Summary
Immunhistokemisk färgning för myosin heavy chain isoformer har vuxit fram som den state-of-the-art diskriminator av Skelett muskel fiber-typ (dvstyp I, typ IIA, typ IIX, typ IIB). Här presenterar vi en färgning protokollet tillsammans med en ny halvautomatisk algoritm som underlättar snabb bedömning av fiber-typ och fiber morfologi.
Abstract
I år var distinktioner mellan skelett muskelfibertyperna bäst visualiseras av myosin-ATPas färgning. Mer nyligen, immunhistokemisk färgning för myosin heavy chain (MyHC) isoformer har framträtt som en finare diskriminator av fiber-typen. Typ I, typ IIA och typ IIX och typ IIB fibrer kan nu identifieras med precision utifrån deras MyHC profil; men manuell analys av dessa data kan vara långsam och ned-höger långtråkig. I detta avseende, är snabb, korrekt bedömning av fiber-typ sammansättning och morfologi en mycket önskvärd verktyg. Här presenterar vi ett protokoll för state-of-the-art immunhistokemisk färgning av MyHCs i frusna snitt erhållits från mus bakbenet muskel i konsert med en ny halvautomatisk algoritm som accelererar analys av fiber-typ och fiber morfologi. Som förväntat, soleus muskel visas färgning för typ I och typ IIA fibrer, men inte för typ IIX eller typ IIB fibrer. Däremot, tibialis anterior muskeln bestod huvudsakligen av typ IIX och typ IIB fibrer, en bråkdel av typ IIA fibrer och liten eller ingen typ I fibrer. Flera bild transformationer användes för att generera sannolikhet kartor för att mäta olika aspekter av fiber morfologi (dvstvärsnittsarea (CSA), maximal och minimal Feret diameter). De värden som erhålls för dessa parametrar jämfördes sedan med manuellt-erhållande värden. Inga signifikanta skillnader observerades mellan antingen läge för analys med avseende på CSA, maximal eller minimal Feret diameter (alla p > 0,05), som anger riktigheten av vår metod. Våra immunfärgning analys protokoll kan således tillämpas på utredningen av effekter på muskel sammansättning i många modeller av åldrande och myopati.
Introduction
Det har varit känt en tid att skelettmuskulaturen består av enstaka fibrer av många typer1. Inledningsvis, två grupper av fibrer karakteriserades baserat på deras kontraktila egenskaper och benämn, på lämpligt sätt, långsamt rycka (typ I) och fast-ryckning (typ II). Dessa kategorier var ytterligare distingerade på grundval av fiber metabolism. Sedan typ I fibrer är rika i mitokondrier och beroende av oxidativ metabolism, de var klarlagd av kraftfullt positiva nikotinamid-adenin-dinukleotid-tetrazolium reduktas (NADH-TR) diaphorase2 eller succinat dehydrogenas (SDH)3 färgning. Däremot typ II fibrer uppvisade mindre och varierande grader av NADH-TR diaphorase eller SDH färgning och delades in i två snabbt rycka undergrupper (typ IIA och typ IIB) något grovt baserat på deras relativa oxidativ kapacitet. Dessa distinktioner mellan fibrerna har varit visualiseras mer effektivt av myosin-ATPas färgning där typ I fibrer fläcken mörka efter en före inkubering vid pH 4.0 och typ IIB fibrer absorberar fällning följande före inkubering vid pH 10,0 med typ IIA fibrer färgning intermediärt4.
Mer nyligen, immunhistokemisk färgning för myosin heavy chain (MyHC) isoformer har framträtt som en finare diskriminator fiber-typ5. Typ I, typ IIA och typ IIB fibrer kan alla identifieras med precision utifrån deras MyHC profil. Dessutom en annan snabbt rycka metaboliskt-intermediate fiber typ, typ IIX, har varit identifierad6. Hybrid fibrer att uttrycka mer än en MyHC har också bekräftat5,7,8. Vissa arter såsom katten och babian är känt att inte express typ IIB MyHCs6. Även MyHC immunfärgning är för närvarande den state-of-the-art bedömningen av muskel sammansättning, är analysen av data som erhållits via denna teknik besvärlig och tidskrävande utan automatisk hjälp. I detta syfte har en handfull semi automatiserade metoder att analysera dessa data varit utvecklade5,9,10. Här presenterar vi ett relativt standardprotokoll för immunhistokemiska identifiering av muskelfiber-typ5,7,8,10, tillsammans med en halvautomatisk roman algoritmen som accelererar analys av fiber-typ och fiber morfologi med noggrannhet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
alla förfaranden som inbegriper möss godkändes av University of Colorado-Anschutz Medical Campus institutionella Animal Care och användning kommittén (91813(05)1D).
1. dag 1: primär (1°) immunfärgning med bovint serumalbumin (BSA) blockering
- lufttorra frysta delar av musen bakbenet muskel (t.ex., tibialis anterior, soleus) monterad på laddade bilder för ~ 30 min 11. Rita en kantlinje runt avsnitten med en hydrofoba barriär PAP pen.
- Plats ~ 250 µL av 5% BSA/fosfatbuffrad saltlösning (BSA/PBS) på varje bild att blockera icke-specifik antikropp bindande. Odling av objektglas i rumstemperatur i 1 h.
- Och blockerar, förbereda 1:50 utspädningar av 1° antikroppen supernatanten i 5% BSA/PBS (alla är mus monoklonala antikroppar, se tabell 1 6 , 12), förbereda 250 µL lösning per bild. Håll 1° antikropp bestånd och spädningar på ice.
tabell 1: primära antikroppar används för att skilja MyHCs.
- efter aspiration av 5% BSA/PBS blockerande lösningen, tillsätt 250 µL av 1° antikropp utspädning till lämpliga bilder. Lägga till 250 µL av 5% BSA/PBS till sekundär (2°) antikropp-bara negativa kontrollen glider.
- Inkubera vid 4 ° C för 24-48 h i en fuktig miljö.
Obs: En petriskål omfattas i aluminiumfolie med dämpade filterpapper kan utgöra en lämplig inkubation kammare.
2. Dag 2:2 ° immunfärgning med fluorescerande antikroppar
- aspirera 1° antikropp lösning eller styra 5% BSA/PBS lösning. Tvätta alla glider tre gånger, 10 min med 5% BSA.
- Medan tvätt, Bered 1: 200 utspädningar av renat, fluorophore-konjugerad 2 ° antikroppar i 5% BSA/PBS (se tabell 2, alla är geten antimus). Förbereda 250 µL lösning per bild. Hålla 2° fluorophore-konjugerade antikroppar i mörkret på ice.
tabell 2: Fluorophore-konjugerad sekundära antikroppar används för att visualisera primär antikropp erkännande av MyHCs.
- efter aspiration av tredje tillämpningen av 5% BSA/PBS blockerande lösning, tillsätt 250 µL av 2° antikropp utspädning på alla bilder. Inkubera i 90 min i rumstemperatur i en mörk och fuktig miljö.
- Aspirera 2° antikropp lösning. Tvätta alla glider tre gånger, 10 min med 5% BSA/PBS.
- Skölj med PBS. Torka i 10 min.
- Montera täckglas med en icke-permanent, låg viskositet aqueous monteringsmedium.
- När det är torrt, försegla bild kanterna med nagellack. Torka och förvara i en mörk slidebox.
3. Imaging bilder med Epifluorescence mikroskopi
- rengör bilderna med en liten, 70% etanol-indränkt lab torka.
- Skaffa digitala bilder av immunostained muskel sektioner med ett epifluorescensmikroskop utrustad med en fotografisk apparatur (se Tabell för material).
- Välj ett område på ca 1 mm 2 (10 X mål, 1,4 NA).
- Visa Alexa 488-konjugerad 2° antikropp fluorescens via en 505 nm lång-pass-filtret. Visa fluorescensen genereras av excitation av Alexa 594-konjugerad 2° antikroppar via ett 595 nm lång-pass filter. Digitalisera bilder med en PC-dator utrustad med en kompatibel bildhanteringsprogram. Inkluderar skalstapeln från bildhanteringsprogram för senare analys.
4. Analys av bilder med Fiji
Obs: innan du fortsätter med analys, Fiji (tillgängligt fritt från National Institutes of Health, Bethesda, MD) måste installeras via https://imagej.net/Fiji/Downloads. Dessutom finns makrot används i denna process i den Kompletterande fil. Placera filen makro i en lättillgänglig katalog.
- Belastning en brightfield bild av en markerad sektion i Fiji. Navigera till Plugins → segmentering → Trainable Weka segmentering.
- För att föreskriva de cellulära områdena i avsnittet, rita en linje på en fiber och klicka på " lägga till klass 1 ". Sedan rita en linje på utrymmet mellan fibrerna och klicka " lägga till klass 2 " att markera de extracellulära domänerna. Upprepa tills det finns 5-10 etiketter i varje klass.
- Klicka tåg klassificerare. Den resulterande röda och gröna overlay, lägga till fler etiketter manuellt (se steg 4,2) till felaktigt segmenterade bitar av bilden, om det behövs. Upprepa tills fibrerna (röd) separeras på rätt sätt från utrymmet mellan fibrer (grön).
- Klicka " få sannolikhet " och spara bilden i en nyligen märkt mapp.
- Upprepa ovanstående procedur (steg 4,2-4,3) med fluorescerande bilden tagen från samma fält. Etikett immunostained fibrer som " klass 1 " och alla icke-fluorescerande regioner som " klass 2 ". Spara den resulterande sannolikhet kartan i samma mapp där bearbetade brightfield bilden lagras.
- Öppna en tidigare sparad sannolikhet kartor i Fiji. Rita en rak linje på skalstapeln som tillhandahålls av avbildningsprogrammet. Gå till analysera → ange skala. Ändra parametrar (dvs, känd distans, längdenhet) till deras lämpliga värden som ges av skalstapeln, så kolla den " Global " om du vill standardisera skalan för varje bild.
- Navigera till Plugins → makron → kör → Tyagi et al. fiber kvantifiering macro.ijm (se den Kompletterande fil). Omedelbart, visas en navigeringsfönstret. Öppna bilden ' s värd mapp; en dialogruta visas. För varje i dialogrutan Ändra den " bakgrunden " listrutan värde att " ljuset. "
Obs: mappen kommer nu att fyllas med bilder av fiber konturerna och kalkylbladsfiler programvara av resultaten (CSA och Feret diameter är mest relevant att kvantifiera fiber morfologi; uppmätta parametrar kan justeras i analysera ange mätningar). Fiber morfologi data som genereras av funktionen pore-analys av Fiji att överföras automatiskt till kalkylblad programvarufiler för både lysrör och ljusa fält bilder. - Beräkna fraktionen av fibrer som uttrycker en viss MyHC i ett fält genom att dividera antalet fluorescerande fibrer i fältet av antalet totala fibrer i motsvarande ljusa fält bilden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bakbenet muskler (dvs, tibialis anterior, soleus) dissekeras från en manlig C57BL/6 mus av okänd ålder var flash frozen genom att sjunka en plast mögel som innehåller muskeln i okt förening i flytande kväve-cooled isopentan. Sedan var använda en cryotome, 8-10 µm seriell avsnitt skär vid-20 ° C och överförs till olika positivt laddade glas bilder12.
Vi valde tibialis anterior och soleus eftersom dessa muskler är huvudsakligen består av snabbt och långsamt-rycka fibrer, respektive13,14. Efter immunhistokemisk färgning för enskild typ I, IIA, IIX och IIB MyHCs, brightfield och fluorescerande bilder fångades. Vänstra panelerna i figur 1 visar delar av en soleus muskel immunostained med typ I, IIA, IIX och IIB MyHC-specifika antikroppar anges i tabell 1.
Figur 1 : Immunhistokemisk färgning av MyHC typ I, IIA och IIB i mus soleus muskel, IIX. Vänstra paneler Visa fluorescerande bilder som kommer från delar av en mus soleus muskel utforskad med primära antikroppar riktade till typ I (BA-F8; ( A), typ IIA (SC-71; ( B), typ IIX (6 H 1; C) och typ IIB (BF-F3; D) MyHCs. Rätt panelerna visar avsnitten där den primär antikropp som används i experimentet skildras i den motsvarande vänstra panelen utelämnades. Barer = 100 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Specifikt, observerat vi betydande fraktioner av fibrer att uttrycka typ I (figur 1A, vänster) och typ IIA MyHCs (figur 1B, vänster) med en hel del av återstående fibrerna visar positiv färgning för typ IIX MyHCs (figur 1C, vänster). Däremot var praktiskt taget ingen typ IIB fibrer uppenbart (figur 1D, vänster). Dessa iakttagelser stämmer överens med tidigare rapporter som soleus muskler består mestadels av typ I, typ IIA och typ IIX fibrer (mindre så) med nästan ingen typ IIB fibrer5,10,12. Viktigast av allt, observerades ingen färgning i sektioner där den primär antikroppen hade utelämnats från protokollet, visar specificiteten av antikroppar (figur 1A-D, rätt panelerna).
Figur 2 : Immunhistokemisk färgning av MyHC typ IIB, IIX, IIA och jag i mus tibialis anterior muskler. Vänstra paneler visar fluorescerande bilder som kommer från delar av en mus tibialis anterior muskel utforskad med primära antikroppar riktade till typ IIB (A), typ IIX (B), typ IIA (C) och typ I (D) MyHCs. Rätt panelerna visar avsnitten där den primär antikropp som används i experimentet skildras i den intilliggande vänstra panelen utelämnades. Barer = 100 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Vi färgade också tibialis anterior muskler med ovannämnda antikropparna. Tibialis anterior muskler bestod mestadels av typ IIB och typ IIX MyHC-positiv fibrer (figur 2A-B, lämnade paneler) med mindre bidrag från fibrer uttrycker typ IIA MyHCs (figur 2C, vänster). praktiskt taget inga fibrer uttrycker typ observerades I MyHC (figur 2D, vänster). Våra data indikerar att musen tibialis anterior består huvudsakligen av snabbt rycka typ IIA, typ IIB och typ IIX fibrer överensstämmer med tidigare studier5,10,13. Återigen, ingen färgning observerades i avsnitten där den primär antikroppen hade utelämnats från protokollet (figur 2A-D, rätt panelerna).
Figur 3 : Upprepade datoriserade fiber segmentering. Brightfield bild av en mus tibialis anterior avsnitt (A). Omvandling av samma bild med våra halvautomatisk algoritm (B). Fluorescerande bild av samma avsnitt visar immunfärgning av typ IIA MyHC (C). Omvandling bilden visar bara typ IIA MyHC-uttryckande fibrer (D). Barer = 100 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
I syfte att morfometriska analys erhölls också brightfield bilder av fälten immunostained. Exemplet som visas i figur 3A är från en tibialis anterior muskler avsnitt utforskad med SC-71 antikroppar riktade till typ IIA MyHCs13. Med vår ursprungliga halvautomatisk algoritm, användes flera bild transformationer för att generera sannolikhet kartor från brightfield bilder. En typisk bild omvandling härrör från brightfield bilden som visas i figur 3A presenteras i figur 3B. Med omvandlingen och pore analysfunktion i Fiji, mätte vi genomsnittlig CSA (891.4 ± 45,0 µm2), maximalt (46,9 ± 1,3 µm) och minsta (26,0 ± 0,8 µm) Genomsnittlig Feret diametrar av varje fiber i fältet. För att testa trohet i våra mätningar, bedömde vi också dessa parametrar i brightfield bilden manuellt. Den genomsnittliga CSA (867.0 ± 52,0 µm2), högsta (45,7 ± 3,5 µm) och lägsta (25,6 ± 1,9 µm) menar Feret diametrarna som fås med förvärvsmetoden mer tråkiga manuella inte var signifikant från metoden halvautomatisk (alla p > 0,05, oparat t-test; (Se tabell 3).
= ”/ files/ftp_upload/56024/56024table3.jpg” / >
Tabell 3: Fiber morfologi och sammansättningen av tibialis anterior muskler immunostained för typ I, IIA, IIB och IIX MyHCs som bestämts av manuella och halvautomatiska analytiska metoder. Menar fiber CSA, menar Feret diametrar och MyHC typ i en mus tibialis anterior kvantifieras via traditionell manuell utvärdering kontra presenterade algoritmen. Observera att kombinerade fraktioner överstiga värdet 1 på grund av förekomsten av fibrer att uttrycka mer än en MyHC typ.
Figur 3 C visar en fluorescerande bild av den samma fält immunostained med antikroppar riktade till typ IIA MyHCs. Positivt-färgade fibrer i fältet valdes av nummer (figur 3D) och används för att bestämma andelen typ IIA MyHC-uttryckande fibrer genom att divideras med det totala antalet fibrer i fältet brightfield transformation (tabell 3 ). Den genomsnittliga CSA, högsta och lägsta Feret diametrar av typ IIA fibrer var då bedömas (tabell 3). Andelen typ jag, typ IIX och typ IIB fibrer, samt deras dimensioner, bestämdes genom att upprepa detta protokoll i seriell avsnitt immunostained med BA-F8, 6H 1 och BF-F3 antikroppar, respektive6,12(tabell 4 ; Figur 4 A-D).
Tabell 4: MyHC innehåll och morfologi i mus soleus och tibialis anterior. Fiber typ kompositioner av representativa delar av soleus och tibialis anterior. Kvantifiering av genomsnittliga CSA, minimal och maximal Feret diametrar av typ I, typ IIA, typ IIX och typ IIB i både soleus och tibialis anterior visas. Data ges som genomsnittlig ±SEM.
Vi bedömde också dessa parametrar i ett fält som erhållits från den soleus muskeln (tabell 4. Figur 4 A-D). 3 052 och 2.876 enskilda fibrer räknades för tibialis anterior och soleus muskler, respektive. Dessa data tillsammans och demonstrera genomförbarheten av vår metod i fiber-typ och morfometriska analys.
Figur 4 : Morfometriska analys datasammanfattning. Fiber-typ kompositioner av representativa delar av tibialis anterior och soleus muskler (A). Kvantifiering av genomsnittet CSA, minimimal och maximal Feret diametrar av typ I, typ IIA, typ IIX och typ IIB fivers både i tibialis anteriort och soleus visas i (B-D). Data ges som betyder ±SEM. betydande skillnader mellan tibialis anterior och soleus indikeras (* betecknar p < 0,05: ** betecknar p < 0,01; *** betecknar p < 0,005; t-test). 3 052 och 2.876 enskilda fibrer räknades för tibialis anterior och soleus muskler, respektive. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande fil: Fiber kvantifiering makro. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här har vi tillhandahållit användbar riktning för identifiering av skelett muskelfibertyperna. Så beskriver vi en ny algoritm för analys av data.
Eftersom våra resultat i hög grad bekräfta de i tidigare rapporter5,8,10 och speglar våra egna manuella mätningar, verkar algoritmen vara korrekt. Fortfarande, vi stött på några ovanliga experimentella fallgropar inklusive oklart fiber gränser följd snittning artefakt. Effekterna av dessa artefakter kan minimeras genom försiktig snittning och vaksamma undersökning av avsnittet bearbetade före analys. I synnerhet kan mindre än optimal bild segmentering kringgås genom flera rundor av omklassificering på samma bild för att uppnå skarpare kontrast.
Det mest avgörande steget i vårt protokoll är steg 4,2 där vi föreskriva de cellulära och extracellulära områdena i avsnittet genom att rita en linje på en viss fiber, därmed särskilja en ”klass 1” eller ”class 2” område. Uppenbarligen, denna manuella åtskillnad är kritisk eftersom den bestämmer gränserna för muskelfibrerna; ett fel i det här steget kommer att negativt påverka bedömningen av fiber dimensioner.
I denna studie sonderade vi sektioner för endast en MyHC i ett visst seriell avsnitt. Men uttrycka vissa fibrer, såsom hybrid fibrer, två typer av MyHC, vägledande av överlappande metabola/funktionell profiler (t.ex., typ IIX och typ IIB). Således fraktionerna av fiber-typ summeras till ett värde > 1 för både soleus och tibialis anterior (figur 4A). Hybrid fibrer kan identifieras med dubbel- eller även trippel-, märkning protokoll såsom de beskrivs av Lee et al. 7och Bloemberg och Quadrilatero5, respektive. Ännu viktigare, kan våra analysmetod tillämpas på dessa mer komplexa färgprotokollen. En annan begränsning av våra protokoll är att det inte är helt automatisk; Vi anser dock att denna mindre eftergift säkerställer att vår metod inte äventyrar rigor skull hastighet.
Medan MyHC kompositioner av både soleus och tibialis anterior muskler observerades i denna studie avspegla resultaten av tidigare studier5,6,7,10,14 , det finns vissa kontraster med tidigare studier angående bedömningen av CSA. Till exempel är våra mätningar av genomsnittliga CSA något mindre än de som rapporterats av antingen Bloemberg och Quadrilatero5 och Allen et al. 15 särskilt våra CSA mätningar varierade 539.86 ± 24.44 µm2 1319.50 ± 57.47 µm2 över fiber typer medan deras sträckte sig ungefär 735.7 ± 31,2 µm2 till 3073.8 ± 51,3 µm2. Dock liknar våra värderingar mer dem som observerats av Augusto o.a. 13 och Lucas et al. 6 som rapporterade genomsnittliga CSAs alltifrån 436 ± 605 µm2 2404 ± 412.5 µm2 och 815 ± 221 µm2 till 1904 ± 570 µm2, respektive. Det finns därför några variabilitet i morfometriska analys av mus bakbenet fibrer över litteraturen.
Immunohistokemi presenterar ett effektivt sätt att märka och klassificera muskelfibrer på grundval av deras MyHC innehåll. Exakt kvantifiering av immunhistokemiska experiment är avgörande för att göra meningsfulla slutsatser om uppgifterna. för detta ändamål är en metod som kan automatisera de tråkiga delarna av analys användbart, speciellt när hundratals, eller tusentals, fibrer behöver mätas och klassificeras. Förutom att tillhandahålla mätningar liknar manuella observationer, ger vår algoritm en korrekt bedömning av dessa uppgifter utan förutfattade meningar; denna fördel över manuella mätningar säkerställer vetenskaplig stringens. I detta avseende, kan vår metod vara användbara vid karakterisering av effekterna av genetiska och experimentell manipulationer som påverkar muskel integritet. Specifikt, MyHC immunohistokemi tillsammans med vår metod för snabb analys kan användas för att bedöma morfologiska och metabola förändringar i muskeln av sjukdomsmodeller såsom muskeldystrofier, ALS och cancer kakexi. Dessutom kan effekten av interventioner som förhindrar atrofi eller orsaka hypertrofi också bedömas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga motstridiga intressen att avslöja.
Acknowledgments
Vi är tacksamma att stiftelsen Boettcher och amyotrofisk lateralskleros Association (nr 17-II-344) för deras stöd för denna forskning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9418-100G | 5% in PBS |
| Hydrophobic Barrier Pap Pen | Scientific Device Laboratory | 9804-02 | |
| Microscope Slides | Globe Scientific | 1358W | |
| Coverglass | Fisher Scientific | 12-544-E | |
| Immumount | Thermo Scientific | 9990402 | |
| Nail Polish | L'Oreal | ||
| Nikon Eclipse TE-200 Inverted Fluorescence and Brightfield Microscope | Discontinued | ||
| SPOT RT/KE | SPOT Imaging Solutions | RT940 | |
| Dell Optiplex | |||
| BA-F8 Primary Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa | monoclonal mouse IgG2b; 1:50 | |
| SC-71 Primary Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa | monclonal mouse IgG1; 1:50 | |
| BF-F3 Primary Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa | monoclonal mouse IgGM; 1:50 | |
| 6H1 Primary Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa | monoclonal mouse IgGM; 1:50 | |
| Alexa Fluor 594 anti-IgG2b | Invitrogen | A21145 | goat anti-mouse; 1:200 |
| Alexa Fluor 488 anti-IgG1 | Invitrogen | A21121 | goat anti-mouse;1:200 |
| Alexa Fluor 594 anti-IgGM | Invitrogen | A21044 | goat anti-mouse;1:200 |
| OCT | Sakura Finetek | 4583 | |
| isopentane | Fisher Scientific | O3551-4 | cool with liguid nitrogen |
| PBS | Fisher Bioreagents | BP665-1 | 10x, dilute to 1x |
| Kim wipes | Kimberly-Clark | 06-666A |
References
- Engel, W. K. The essentiality of histo- and cytochemical studies of skeletal muscle in the investigation of neuromuscular disease. Neurol. 12, 778-784 (1962).
- Dobrowolny, G., et al. Skeletal muscle is a primary target of SOD1G93A-mediated toxicity. Cell Metab. 8, 425-436 (2008).
- Sultana, N., et al. Restricting calcium currents is required for correct fiber type specification in skeletal muscle. Development. 143 (9), 1547-1559 (2016).
- Guth, L., Samaha, F. J. Procedure for the histochemical demonstration of actomyosin ATPase. Exp Neurol. 28 (2), 365-367 (1970).
- Bloemberg, D., Quadrilatero, J. Rapid determination of myosin heavy chain expression in rat, mouse, and human skeletal muscle using multicolor immunofluorescence analysis. PLoS One. 7 (4), (2012).
- Lucas, C. A., Kang, L. H., Hoh, J. F. Monospecific antibodies against the three mammalian fast limb myosin heavy chains. Biochem Biophys Res Commun. 272 (1), 303-308 (2000).
- Lee, C. S., et al. Ca2+ permeation and/or binding to Cav1.1 fine-tunes skeletal muscle Ca2+ signaling to sustain muscle function. Skelet Muscle. 5 (4), (2015).
- Sawano, S., et al. A one-step immunostaining method to visualize rodent muscle fiber type within a single specimen. PLoS One. 11 (11), (2016).
- Meunier, B., Picard, B., Astruc, T., Labas, R. Development of image analysis tool for the classification of muscle fibre type using immunohistochemical staining. Histochem Cell Biol. 134 (3), 307-317 (2010).
- Kammoun, M., Casser-Malek, I., Meunier, B., Picard, B. A simplified immunohistochemical classification of skeletal muscle fibres in mouse. Eur J Histochem. 58 (2), 2254 (2014).
- Kumar, A., Accorsi, A., Rhee, Y., Girgenrath, M. Do's and don'ts in the preparation of muscle cryosections for histological analysis. J Vis Exp. (99), (2015).
- Schiaffino, S., et al. Three myosin heavy chain isoforms in type 2 skeletal muscle fibres. J Muscle Res Cell Motil. 10 (197), (1989).
- Augusto, V., Padovani, C. R., Campos, G. E. R. Skeletal muscle fiber types in C57Bl6j mice. Braz J Morphol Sci. 21 (2), 89-94 (2004).
- Schiaffino, S., Reggiani, C. Fiber types in mammalian skeletal muscles. Physiol Rev. 91 (4), 1447-1531 (2011).
- Allen, D. L., Harrison, B. C., Maass, A., Bell, M. L., Byrnes, W. C., Leinwand, L. A. Cardiac and skeletal muscle adaptations to voluntary wheel running in the mouse. J Appl Physiol. 90 (5), 1900-1908 (2001).
