免疫与荧光抗体
- 吸气1和 #176; 抗体溶液或控制 5% BSA/PBS 溶液。冲洗所有幻灯片三次, 10 分钟, 5% BSA.
- 洗涤时, 准备1:200 稀释的纯化, 荧光共轭2和 #176; 抗体在 5% BSA/PBS (见 表 2 , 所有都是山羊 anti-mouse)。为每张幻灯片准备250和 #181;保持2和 #176; 在黑暗中荧光共轭抗体在冰上.
表 2: 用于可视化 MyHCs 的初级抗体识别的荧光共轭二级抗体.
- 以下是 5% BSA/PBS 阻断解决方案的第三个应用的愿望, 添加250和 #181; L 2 和 #176; 所有幻灯片的抗体稀释。在阴暗潮湿的环境中, 室温下孵育90分钟.
- 吸气2和 #176; 抗体溶液。冲洗所有幻灯片三次, 10 分钟, 5% BSA/PBS.
- 用 PBS 冲洗。干燥10分钟.
- 安装 coverglass 具有非永久性、低的水性安装介质.
- 干燥时, 用指甲油密封滑动边。干燥和储存在一个黑暗的 slidebox.
3。带荧光显微镜的成像幻灯片
- 用一个小的、70% 乙醇浸泡过的实验室擦拭擦除幻灯片.
- 使用装有照相设备的荧光显微镜获取 immunostained 肌肉部分的数字图像 (请参阅 材料表 )。
- 选择大约 1 mm 2 (10X 目标, 1.4 NA) 的区域.
- 查看 Alexa 488-共轭2和 #176; 抗体荧光通过 505 nm long-pass 过滤器。查看由 594-共轭2和 #176 的激励产生的荧光; 通过 595 nm long-pass 过滤器的抗体。用装有兼容成像软件的 PC 计算机将图像数字化。将缩放栏包括在图像软件中以供以后分析.
4。与斐济的图像分析
注意: 在进行分析之前, 必须通过 https://imagej.net/Fiji/Downloads 安装斐济 (从国立卫生研究院免费提供)。此外, 在 补充文件 中提供了此过程中使用的宏。将宏文件放在易于访问的目录中.
- 在斐济加载选定节的明图像。导航到插件和 #8594; 分割和 #160; #8594; 训练 Weka 切分.
- 为了规定部分的蜂窝区域, 在光纤上绘制一条线, 然后单击并 #34; 添加到类1和 #34;。然后, 在纤维之间的空间上画一条线, 然后点击和 #34; 添加到类2和 #34; 标记细胞外领域。重复, 直到每个类中有5-10 标签。
- 单击 "训练分类器"。在生成的红色和绿色叠加上, 如有必要, 手动添加更多标签 (请参见步骤 4.2) 以不正确地分割图像的片段。重复直到纤维 (红色) 与纤维 (绿色) 之间的空间适当分离.
- 单击并 #34; 获取概率和 #34; 并将图像保存在新标记的文件夹中
- 重复上述过程 (步骤 4.2-4.3), 并从同一字段中取出荧光图像。标签 immunostained 纤维为和 #34; 类1和 #34; 和所有荧光地区作为和 #34; 类2和 #34;。将生成的概率映射保存到存储已处理明映像的同一文件夹中.
- 在斐济打开以前保存的概率映射之一。在成像软件提供的刻度线上绘制一条直线。去分析和 #160; #8594; 设置比例。将参数 ( 即 、已知距离、长度单位) 更改为缩放栏给定的相应值, 然后检查和 #34; 全局和 #34; 框以标准化每个图像的比例.
- 导航到插件和 #160; #8594; 宏和 #160; #8594; 运行和 #160; #8594; 泰亚吉 等 al. 光纤量化宏. ijm (请参见 补充文件 )。随即会出现一个导航窗格。打开图像和 #39 的主机文件夹;将出现一个对话框。对于每个对话框, 更改和 #34; 背景和 #34; 下拉列表值和 #34; 光. #34;
注意: 该文件夹现在将填充图像的光纤轮廓和电子表格软件文件的结果 (CSA 和 Feret 直径是最相关的量化纤维形态;测量参数可以在分析集合测量中进行调整)。斐济的孔隙分析功能产生的纤维形态数据将自动转移到电子表格软件文件中, 用于荧光和亮场图像. - 通过将字段中的荧光纤维数量除以相应的明亮场图像中的总光纤数来计算字段中表示给定 MyHC 的纤维的分数.
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Representative Results
后肢肌肉 (即, 胫骨前, 比目鱼) 解剖从一个未知年龄的雄性 C57BL/6 小鼠的闪光冻结了一个塑料模具中含有的肌肉在 OCT 化合物在液氮冷却戊。然后, 使用 cryotome, 8-10 µm 串行部分被切割在-20 ° c 和转移到不同的正电荷玻璃幻灯片12。
我们选择胫骨前和比目鱼, 因为这些肌肉主要由快速和慢抽搐纤维组成, 分别为13,14。在免疫组织化学染色的个人 I 型, IIA, IIX 和 IIB MyHCs, 明和荧光图像捕获。图 1的左面板显示了在表 1中列出的 immunostained 与 I 型、IIA、IIX 和 IIB MyHC 特定抗体的比目鱼肌的部分。
图 1: MyHC I 型、IIA、IIX 和 IIB 在小鼠比目鱼肌中的免疫组织化学染色.左面板显示从一只小鼠比目鱼肌的部分获得的荧光图像, 其主要抗体针对 I 型 (BA-F8;A), 类型 IIA (SC-71;B), 键入 IIX (6H1;C) 和类型 IIB (BF-F3;D) MyHCs。右面板显示了在相应的左面板中所描述的实验中使用的主抗体被省略的部分。条形 = 100 µm.请单击此处查看此图的较大版本.
具体来说, 我们观察了大量的纤维表示类型 I (图 1A, 左) 和类型 IIA MyHCs (图 1B, 左) 与相当数量的剩余纤维显示阳性染色的类型IIX MyHCs (图 1C, 左侧)。相比之下, 实际上没有任何类型的 IIB 光纤 (图 1D, 左侧)。这些观察与先前的报告一致, 比目鱼肌主要由 I 型、型 IIA 和型 IIX 纤维组成 (较少), 几乎没有类型的 IIB 纤维5,10,12。重要的是, 没有观察到的部分, 其中的主要抗体已被省略的协议, 证明特异性抗体 (图 1A-D, 右面板)。
图 2: MyHC 型 IIB、IIX、IIA 和 I 在小鼠胫骨前肌的免疫组织化学染色.左面板显示从小鼠胫骨前肌的部分获得的荧光图像, 其主要目的是对类型 IIB (a)、类型 IIX (B)、类型 IIA (C) 和 I 类型 (D) MyHCs 进行探测。右面板显示了在相邻左面板中所描述的实验中使用的主抗体被省略的部分。条形 = 100 µm.请单击此处查看此图的较大版本.
我们还用上述抗体染色胫骨前肌。胫骨前肌肉主要由类型 IIB 和类型 IIX MyHC 阳性纤维 (图 2A-b, 左面板) 组成, 从纤维表达型 IIA MyHCs (图 2C, 左) 的贡献较小;几乎没有观察到表达 I 型 MyHC 的纤维 (图 2D, 左侧)。我们的数据表明, 小鼠胫骨前主要由快速抽搐型 IIA 组成, 类型 IIB 和类型 IIX 纤维是一致的早期研究5,10,13。同样, 在从协议中省略主抗体的部分 (图 2A-D, 右面板) 中没有观察到任何染色。
图 3: 迭代计算机化光纤分段.明图像的鼠标胫骨前段 (a)。使用我们的半自动算法 (B) 对同一图像进行转换。显示免疫型 IIA MyHC (C) 的同一剖面的荧光图像。仅显示类型 IIA MyHC 表示纤维 (D) 的转换图像。条形 = 100 µm.请单击此处查看此图的较大版本.
为了进行形态分析, 还得到了 immunostained 场的明图像。图 3a中显示的示例来自胫骨前肌肉部分, 该 SC-71 抗体是针对类型 IIA MyHCs13进行探测的。利用我们的原始半自动算法, 利用几种图像变换从明图像中生成概率映射。从图 3a中所示的明图像导出的典型图像转换在图 3B中显示。利用斐济的变换和孔隙分析函数, 我们测量了平均 CSA (891.4 ±45.0 µm2), 最大值 (46.9 ±1.3 µm) 和最小值 (26.0 ±0.8 µm) 平均 Feret 直径。为了测试我们测量的精确度, 我们还手动评估了明图像中的这些参数。平均 CSA (867.0 ±52.0 µm2), 最大值 (45.7 ±3.5 µm) 和最小值 (25.6 ±1.9 µm) 平均 Feret 直径获得使用更繁琐的手工采集方法是没有明显不同的半自动方法 (所有的p和 #62;0.05, 不成对的t-测试;表 3)。
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表 3: 由人工和半自动分析方法确定的 I 型、IIA、IIB 和 IIX MyHCs 胫骨前肌 immunostained 的纤维形态和组成.平均纤维 CSA, 平均 Feret 直径和 MyHC 类型的小鼠胫骨前量化通过传统的手工评估与提出的算法。请注意, 组合分数超过1的值, 因为存在的纤维表示一个以上的 MyHC 类型。
图 3C显示同一字段 immunostained 的荧光图像, 其抗体指向 IIA 型 MyHCs。用数字 (图 3D) 选择字段中的阳性染色纤维, 并通过除以明变换域中的纤维总数 (表 3) 来确定 IIA 型 MyHC 表达纤维的分数。).然后评估了 a 型 IIA 纤维的平均 CSA、最大和最小 Feret 直径 (表 3)。I 型, 类型 IIX 和类型 IIB 纤维的比例, 以及它们的尺寸, 是通过在 immunostained 与 BA-F8, 6H1 和 BF-F3 抗体, 分别6,12(表 4) 中重复此协议而确定的。;图 4A-d)。
表 4: 小鼠比目鱼肌和胫骨前 MyHC 的含量和形态学.比目鱼肌和胫骨前部的纤维型成分。显示了比目鱼肌和胫骨前 Feret 的平均 CSA、最小和最大的 i 型、a 型 IIA、型 IIX 和型 IIB 的定量。数据以平均±SEM。
我们还评估了这些参数在一个领域获得的比目鱼肌 (表 4;图 4A-d)。分别对胫骨前和比目鱼肌的3052和2876个别纤维进行计数。同时, 这些数据证明了我们的方法在纤维型和形态分析中的可行性。
图 4: 形态分析数据汇总.纤维型成分的代表性部分的胫骨前和比目鱼肌 (A)。在上班族胫骨和比目鱼中, i 型、a 型 IIA、IIX 型和型 IIB anteriort 的平均 CSA、minimimal 和最大 Feret 直径的量化, 如B-D所示。数据是平均±SEM. 胫骨前和比目鱼肌之间有显著差异 (* 表示p和 #60; 0.05: ** 表示p和 #60; 0.01; ** 表示p和 #60; 0.005; t 测试)。分别对胫骨前和比目鱼肌的3052和2876个别纤维进行计数。请单击此处查看此图的较大版本.
补充文件: 光纤量化宏.请单击此处下载此文件.
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Discussion
在这里, 我们为骨骼肌纤维类型的鉴定提供了有用的方向。在这样的情况下, 我们描述了一种新的数据分析算法。
由于我们的结果在很大程度上证实了以前的报告5,8,10 , 并反映了我们自己的手动测量, 所以该算法看起来是准确的。尽管如此, 我们还是遇到了一些不常见的实验陷阱, 包括切片工件造成的光纤边界不清晰。在分析之前, 通过仔细剖分和对处理过的部分进行警惕检查, 可以最大限度地减少这些工件的影响。特别是, 不太理想的图像分割可以通过在同一图像上的多重更改来规避, 以达到更鲜明的对比度。
我们的协议中最关键的步骤是步骤 4.2, 我们通过在给定的纤维上画一条线来规定该部分的细胞和胞外区域, 从而区分 "1 类" 或 "2 类" 区域。显然, 这一手动区分是至关重要的, 因为它决定了肌肉纤维的边界;此步骤中的错误将对光纤尺寸的评估产生负面影响。
在这项研究中, 我们在一个给定的序列部分中只探测一个 MyHC 的部分。然而, 一些纤维, 如混杂纤维, 表达两种类型的 MyHC, 表明重叠的新陈代谢/功能配置文件 (例如, 类型 IIX 和类型 IIB)。因此, 纤维类型的分数总结为一个值和 #62; 1 的比目鱼和胫骨前 (图 4a)。混合纤维可以被识别为双, 甚至三重, 标签协议, 如那些由李et al.分别为7和 Bloemberg 和 Quadrilatero5。重要的是, 我们的分析方法可以应用于这些更复杂的染色协议。我们的协议的另一个限制是它不是完全自动的;然而, 我们认为, 这一小的让步, 确保我们的方法不妥协的速度, 以严格的僵硬。
在本研究中观察到的比目鱼肌和胫骨前肌肉的 MyHC 成分反映了先前研究的结果5,6,7,10,14, 与先前关于 CSA 评估的研究有一些对比。例如, 我们对平均 CSA 的测量比 Bloemberg 和 Quadrilatero5和艾伦et al所报告的都要小一些。15特别是, 我们的 CSA 测量范围从539.86 ±24.44 µm2到1319.50 ±57.47 µm2跨越光纤类型, 而它们的跨度约735.7 ±31.2 µm2到3073.8 ±51.3 µm2。然而, 我们的价值观更像那些被观察到的et al.13和卢卡斯et al.6谁报告的平均 csa 范围从436±605µm2到2404±412.5 µm2和815±221µm2到1904±570µm2分别。因此, 在整个文献中存在着小鼠后肢纤维形态分析的一些变异性。
免疫组织化学提供了一种有效的方法, 标签和分类肌肉纤维的基础上, 他们的 MyHC 内容。准确定量化免疫组织化学实验是对数据做出有意义的结论的关键;为此, 一个可以自动化繁琐的分析部分的方法是有用的, 特别是当数百甚至数千的纤维需要被测量和分类。除了提供类似于手动观察的测量, 我们的算法还提供了对这些数据的精确评估, 而不带有偏差;这比手工测量的优势, 确保科学的严谨。在这方面, 我们的方法在描述影响肌肉完整性的基因和实验操作的影响方面可能是有用的。具体地说, MyHC 免疫组织化学结合我们的快速分析方法可以用来评估肌肉的形态学和代谢变化的疾病模型, 如肌肉营养, ALS 和癌症恶病质。此外, 还可评估预防萎缩或引起肥大的干预措施的功效。
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Disclosures
作者没有利益冲突的披露。
Acknowledgments
我们感谢 Boettcher 基金会和肌萎缩侧索硬化协会 (#17 II-344) 对这项研究的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9418-100G | 5% in PBS |
| Hydrophobic Barrier Pap Pen | Scientific Device Laboratory | 9804-02 | |
| Microscope Slides | Globe Scientific | 1358W | |
| Coverglass | Fisher Scientific | 12-544-E | |
| Immumount | Thermo Scientific | 9990402 | |
| Nail Polish | L'Oreal | ||
| Nikon Eclipse TE-200 Inverted Fluorescence and Brightfield Microscope | Discontinued | ||
| SPOT RT/KE | SPOT Imaging Solutions | RT940 | |
| Dell Optiplex | |||
| BA-F8 Primary Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa | monoclonal mouse IgG2b; 1:50 | |
| SC-71 Primary Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa | monclonal mouse IgG1; 1:50 | |
| BF-F3 Primary Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa | monoclonal mouse IgGM; 1:50 | |
| 6H1 Primary Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa | monoclonal mouse IgGM; 1:50 | |
| Alexa Fluor 594 anti-IgG2b | Invitrogen | A21145 | goat anti-mouse; 1:200 |
| Alexa Fluor 488 anti-IgG1 | Invitrogen | A21121 | goat anti-mouse;1:200 |
| Alexa Fluor 594 anti-IgGM | Invitrogen | A21044 | goat anti-mouse;1:200 |
| OCT | Sakura Finetek | 4583 | |
| isopentane | Fisher Scientific | O3551-4 | cool with liguid nitrogen |
| PBS | Fisher Bioreagents | BP665-1 | 10x, dilute to 1x |
| Kim wipes | Kimberly-Clark | 06-666A |
References
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