Summary
Immunhistokemisk farvning for myosin heavy chain isoformer fremstod som den state-of-the-art diskriminator skelet muskel fiber-type (dvs., type I-, type II, type IIX, type IIB). Her præsenterer vi en farvning protokol sammen med en roman semi-automatiske algoritme, der letter hurtig vurdering af fiber-type og fiber morfologi.
Abstract
I år, var sondringer mellem skelet muskel fibertyper bedst visualiseret ved myosin ATPase pletter. Mere nylig, immunhistokemisk farvning for myosin heavy chain (MyHC) isoformer fremstod som en finere diskriminator af fiber-type. Type I, type II, type IIX og type IIB fibre kan nu blive identificeret med præcision baseret på deres MyHC profil; men manuel analyse af disse data kan være langsom og ned-højre kedelig. I denne henseende, er hurtig, nøjagtig vurdering af fiber-type sammensætning og morfologi en meget ønskelig værktøj. Vi præsenterer her, en protokol til state-of-the-art immunhistokemisk farvning af MyHCs i frosne dele fremstillet af mus hindlimb muskel i koncert med en roman semi-automatiske algoritme, der accelererer analyse af fiber-type og fiber morfologi. Som forventet, den soleus muskel vises farvning type I og type IIA fibre, men ikke for type IIX eller type IIB fibre. På den anden side tibialis anterior musklen bestod overvejende af type IIX og type IIB fibre, en lille brøkdel af type II fibre og ringe eller ingen type I-fibre. Flere billede transformationer blev brugt til at generere sandsynlighed kort med henblik på måling af forskellige aspekter af fiber morfologi (dvs.tværsnitsareal (CSA), maksimal og minimal Feret diameter). De værdier, der er opnået for disse parametre blev derefter sammenlignet med manuelt opnåede værdier. Ingen væsentlige forskelle blev observeret mellem enten tilstand af analyse med hensyn til CSA, maksimal eller minimal Feret diameter (alle p > 0,05), der angiver nøjagtigheden af vores metode. Således, vores immunfarvning analyse protokollen kan anvendes til undersøgelse af effekter på muskel sammensætning i mange modeller af aldring og myopathy.
Introduction
Det har været kendt i nogen tid, at skeletmuskulaturen består af enkelt fibre af mange typer1. I første omgang to grupper af fibre blev karakteriseret baseret på deres kontraktile egenskaber og ved navn, passende, langsom-spjæt (type I-) og fast-spjæt (type II). Disse kategorier blev yderligere skelnes på grundlag af fiber stofskifte. Type I-siden fibre er rige på mitokondrier og afhængige af oxidative metabolisme, de blev belyst ved håndfast positive nikotinamidadenindinucleotid tetrazolium reduktase (NADH-TR) diaphorase2 eller succinat dehydrogenase (SDH)3 farvning. Derimod type II fibre udstillet mindre og varierende grader af NADH-TR diaphorase eller SDH farvning og var opdelt i to fast-spjæt undergrupper (type IIA og type IIB) lidt groft baseret på deres relative oxidative kapacitet. Disse sondringer mellem fibre har været visualiseret mere effektivt af myosin ATPase pletter når type I fibre pletten mørke efter en præ-inkubation ved pH 4,0 og type IIB fibre absorbere bundfald følgende præ-inkubation ved pH 10,0 med type IIA fibre farvning intermediately4.
Mere nylig, immunhistokemisk farvning for myosin heavy chain (MyHC) isoformer fremstod som en finere diskriminator af fiber-type5. Type I, type IIA og type IIB fibre kan alle identificeres med præcision baseret på deres MyHC profil. Desuden en anden fast-spjæt metabolisk mellemliggende fiber type, type IIX, er blevet identificeret6. Hybrid fibre giver udtryk for mere end én MyHC er også blevet bekræftet5,7,8. Nogle arter som katten og bavian er kendt for ikke at udtrykke Type IIB MyHCs6. Selvom MyHC immunfarvning er i øjeblikket den state-of-the-art vurdering af muskel sammensætning, er analyse af data hentet via denne teknik besværlige og tidskrævende uden automatiseret hjælp. Med henblik herpå, en håndfuld af semi-automatiserede metoder til at analysere disse data har været udviklede5,9,10. Vi præsenterer her, et relativt standard-protokol til immunhistokemiske identifikation af muskel fiber-type5,7,8,10, sammen med en semi-automatiske roman algoritme, der accelererer analyse af fiber-type og fiber morfologi med nøjagtighed.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
alle procedurer, der involverer mus blev godkendt ved University of Colorado-Anschutz Campus institutionelle dyr lægebehandling og brug Udvalget (91813(05)1D).
1. dag 1: primære (1°) immunfarvning med bovint serumalbumin (BSA) blokering
- lufttørre frosne dele af mus hindlimb muskel (fx, tibialis anterior, soleus) monteret på ladet dias for ~ 30 min 11. tegne en kant omkring sektioner ved hjælp af en hydrofobe barriere PAP pen.
- Sted ~ 250 µL af 5% BSA/fosfatbufferet saltopløsning (BSA/PBS) på de enkelte dias til at blokere ikke-specifikke antistof bindende. Inkuber dias ved stuetemperatur for 1 h.
- Samtidig med at blokere, forberede 1:50 fortyndinger af det 1° antistof supernatanten i 5% BSA/PBS (alle er musen monoklonale antistoffer, se tabel 1 6 , 12); forberede 250 µL af løsning pr. slide. Holde 1° antistof bestande og fortyndinger på ice.
tabel 1: primære antistoffer bruges til at skelne MyHCs.
- efter aspiration af 5% BSA/PBS blokerende løsning, tilføje 250 µL 1° antistof fortynding til de passende dias. Tilføje 250 µL af 5% BSA/PBS til sekundær (2°) kun antistof-negative kontrol dias.
- Incubate ved 4 ° C i 24-48 timer i et fugtigt miljø.
Bemærk: En petriskål, som er omfattet af aluminiumsfolie med afdæmpet filtrerpapir kan tjene som en passende inkubation afdeling.
2. Dag 2:2 ° immunfarvning med fluorescerende antistoffer
- Opsug 1° antistof løsning eller kontrollere 5% BSA/PBS løsning. Vask alle dias tre gange, 10 min med 5% BSA.
- Mens vask, forberede 1:200 fortyndinger i oprenset, fluorophore-konjugeret 2 ° antistoffer i 5% BSA/PBS (Se tabel 2, alle er ged anti-mus). Forberede 250 µL af løsningen pr dias. Holde 2° fluorophore-konjugerede antistoffer i mørke på ice.
tabel 2: Fluorophore-konjugeret sekundære antistoffer bruges til at visualisere primære antistof anerkendelse af MyHCs.
- efter aspiration af den tredje anvendelsen af 5% BSA/PBS blokerende løsning, tilføje 250 µL af 2° antistof fortynding på alle dias. Inkuber i 90 min ved stuetemperatur i et mørkt, fugtigt miljø.
- Aspirat 2° antistof løsning. Vask alle dias tre gange, 10 min med 5% BSA/PBS.
- Skylles med PBS. Tørre i 10 min.
- Montere daekglas med en ikke-permanent, lav viskositet vandig montering medium.
- Når tør, forsegle dias kanterne med neglelak. Tør og opbevar i en mørk slidebox.
3. Imaging dias med epifluorescensmikroskop mikroskopi
- ren dias med en lille, 70% ethanol-gennemblødt lab-wipe.
- Hent digitale billeder af immunostained muskel sektioner ved hjælp af et epifluorescensmikroskop, udstyret med en fotografisk apparat (Se Tabel af materialer).
- Vælg et område på ca 1 mm 2 (10 X mål, 1.4 NA).
- Se Alexa 488-konjugeret 2° antistof fluorescens via en 505 nm long-pass filter. Se fluorescens genereret af excitation af Alexa 594-konjugeret 2° antistoffer via en 595 nm long-pass filter. Digitalisere billeder med en PC computer udstyret med en kompatibel billedbehandlingsprogrammer. Omfatter skalalinjen fra imaging software til senere analyse.
4. Analyse af billeder med Fiji
Bemærk: inden du fortsætter med analyse, Fiji (tilgængelig frit fra National Institutes of Health, Bethesda, MD) skal være installeret via https://imagej.net/Fiji/Downloads. Også er makro bruges i denne proces fastsat i Supplerende fil. Placer filen makro i et let tilgængeligt register.
- Belastning et brightfield billede af en markeret sektion i Fiji. Naviger til Plugins → segmentering → Trainable Weka segmentering.
- For at fastsætte de cellulære områder af afsnittet, tegne en linje på en fiber, og klik på " tilføje til klasse 1 ". Derefter, trække en streg på plads mellem fibre, og klik på " tilføje til klasse 2 " til at markere de ekstracellulære domæner. Gentag, indtil der er 5-10 etiketter i hver klasse.
- Klik tog klassificering. På den resulterende røde og grønne overlay, tilføje flere etiketter manuelt (Se trin 4.2) til forkert segmenterede stykker af billedet, hvis det er nødvendigt. Gentag indtil fibre (rød) er passende adskilt fra rummet mellem fibre (grøn).
- Klik " få sandsynlighed " og gemme billedet i en nyligt mærket mappe.
- Gentag ovenstående procedure (trin 4,2-4,3) med fluorescerende billedet taget fra det samme felt. Mærke immunostained fibre som " klasse 1 " og alle ikke-fluorescerende regioner som " klasse 2 ". Gemme den resulterende sandsynlighed kort til den samme mappe, hvor forarbejdede brightfield billedet gemmes.
- Åbne en tidligere gemt sandsynlighed kort i Fiji. Tegne en lige streg på skalalinjen leveres af imaging-software. Gå til at analysere → sat skala. Ændre parametre (dvs., kendt distance, enhed for længde) til deres korrekte værdier som angivet af skalalinjen, så tjek den " Global " boks at standardisere skala for hvert billede.
- Naviger til Plugins → makroer → køre → Tyagi et al. fiber kvantificering macro.ijm (Se Supplerende fil). Umiddelbart, vises et navigationsruden. Åbn billedet ' s vært omslag; en dialogboks vises. For hver dialogboks, ændre den " baggrund " dropdown værdi til " lys. "
Bemærk: mappen udfyldes nu med billeder af fiber konturer og software regnearksfiler af resultaterne (CSA og Feret diameter er mest relevante for kvantificere fiber morfologi; målte parametre kan justeres i analysere sæt målinger). Fiber morfologi data genereret af funktionen pore-analyse af Fiji vil automatisk blive overført til software-regnearksfiler til både fluorescerende og lyse felt billeder. - Beregne brøkdel af fibre giver udtryk for en given MyHC i et felt ved at dividere antallet af fluorescerende fibre i feltet med antallet af samlede fibre i den tilsvarende lysfelt billede.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hindlimb muskler (dvs., tibialis anterior, soleus) dissekeret fra en mandlig C57BL/6 mus af ukendt alder var flash frosset ved at sænke en plast støber indeholdende musklen i OLT sammensatte i flydende nitrogen-kølet isopentane. Derefter, ved hjælp af en cryotome, 8-10 µm seriel afsnit skåret på-20 ° C og overført til forskellige positivt ladede glas dias12.
Vi valgte tibialis anterior og soleus fordi disse muskler er overvejende består af hurtigt og langsomt spjæt fibre, henholdsvis13,14. Efter immunhistokemisk farvning for enkelte type I, II a, IIX og IIB MyHCs, brightfield og fluorescerende billeder blev taget til fange. De venstre paneler af figur 1 viser dele af en soleus muskel immunostained med typen I, II a, IIX og IIB MyHC-specifikke antistoffer, der er anført i tabel 1.
Figur 1 : Immunhistokemisk farvning af MyHC type I, II a, IIX og IIB i mus soleus muskel. Venstre paneler viser fluorescerende billeder fremstillet af dele af en mus soleus muskel aftestede med primære antistoffer rettet til type I (BA-F8;- A), type IIA (SC-71; B), type IIX (6 H 1; C) og type IIB (BF-F3; D) MyHCs. Rigtige paneler viser de afsnit, hvor den primære antistof bruges i eksperimentet afbildet i den tilsvarende venstre panel blev udeladt. Barer = 100 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Specifikt, observeret vi betydelige brøkdele af fibre udtrykker type I (fig. 1A, venstre) og type IIA MyHCs (figur 1B, venstre) med en rimelig mængde af resterende fibre vise positiv farvning for type IIX MyHCs (figur 1C, venstre). Derimod var næsten ingen type IIB fibre indlysende (figur 1D, venstre). Disse bemærkninger er i overensstemmelse med tidligere betænkninger, som soleus muskler består for det meste af type I, type IIA og type IIX fibre (mindre grad) med næsten ingen type IIB fibre5,10,12. Vigtigere, blev ingen farvning observeret i sektioner, hvor det primære antistof havde udeladt fra protokollen, demonstrerer specificiteten af antistoffer (figur 1A-D, rigtige paneler).
Figur 2 : Immunhistokemisk farvning af MyHC type IIB, IIX, IIA og jeg i mus tibialis anterior musklen. Venstre paneler viser fluorescerende billeder fremstillet af dele af en mus tibialis anterior musklen aftestede med primære antistoffer rettet til typen IIB (A), type IIX (B), IIA (C) og type I-(D) MyHCs. Rigtige paneler viser de afsnit, hvor den primære antistof bruges i eksperimentet afbildet i den tilstødende venstre panel blev udeladt. Barer = 100 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Vi også farves tibialis anterior muskler med de ovennævnte antistoffer. Tibialis anterior muskler bestod for det meste af type IIB og type IIX MyHC-positive fibre (figur 2A-B, venstre paneler) med mindre bidrag fra fibre udtrykker type IIA MyHCs (figur 2C, venstre); stort set ingen fibre udtrykker type jeg MyHC blev observeret (figur 2D, venstre). Vores data, der viser at musen tibialis anterior består overvejende af hurtige ryk type IIA, type IIB og type IIX fibre er i overensstemmelse med tidligere undersøgelser5,10,13. Igen, ingen farvning blev observeret i de afsnit, hvor det primære antistof havde udeladt fra protokollen (figur 2A-D, rigtige paneler).
Figur 3 : Gentog edb fiber segmentering. Brightfield billede af en mus tibialis anterior afsnit (A). Transformation af det samme billede ved hjælp af vores semi-automatiske algoritme (B). Fluorescerende billedet af den samme sektion viser immunfarvning af type IIA MyHC (C). Transformation billede viser kun type IIA MyHC-udtrykker fibre (D). Barer = 100 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Med henblik på morfometrisk analyse, blev brightfield billeder af felterne immunostained også indhentet. Eksemplet vist i figur 3A er fra en tibialis anterior musklen afsnit aftestede med SC-71 antistoffer rettet mod type IIA MyHCs13. Ved hjælp af vores oprindelige semi-automatiske algoritme, blev flere billede transformationer brugt til at generere sandsynlighed kort fra brightfield billeder. Et typisk billede transformation stammer fra det brightfield billede vist i figur 3A er præsenteret i figur 3B. Brug transformationen og funktionen pore analyse af Fiji, målte vi gennemsnitlige CSA (891.4 ± 45,0 µm2), maksimum (46,9 ± 1.3 µm) og minimum (26.0 ± 0,8 µm) betyder Feret diametre af hver fiber i feltet. For at teste troskab i vores målinger, vurderet vi også disse parametre i brightfield billedet manuelt. Den gennemsnitlige CSA (867.0 ± 52.0 µm2), maksimum (45,7 ± 3,5 µm) og minimum (25.6 ± 1.9 µm) betyde Feret diametre fremstillet ved hjælp af metoden mere kedelig manuel erhvervelse ikke var signifikant forskellig fra den semi-automatiserede metode (alle p > 0,05, uparret t-test; Tabel 3).
= "/ files/ftp_upload/56024/56024table3.jpg" / >
Tabel 3: Fiber morfologi og sammensætning af tibialis anterior musklen immunostained for type I, IIA, IIB og IIX MyHCs som fastsat af manuelle og halvautomatiske analytiske metoder. Mener fiber CSA, mener Feret diametre og MyHC type i en mus tibialis anterior kvantificeret via traditionel manuel evaluering versus den præsenterede algoritme. Bemærk venligst at kombineret fraktioner overstiger en værdi på 1 på grund af tilstedeværelsen af fibre giver udtryk for mere end én MyHC type.
Figur 3 C viser en fluorescerende billedet af den samme felt immunostained med antistoffer rettet til type IIA MyHCs. Positivt-farvede fibre i feltet var udvalgt af antallet (figur 3D) og bruges til at bestemme brøkdel af type IIA MyHC-udtrykker fibre ved at dividere det samlede antal fibre i feltet brightfield transformation (tabel 3 ). Den gennemsnitlige CSA, maksimale og minimale Feret diametre af type II fibre blev derefter vurderet (tabel 3). Andelen af type jeg, type IIX og type IIB fibre, samt deres dimensioner, blev bestemt ved at gentage denne protokol i seriel afsnit immunostained med BA-F8, 6H 1 og BF-F3 antistoffer, henholdsvis6,12(tabel 4 ; Figur 4 A-D).
Tabel 4: MyHC indhold og morfologi i mus soleus og tibialis anterior. Fiber type kompositioner af repræsentative dele af soleus og tibialis anterior. Kvantificering af gennemsnitlige CSA, minimal og maksimal Feret diametre af type I, type IIA, type IIX og type IIB i både soleus og tibialis anterior er vist. Data er givet som betyder ±SEM.
Vi vurderede også disse parametre i et felt, der er fremstillet af soleus muskel (tabel 4; Figur 4 A-D). 3,052 og 2,876 individuelle fibre blev talt for tibialis anterior og soleus muskler, henholdsvis. Taget sammen, viser disse data mulighederne for vores metode i fiber-type og morfometrisk analyse.
Figur 4 : Morfometrisk analyse dataoversigt. Fiber-type kompositioner af repræsentative dele af tibialis anterior og soleus muskler (A). Kvantificering af gennemsnit CSA, minimimal og maksimal Feret diametre af type I, type IIA, type IIX og type IIB fivers i både tibialis anteriort og soleus er vist i (B-D). Data er givet som betyde ±SEM. væsentlige forskelle mellem tibialis anterior og soleus angives (* angiver p < 0,05: ** angiver p < 0,01; *** betegner p < 0,005; t-test). 3,052 og 2,876 individuelle fibre blev talt for tibialis anterior og soleus muskler, henholdsvis. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende fil: Fiber kvantificering makro. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her har vi givet nyttige retning til identifikation af skelet muskel fibertyper. Dermed, beskriver vi en roman algoritme til analyse af data.
Da vores resultater i vid udstrækning bekræfte dem i tidligere rapporter5,8,10 og afspejler vores egen manuelle målinger, synes algoritmen, der at være præcis. Stadig, vi stødte på nogle sjældne eksperimentelle faldgruber herunder uklart fiber grænser som følge af skæring artefakt. Virkningen af disse artefakter kan minimeres gennem omhyggelig afsnitsinddeling og årvågne gennemgang af afsnittet forarbejdet inden analyse. Især kan mindre end optimal billedsegmentering omgås gennem flere runder af omklassificering på det samme billede til at opnå skarpere kontrast.
Det mest afgørende skridt i vores protokol er trin 4.2 hvor fastsætter vi de cellulære og ekstracellulære områder af afsnittet ved at tegne en linje på en given fiber, dermed adskille en "klasse 1" eller "klasse 2" område. Naturligvis, denne manuel skelnen er kritisk, fordi den fastlægger grænserne for muskelfibre; en fejl i dette trin vil påvirke vurderingen af fiber dimensioner.
I denne undersøgelse aftestede vi sektioner til kun én MyHC i en given serie sektion. Dog udtrykke nogle fibre, såsom hybrid fibre, to typer af MyHC, vejledende overlappende metaboliske/funktionelle profiler (f.eks.type IIX og type IIB). Således brøkdele af fiber-type sammenlagt til en værdi > 1 for både soleus og tibialis anterior (figur 4A). Hybrid fibre kan identificeres med dobbelt-, eller endda tredobbelt-, mærkning protokoller som beskrevet af Lee et al. 7og af Bloemberg og Quadrilatero5, henholdsvis. Vigtigere, kan vores metode til analyse anvendes til disse mere komplekse farvningsprotokoller. En anden begrænsning af vores protokol er, at det ikke er fuldt automatiske; Vi mener imidlertid, at denne mindre indrømmelse sikrer, at vores metode ikke kompromitterer rigor af hensyn til hastigheden.
Mens MyHC kompositioner af både soleus og tibialis anterior muskler observeret i denne undersøgelse afspejle resultaterne af tidligere undersøgelser5,6,7,10,14 , er der nogle kontraster med tidligere undersøgelser vedrørende vurderingen af CSA. For eksempel er vores målinger af gennemsnitlige CSA noget mindre end dem, der indberettes af enten af Bloemberg og Quadrilatero5 og Allen mfl. 15 især vores CSA målinger varierede fra 539.86 ± 24.44 µm2 til 1319.50 ± 57.47 µm2 på tværs af fibertyper mens deres strakte sig nogenlunde 735.7 ± 31,2 µm2 til 3073.8 ± 51,3 µm2. Men vores værdier mere nøje ligner dem observeret af Augusto et al. 13 og Lucas et al. 6 der rapporterede gennemsnitlige kemiske sikkerhedsvurderinger spænder fra 436 ± 605 µm2 2404 ± 412.5 µm2 og 815 ± 221 µm2 til 1904 ± 570 µm2, henholdsvis. Dermed, nogle variation i morfometrisk analyse af mus hindlimb fibre eksisterer på tværs af litteraturen.
Immunhistokemi præsenterer en effektiv måde at navngive og klassificere muskelfibre ud fra deres MyHC indhold. Nøjagtig kvantificering af immunhistokemisk eksperimenter er afgørende for at gøre meningsfulde konklusioner om data; med henblik herpå er en metode, der kan automatisere de kedelige dele af analysen en nyttig, især når hundredvis eller endda tusindvis af fibre skal måles og klassificeret. Ud over at give målinger svarende til manuel observationer, giver vores algoritme en nøjagtig vurdering af disse data uden fordomme; denne fordel i forhold til manuel målinger sikrer videnskabelig stringens. I denne forbindelse kan vores metodologi være nyttige i karakterisering af effekterne af genetiske og eksperimentelle manipulationer, der påvirker muskel integritet. Specifikt, MyHC Immunhistokemi kombineret med vores metode til hurtig analyse kan anvendes til at vurdere morfologiske og metaboliske ændringer i muskel sygdom modeller såsom muskuløse dystrophies, ALS og kræft kakeksi. Desuden kan også blive vurderet effekten af interventioner, der forhindrer atrofi eller forårsage hypertrofi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen modstridende interesser at videregive.
Acknowledgments
Vi er taknemmelige for instituttets Boettcher og foreningen Amyotrofisk Lateral sklerose (#17-II-344) for deres støtte til denne forskning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9418-100G | 5% in PBS |
| Hydrophobic Barrier Pap Pen | Scientific Device Laboratory | 9804-02 | |
| Microscope Slides | Globe Scientific | 1358W | |
| Coverglass | Fisher Scientific | 12-544-E | |
| Immumount | Thermo Scientific | 9990402 | |
| Nail Polish | L'Oreal | ||
| Nikon Eclipse TE-200 Inverted Fluorescence and Brightfield Microscope | Discontinued | ||
| SPOT RT/KE | SPOT Imaging Solutions | RT940 | |
| Dell Optiplex | |||
| BA-F8 Primary Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa | monoclonal mouse IgG2b; 1:50 | |
| SC-71 Primary Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa | monclonal mouse IgG1; 1:50 | |
| BF-F3 Primary Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa | monoclonal mouse IgGM; 1:50 | |
| 6H1 Primary Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa | monoclonal mouse IgGM; 1:50 | |
| Alexa Fluor 594 anti-IgG2b | Invitrogen | A21145 | goat anti-mouse; 1:200 |
| Alexa Fluor 488 anti-IgG1 | Invitrogen | A21121 | goat anti-mouse;1:200 |
| Alexa Fluor 594 anti-IgGM | Invitrogen | A21044 | goat anti-mouse;1:200 |
| OCT | Sakura Finetek | 4583 | |
| isopentane | Fisher Scientific | O3551-4 | cool with liguid nitrogen |
| PBS | Fisher Bioreagents | BP665-1 | 10x, dilute to 1x |
| Kim wipes | Kimberly-Clark | 06-666A |
References
- Engel, W. K. The essentiality of histo- and cytochemical studies of skeletal muscle in the investigation of neuromuscular disease. Neurol. 12, 778-784 (1962).
- Dobrowolny, G., et al. Skeletal muscle is a primary target of SOD1G93A-mediated toxicity. Cell Metab. 8, 425-436 (2008).
- Sultana, N., et al. Restricting calcium currents is required for correct fiber type specification in skeletal muscle. Development. 143 (9), 1547-1559 (2016).
- Guth, L., Samaha, F. J. Procedure for the histochemical demonstration of actomyosin ATPase. Exp Neurol. 28 (2), 365-367 (1970).
- Bloemberg, D., Quadrilatero, J. Rapid determination of myosin heavy chain expression in rat, mouse, and human skeletal muscle using multicolor immunofluorescence analysis. PLoS One. 7 (4), (2012).
- Lucas, C. A., Kang, L. H., Hoh, J. F. Monospecific antibodies against the three mammalian fast limb myosin heavy chains. Biochem Biophys Res Commun. 272 (1), 303-308 (2000).
- Lee, C. S., et al. Ca2+ permeation and/or binding to Cav1.1 fine-tunes skeletal muscle Ca2+ signaling to sustain muscle function. Skelet Muscle. 5 (4), (2015).
- Sawano, S., et al. A one-step immunostaining method to visualize rodent muscle fiber type within a single specimen. PLoS One. 11 (11), (2016).
- Meunier, B., Picard, B., Astruc, T., Labas, R. Development of image analysis tool for the classification of muscle fibre type using immunohistochemical staining. Histochem Cell Biol. 134 (3), 307-317 (2010).
- Kammoun, M., Casser-Malek, I., Meunier, B., Picard, B. A simplified immunohistochemical classification of skeletal muscle fibres in mouse. Eur J Histochem. 58 (2), 2254 (2014).
- Kumar, A., Accorsi, A., Rhee, Y., Girgenrath, M. Do's and don'ts in the preparation of muscle cryosections for histological analysis. J Vis Exp. (99), (2015).
- Schiaffino, S., et al. Three myosin heavy chain isoforms in type 2 skeletal muscle fibres. J Muscle Res Cell Motil. 10 (197), (1989).
- Augusto, V., Padovani, C. R., Campos, G. E. R. Skeletal muscle fiber types in C57Bl6j mice. Braz J Morphol Sci. 21 (2), 89-94 (2004).
- Schiaffino, S., Reggiani, C. Fiber types in mammalian skeletal muscles. Physiol Rev. 91 (4), 1447-1531 (2011).
- Allen, D. L., Harrison, B. C., Maass, A., Bell, M. L., Byrnes, W. C., Leinwand, L. A. Cardiac and skeletal muscle adaptations to voluntary wheel running in the mouse. J Appl Physiol. 90 (5), 1900-1908 (2001).
