Summary
נוגדן של צולבות הקישור חוטים שרירן שרשרת כבדה איזופורמים התפתחה כמבדיל המדינה-of-the-art של סיבי השריר והשלד-סוג (קרי, סוג, הקלד IIA, הקלד IIX, הקלד IIB). כאן, אנו מציגים פרוטוקול מכתימים יחד עם אלגוריתם חצי אוטומטיות הרומן המקל על הערכה מהירה של מורפולוגיה סיבים מסוג וסיבים.
Abstract
במשך שנים, היו הבחנות בין סוגי סיבי שריר השלד הטוב דמיינו ידי מכתימה צולבות הקישור חוטים שרירן-ATPase. לאחרונה, נוגדן של צולבות הקישור חוטים שרירן שרשרת כבדה (MyHC) איזופורמים התפתחה מבדיל עדינה יותר של סוג סיבים. מסוג I, הקלד IIA, הקלד IIX ו סיבים מסוג IIB עכשיו יכול להיות מזוהה עם דיוק בהתבסס על הפרופיל שלהם MyHC; עם זאת, ניתוח ידנית של נתונים אלו יכול להיות איטי ולא גמור מייגע. בהקשר זה, הערכה מהירה, מדויקת של סיבים מסוג הרכב מורפולוגיה הוא כלי מאוד רצוי. כאן, אנו מציגים עבור המדינה-of-the-art נוגדן של MyHCs בסעיפים קפוא המתקבל העכבר שריר hindlimb בהופעה עם אלגוריתם חצי אוטומטיות הרומן שמאיץ את ניתוח סיבים מסוג וסיבים מורפולוגיה של פרוטוקול. כצפוי, שריר הסוליה מוצג צביעת עבור מסוג I ו סיבים IIA, אך לא עבור סוג IIX או סוג סיבי IIB. מצד שני, שריר השוקה הקדמי היה ברובו מורכב סוג IIX ו- type IIB סיבים, חלק קטן של סוג IIA סיבים, מעט או ללא סוג סיבים. מספר תמונות המרות שימשו כדי ליצור מפות ההסתברות לצורך מדידת היבטים שונים של סיבים מורפולוגיה (קרי, שטח חתך הרוחב (CSA), קוטר Feret מקסימלית וללא מינימלי). הערכים שהתקבלו עבור פרמטרים אלו הושוו עם ערכים שהושג באופן ידני. אין הבדלים משמעותיים נצפו בין בכל מצב של ניתוח לגבי CSA, קוטר Feret מינימלי או מקסימלי (כל p > 0.05), המציין את הדיוק של שיטת שלנו. לפיכך, פרוטוקול הניתוח שלנו immunostaining ניתן להחיל את החקירה של השפעות על השריר הרכב דגמים רבים של הזדקנות, מיופתיה.
Introduction
זה כבר ידוע מזה זמן כי שרירי השלד מורכב של סיבי יחיד של סוגים רבים1. בתחילה, שתי קבוצות של סיבי מאופיינים על סמך מאפייניהם כויץ ו בשם, בהתאם, איטי עווית (סוג), במהירות עווית (סוג II). קטגוריות אלה היו מכובדים נוספים על בסיס סיבים חילוף החומרים. מאז סוג סיבים עשירים המיטוכונדריה, מסתמך על מטבוליזם חמצוני, הם היו הובהר על-ידי nicotinamide אדנין dinucleotide robustly חיובי-tetrazolium רדוקטאז (NADH-TR) diaphorase2 או succinate דהידרוגנאז (SDH)3 מכתים. לעומת זאת, סוג II סיבי הציג פחותה מעלות משתנה של NADH-TR diaphorase או SDH מכתים, חולקו לשתי תת-קבוצות במהירות עווית (מסוג IIA ו- IIB) במידה מסוימת בגסות על סמך קיבולות חמצוני היחסי שלהם. הבדלים אלו בין סיבי היה רוחי בצורה יעילה יותר על ידי צביעת צולבות הקישור חוטים שרירן-ATPase שבו סוג סיבים כתם כהה לאחר דגירה מראש ב- pH 4.0 ולקלוט מסוג IIB סיבי precipitate דגירה לפני הבא ב- pH 10.0 בסיבי IIA סוג צביעת intermediately4.
לאחרונה, נוגדן של צולבות הקישור חוטים שרירן שרשרת כבדה (MyHC) איזופורמים התפתחה מבדיל עדינה יותר של סיבים מסוג5. סוג אני, הקלד IIA, מסוג IIB סיבים ניתן כל לזהות בדייקנות בהתבסס על הפרופיל שלהם MyHC. בנוסף, במהירות עווית סמויה ביניים סיבים מסוג אחר, הקלד IIX, היה מזוהה6. סיבי היברידית לבטא MyHC אחד או יותר היו גם אושרו5,7,8. מינים מסוימים כגון החתול הבבון ידועים לא מסוג IIB MyHCs אקספרס6. למרות MyHC immunostaining הוא כעת הערכת המדינה-of-the-art הקומפוזיציה שריר, הניתוח של הנתונים שהושגו באמצעות טכניקה זו היא מסורבלת ולדרוש זמן רב ללא עזרה אוטומטית. לשם כך, קומץ בשיטות אוטומטיות למחצה כדי לנתח את הנתונים האלה כבר מפותחת5,9,10. כאן, אנו מציגים פרוטוקול סטנדרטי יחסית לזיהוי immunohistochemical של סיבי השריר-סוג5,7,8,10, יחד עם רומן חצי אוטומטיות אלגוריתם שמאיץ את ניתוח של מורפולוגיה סיבים מסוג וסיבים עם דיוק.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
בכל ההליכים הכרוכים עכברים אושרו על ידי אוניברסיטת קולורדו-Anschutz קמפוס מוסדיים חיה טיפול רפואי ועל שימוש הוועדה (91813(05)1D).
1. יום 1: ראשי (1°) Immunostaining עם חסימת שור אלבומין (BSA)
- Air-dry קפוא מקטעי שריר hindlimb העכבר (למשל, השוקתי הקדמי, הסוליה) רכוב על שקופיות טעונה ~ 30 דקות 11. לשרטט גבול סביב הסעיפים באמצעות עט PAP הידרופובי המכשול.
- המקום ~ µL 250 תמיסת מלח 5% BSA/פוספט buffered (BSA/PBS) בכל שקופית כדי לחסום נוגדן ספציפי שאינו מחייב. דגירה שקופיות בטמפרטורת החדר במשך ה 1
- תוך חסימת, להכין 1:50 דילולים של הנוגדן 1° supernatant ב 5% BSA/PBS (כל הם נוגדנים חד-שבטיים העכבר; ראה טבלה 1 6 , 12); להכין 250 µL של פתרון לכל שקופית. תמשיך 1° נוגדן מניות ואגרות דילולים קרח
טבלה 1: נוגדנים העיקרי היה להבחין MyHCs.
- בעקבות השאיפה של הפתרון חסימה של BSA/PBS 5%, להוסיף 250 µL של 1° נוגדן דילול על השקופיות המתאים. להוסיף 250 שקופיות BSA/PBS משני (2°) נוגדן בלבד שליטה שלילי µL של 5%.
- Incubate ב 4 מעלות צלזיוס במשך 24-48 שעות בסביבה לחה.
הערה: צלחת פטרי יתעופף עם לחה מסנן נייר עשוי לשמש חדר מתאים הדגירה.
2. יום 2:2 ° Immunostaining עם פלורסנט נוגדנים
- תשאף 1° נוגדן פתרון או לשלוט פתרון BSA/PBS 5%. תשטוף הכל מחליק שלוש פעמים, 10 דקות עם 5% BSA.
- בעת הכביסה, להכין 1:200 דילולים של הנוגדנים מטוהרים, fluorophore מצומדת ° 2 ב- 5% BSA/PBS (ראה טבלה 2, כל הם העכבר נגד עז). להכין µL 250 של פתרון לכל שקופית. להחזיק 2° fluorophore מצומדת נוגדנים בחשכה על קרח
בטבלה 2: נוגדנים משניים Fluorophore מצומדת נהגו להמחיש העיקרי נוגדן זיהוי של MyHCs.
- בעקבות השאיפה של היישום השלישי של 5% BSA/PBS פתרון חסימה, להוסיף 250 µL של דילול נוגדן 2° על כל השקופיות. תקופת דגירה של 90 דקות בטמפרטורת החדר בסביבה האפל, הלח.
- וביופסיה 2° נוגדן פתרון. תשטוף הכל מחליק שלוש פעמים, 10 דקות עם 5% BSA/PBS.
- שטיפה עם PBS. להתייבש במשך 10 דקות
- הר את coverglass עם מדיום הרכבה מימית לא קבועים, צמיגות נמוכה.
- כאשר יבש, לאטום את הקצוות שקופיות עם לק. יבש ואחסן slidebox האפל.
3. הדמיה שקופיות עם מיקרוסקופ Epifluorescence
- לנקות את השקופיות עם קטן, 70% ספוג אתנול מעבדה-מחיקה.
- קבל תמונות דיגיטליות סעיפים שריר immunostained באמצעות מיקרוסקופ epifluorescence מצויד עם מנגנון הצילום (ראה את הטבלה של חומרים).
- בחר אזור של 1 מ 2 (10 X אובייקטיבי, נה 1.4).
- תצוגה מצומדת אלקסה 488 ° 2 פלורסצנטיות נוגדנים דרך 505 ננומטר מסנן לעבור זמן. להציג את קרינה פלואורסצנטית שנוצר על ידי עירור של אלקסה 594-מצומדת ° 2 נוגדנים דרך מסנן פס ארוך 595 nm. דיגיטייז תמונות עם מחשב PC עם תוכנת הדמיה תואם. כולל את בר בקנה מידה של הדמיה תוכנה לניתוח בשלב מאוחר יותר.
4. ניתוח של תמונות עם פיג'י
הערה: לפני שתמשיך עם ניתוח, פיג'י (זמין באופן חופשי של מכוני הבריאות הלאומיים, בת'סדה, מרילנד) חייב להיות מותקן באמצעות https://imagej.net/Fiji/Downloads. כמו כן, המאקרו המשמשים בתהליך הזה מסופק קובץ משלים. מקם את קובץ המאקרו במדריך נגיש.
- טען brightfield תמונה של המקטע הנבחר בפיג'י. נווט אל תוספים → פילוח → פילוח לומד מהר קודם ל-
- על מנת מתנים האזורים הסלולר של המקטע, למתוח קו על בד, ולחץ " להוסיף מחלקה 1 ". לאחר מכן, צייר קו על השטח בין סיבי, ולחץ " להוסיף לשיעור 2 " כדי לסמן על התחומים חוץ-תאית. חזור עד ישנם 5-10 תוויות בכל כיתה.
- לחץ על הרכבת המסווג. על וכתוצאה מכך אדום וירוק הכיסוי, להוסיף תוויות יותר באופן ידני (ראה שלב 4.2) לחתיכות באופן שגוי מקוטע של התמונה, במידת הצורך. חזור עד סיבים (אדום) מופרדים כראוי הרווח בין סיבים (ירוק)-
- לחץ על " ההסתברות לקבל " ולשמור את התמונה בתיקיה החדשה שכותרתו.
- חזור על הפעולות לעיל (שלבים 4.2-4.3) עם התמונה פלורסנט שנלקחו באותו השדה. תווית סיבי immunostained כמו " מחלקה 1 " ואת כל האיזורים הלא-פלורסנט כמו " מחלקה 2 ". לשמור את מפת הסתברות שנוצר באותה תיקיה שבה מאוחסן התמונה brightfield מעובד.
- פתח את אחת ממפות שנשמר קודם לכן ההסתברות בפיג'י. לצייר קו ישר על הבר סולם המסופקים על ידי תוכנת הדמיה. . לך לנתח → לקבוע קנה מידה. לשנות את הפרמטרים (קרי, מרחק ידוע, יחידת אורך) לערכים המתאימים שלהם כפי שהוצגה על ידי סרגל קנה מידה ולאחר מכן בדוק " Global " תיבת לתקנן את קנה המידה עבור כל תמונה.
- נווט אל תוספים → מאקרו → לרוץ → Tyagi et al. סיבים כמת macro.ijm (ראה קובץ משלים). . מיד, תופיע חלונית הניווט. פתחו את התמונה ' s מארח תיקיה; תיבת דו-שיח תופיע. עבור כל תיבת דו-שיח, לשנות " רקע " ערך רשימה נפתחת כדי " האור. "
הערה: התיקיה עכשיו יאוכלסו עם תמונות של קווי המתאר סיבים וקבצים תוכנת הגיליון האלקטרוני של התוצאות (קוטר CSA, Feret הם הכי יקר לכימות סיבים מורפולוגיה; פרמטרים נמדד ניתן להתאים במדידות לנתח הגדר). סיבים מורפולוגיה נתונים שנוצרו על-ידי הפונקציה נקבובית-אנליזה של פיג'י יועברו באופן אוטומטי לקבצים תוכנת הגיליון האלקטרוני עבור שתי תמונות שדה פלורסנט ובהיר. - לחשב את השבר של סיבי לבטא MyHC נתונה בשדה על-ידי חלוקת מספר סיבים פלורסנט בשטח על ידי מספר סיבים הכולל בתמונה בהירים השדה התואם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
השרירים Hindlimb (קרי, השוקתי הקדמי, הסוליה) גזור מן עכבר C57BL/6 זכרים בגיל לא ידוע היו פלאש קפוא ידי שוקע כייר פלסטיק המכיל את השריר ב אוקטובר במתחם איזופנטאן מקורר חנקן נוזלי. לאחר מכן, משתמש cryotome, 8-10 מיקרומטר מקטעים טורי היו ב-20 ° C גזורה הועבר שקופיות זכוכית שונים מפרוטונים שמטענם12.
בחרנו השוקתי הקדמי, הסוליה כי אלה השרירים מורכבים בעיקר סיבי fast - ו איטי עווית, בהתאמה13,14. בעקבות immunohistochemical מכתים עבור סוג בודדים, אני, IIA, IIX, IIB MyHCs, נלכדו brightfield ותמונות פלורסנט. הלוחות השמאלי של איור 1 הצג חלקים immunostained שריר הסוליה עם הסוג אני, IIA, נוגדנים IIX ו- IIB MyHC ספציפיים המפורטים בטבלה1.
איור 1 : נוגדן של MyHC מסוג I, IIA, IIX ו- IIB ב שריר הסוליה העכבר. לוחות שמאלה להראות תמונות פלורסנט המתקבל מקטעי שריר הסוליה העכבר שנבדק עם נוגדנים העיקרי למזהים ייחודיים מסוג I (BA-F8; A), הקלד IIA (SC-71; B), הקלד IIX (H 6 1; C) והקלד IIB (BF-F3; MyHCs D). נכון מראות הסעיפים שבו הושמט הנוגדן העיקרי בשימוש הניסוי המתואר בחלונית השמאלית המתאימים. ברים = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
באופן ספציפי, נצפו שברים משמעותיים של סיבי המבטאת סוג אני (איור 1א', משמאל) וסוג IIA MyHCs (איור 1B, משמאל) עם כמות נכבדה של הסיבים נותרת הצגת מכתים חיובי עבור סוג MyHCs IIX (איור 1C, משמאל). לעומת זאת, כמעט אין סיבים מסוג IIB היו ניכר (איור 1D, משמאל). תצפיות אלה עקביים עם דו חות קודמים כי שרירי הסוליה הם מורכבים בעיקר מסוג, מסוג IIA ו- IIX סיבים (פחות אז) עם כמעט אין סוג IIB סיבים5,10,12. חשוב לציין, לא מכתים נצפתה בסעיפים בו נוגדן ראשוני כבר השמיט מן הפרוטוקול, הוכחת יחודיות של הנוגדנים (איור 1י-ם, לוחות נכון).
איור 2 : נוגדן של MyHC להקליד IIB, IIX, IIA ואני העכבר השריר השוקתי הקדמי. לוחות שמאלה להראות תמונות פלורסנט המתקבל חלקים העכבר השריר השוקתי הקדמי שנבדק עם נוגדנים העיקרי ביים הקלד IIB (A), הקלד IIX (B), הקלד IIA (C), מסוג MyHCs (D). נכון מראות הסעיפים שבו הושמט הנוגדן העיקרי בשימוש הניסוי המתואר בחלונית השמאלית סמוכים. ברים = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
אנחנו גם מוכתם השרירים השוקתי הקדמי עם נוגדנים הנ. השרירים השוקתי הקדמי היו מורכבים בעיקר של סוג IIB וסוג IIX MyHC-חיוביות סיבים (איור 2א-ב, השאירה לוחות) עם תרומות קטנות יותר מסיבי המבטאת סוג IIA MyHCs (איור 2C, משמאל); כמעט אין סיבים המבטאת סוג אני MyHC נצפו (איור 2D, משמאל). הנתונים שלנו המציין כי העכבר השוקתי הקדמי מורכב ברובו מהיר עווית מסוג IIA, הקלד IIB ואת סוג IIX סיבים עקביים עם מחקרים קודמת5,10,13. שוב, לא מכתים נצפתה בסעיפים בו נוגדן ראשוני כבר השמיט פרוטוקול (איור 2י-ם, לוחות נכון).
איור 3 : פילוח סיבים ממוחשבות iterated. Brightfield תמונה של עכבר השוקתי הקדמי מקטע (A). טרנספורמציה של התמונה באמצעות אלגוריתם חצי אוטומטיות שלנו (B). תמונת פלורסנט של אותו סעיף מציג immunostaining מסוג IIA MyHC (C). שינוי תמונת מראה סוג היחידה להביע-IIA MyHC סיבים (D). ברים = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
למטרת ניתוח morphometric, התקבלו גם תמונות brightfield של השדות immunostained. בדוגמה המוצגת באיור 3A הוא קטע שריר הקדמי השוקתי שנבדק עם נוגדנים SC-71 ביים להקליד IIA MyHCs13. באמצעות אלגוריתם חצי אוטומטיות המקורי שלנו, מספר תמונות המרות שימשו כדי ליצור מפות ההסתברות מן התמונות brightfield. שינוי תמונה אופיינית נגזר של התמונה brightfield המוצג באיור 3א מוצג באיור 3ב'. באמצעות השינוי בפונקציה ניתוח נקבובית של פיג'י, מדדנו את מתכוון CSA 891.4 ± 45.0 מיקרומטר, (2) מקסימום (נמצא 46.9 ± 1.3 מיקרומטר), מינימלי (26.0 ± 0.8 מיקרומטר) אומר Feret קטרים של כל סיב בשטח. כדי לבדוק את אמינות המידות שלנו, אנחנו גם העריכו פרמטרים אלה בתמונה brightfield באופן ידני. מתכוון CSA (867.0 ± 52.0 מיקרומטר2) מקסימום (45.7 ± 3.5 מיקרומטר), מינימום (25.6 ± 1.9 מיקרומטר) מתכוון קטרים Feret שהושג באמצעות שיטת הרכישה ידני מייגע יותר היו לא שונה באופן משמעותי מן השיטה אוטומטית למחצה (כל p > אינטראקצית 0.05, t-בדיקות; טבלה 3).
= "/ files/ftp_upload/56024/56024table3.jpg ' / >
טבלה 3: מורפולוגיה סיבים והרכב של השוקה immunostained השריר הקדמי עבור סוג אני, IIA, IIB, MyHCs IIX כפי שנקבע על ידי השיטות האנליטיות ידני ואוטומטי למחצה. מתכוון סיבים CSA, קטרים Feret ואני MyHC סוג עכבר השוקתי הקדמי לכמת באמצעות הערכה ידנית מסורתית לעומת האלגוריתם שהוצגו. אנא שימו לב כי שברים משולבים עולה על הערך 1 בשל נוכחותם של סיבי לבטא יותר MyHC מסוג אחד.
איור 3 C מציגה תמונת פלורסנט של immunostained זהה השדה עם נוגדנים ביים להקליד IIA MyHCs. סיבי שהוכתמו חיובי בתחום היו שנבחרו על ידי מספר (איור 3ד') ואת כדי לקבוע את השבר של סיבים מסוג IIA MyHC-ביטוי על-ידי חילוק המספר הכולל של סיבי בשטח טרנספורמציה brightfield (טבלה 3 ). הממוצע CSA, מינימלי ומקסימלי Feret קטרים מסוג IIA סיבים היו אז העריכו (טבלה 3). חלקם של סוג אני, סוג IIX ו- type IIB סיבים, כמו גם מידות שלהם, נקבעו על ידי חזרה על פרוטוקול זה ב סעיפים טורי immunostained עם BA-F8, 6-אייץ ' 1 נוגדנים BF-F3, בהתאמה6,12(בטבלה 4 ; איור 4 A-D).
בטבלה 4: MyHC התוכן של מורפולוגיה הסוליה העכבר ו השוקתי הקדמי. קומפוזיציות סוג סיבים סעיפים נציג של הסוליה, השוקתי הקדמי. כימות של CSA הממוצע, קטרים Feret מינימלי, מקסימלי של סוג אני, הקלד IIA, הקלד IIX ומוצגים מסוג IIB הסוליה והן השוקתי הקדמי. הנתונים ניתנים כמו ±SEM אומר.
אנחנו גם העריכו את הפרמטרים הללו בשדה המתקבל את שריר הסוליה (בטבלה 4; איור 4 A-D). סיבים בודדים 3,052 ו 2,876 נספרו השוקתי הקדמי, שרירי הסוליה, בהתאמה. יחדיו, נתונים אלה מדגימים את הכדאיות של השיטה שלנו בניתוח מסוג סיבים ו- morphometric.
איור 4 : סיכום הנתונים ניתוח Morphometric. קומפוזיציות סיבים מסוג סעיפים נציג של השוקתי הקדמי ושל שרירי הסוליה (A). כימות של ממוצע CSA, minimimal, קטרים Feret מקסימלי של סוג אני, הקלד IIA, הקלד IIX, סוג fivers IIB השוקתי anteriort והן הסוליה מוצגות באיור (B-D). הנתונים ניתנים אומר ±SEM. הבדלים משמעותיים בין השוקתי הקדמי, הסוליה מסומנים (* מציין p < 0.05: * * מציין p < 0.01; * * * מציין p < 0.005; t-test). סיבים בודדים 3,052 ו 2,876 נספרו השוקתי הקדמי, שרירי הסוליה, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
קובץ משלים: סיבים כימות מאקרו. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
. הנה, סיפקנו כיוון שימושי לצורך זיהוי סוגי סיבי שריר השלד. בעשותו כן, נתאר באלגוריתם הרומן לניתוח הנתונים.
מאז התוצאות שלנו במידה רבה לאשר את אלה של דוחות קודמים5,8,10 , משקפים משלנו מדידות ידניות, האלגוריתם מופיע לדייק. ובכל זאת, נתקלנו כמה מלכודות ניסיוני נדירים כולל גבולות ברורים סיבים הנובע חלוקתה החפץ. ניתן למזער את ההשפעה של לכלוכים אלה באמצעות חלוקתה זהירה ובחינה על המשמר של המקטע מעובד לפני ניתוח. בפרט, סגמנטציה פחות מאשר-אופטימאליים אולי שיפרו דרך מספר סיבובים של סיווג מחדש על התמונה על מנת להשיג חדות.
הצעד המכריע ביותר פרוטוקול שלנו הוא שלב 4.2 שבו נקבע את הסלולר ואזורי חוץ-תאי של המקטע על ידי ציור קו על בד נתון, ובכך הבחנה "מחלקה 1" או "כיתה 2" באזור. ברור, הבחנה זו ידנית הוא קריטי מכיוון שהוא קובע את הגבולות של סיבי השריר; שגיאה בשלב זה ישפיע לרעה את ההערכה של הממדים סיבים.
במחקר זה, אנחנו ובחן מקטעים עבור אחד בלבד MyHC במקטע טורי נתון. עם זאת, קצת סיבים, כגון סיבים היברידית, מבטאים שני סוגי MyHC, מעידה על חופפים פרופילים מטבולית/תפקודית (לדוגמה, הקלד IIX ו- IIB). לפיכך, השברים של סיבים מסוג מסוכם לערך > 1 עבור הסוליה והן השוקתי הקדמי (איור 4א). סיבי היברידי יכול להיות מזוהה עם כפול או אפילו משולש-, labelling פרוטוקולים כגון אלו שתוארו על ידי Lee. ואח 7ו- Bloemberg ו- Quadrilatero5, בהתאמה. חשוב לציין, שלנו שיטת הניתוח ניתן ליישם פרוטוקולים אלה מכתימים מורכבים יותר. מגבלה נוספת של פרוטוקול שלנו היא כי זה לא אוטומטי לחלוטין; עם זאת, אנו מאמינים כי זיכיון משנית זו מבטיחה כי השיטה שלנו לא מתפשרים הקשיחות למען מהירות.
בעוד קומפוזיציות MyHC של שרירי הסוליה והן השוקתי הקדמי שנצפו במחקר זה לשקף את התוצאות הקודמות מחקרים5,6,7,10,14 , ישנם כמה ניגודים עם מחקרים מוקדמים יותר לגבי ההערכה של CSA. לדוגמה, שלנו מדידות של CSA הממוצע קטנים מעט יותר מאלה שדווחו על-ידי Bloemberg ועל Quadrilatero5 או אלן ואח. 15 בפרט, מדידות CSA שלנו נע בין 539.86 ± 24.44 מיקרומטר2 1319.50 ± 57.47 מיקרומטר2 על פני סוגי סיבים בזמן שלהם המורחב בערך 735.7 ± 31.2 מיקרומטר2 ל 3073.8 ± 51.3 מיקרומטר2. עם זאת, הערכים שלנו יותר דומים לאלה שנצפה על ידי אוגוסטו. et al. 13 ו לוקאס. et al. 6 מי דיווחה CSAs ממוצעת החל 436 מיקרומטר ± 6052 מיקרומטר ± 412.5 24042 , 815 ± 221 מיקרומטר2 ל- 1904 ± 570 מיקרומטר2, בהתאמה. לפיכך, יש השתנות בניתוח morphometric של סיבי hindlimb העכבר קיימת על פני הספרות.
אימונוהיסטוכימיה מציג דרך יעילה תווית ולסווג את סיבי השריר על בסיס התוכן MyHC שלהם. כימות מדויק של ניסויים immunohistochemical חיונית לביצוע מסקנות משמעותיות לגבי הנתונים; לשם כך, שיטה אשר ניתן להפוך לאוטומטי את החלקים מייגע של ניתוח הוא שימושי, במיוחד כאשר מאות או אפילו אלפי, סיבים, צריך להיות נמדד, מסווג. בנוסף מדידות דומות תצפיות ידנית, האלגוריתם שלנו מספק הערכה מדויקת של הנתונים הללו ללא דעה קדומה; זה יתרון על מדידות ידניות מבטיחה הקפדה מדעית. בהקשר זה, המתודולוגיה שלנו עשוי להיות שימושי אפיון השפעת מניפולציות גנטיות ניסיוני שמשפיעים על תקינות השריר. באופן ספציפי, MyHC אימונוהיסטוכימיה בשילוב עם שיטת העבודה שלנו שניתוח מהיר עשוי להיות מועסק כדי להעריך שינויים מורפולוגיים חילוף החומרים בשריר של המחלה מודלים כגון dystrophies שרירים, cachexia ALS וסרטן. יתר על כן, היעילות של התערבויות אשר למנוע ניוון או לגרום היפרטרופיה עשויים גם להידרש.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים יש אינטרסים סותרים לא לחשוף.
Acknowledgments
. אנחנו אסירי תודה קרן Boettcher, האגודה נוירודגנרטיביות (#17-II-344) על תמיכתם של מחקר זה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9418-100G | 5% in PBS |
| Hydrophobic Barrier Pap Pen | Scientific Device Laboratory | 9804-02 | |
| Microscope Slides | Globe Scientific | 1358W | |
| Coverglass | Fisher Scientific | 12-544-E | |
| Immumount | Thermo Scientific | 9990402 | |
| Nail Polish | L'Oreal | ||
| Nikon Eclipse TE-200 Inverted Fluorescence and Brightfield Microscope | Discontinued | ||
| SPOT RT/KE | SPOT Imaging Solutions | RT940 | |
| Dell Optiplex | |||
| BA-F8 Primary Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa | monoclonal mouse IgG2b; 1:50 | |
| SC-71 Primary Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa | monclonal mouse IgG1; 1:50 | |
| BF-F3 Primary Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa | monoclonal mouse IgGM; 1:50 | |
| 6H1 Primary Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa | monoclonal mouse IgGM; 1:50 | |
| Alexa Fluor 594 anti-IgG2b | Invitrogen | A21145 | goat anti-mouse; 1:200 |
| Alexa Fluor 488 anti-IgG1 | Invitrogen | A21121 | goat anti-mouse;1:200 |
| Alexa Fluor 594 anti-IgGM | Invitrogen | A21044 | goat anti-mouse;1:200 |
| OCT | Sakura Finetek | 4583 | |
| isopentane | Fisher Scientific | O3551-4 | cool with liguid nitrogen |
| PBS | Fisher Bioreagents | BP665-1 | 10x, dilute to 1x |
| Kim wipes | Kimberly-Clark | 06-666A |
References
- Engel, W. K. The essentiality of histo- and cytochemical studies of skeletal muscle in the investigation of neuromuscular disease. Neurol. 12, 778-784 (1962).
- Dobrowolny, G., et al. Skeletal muscle is a primary target of SOD1G93A-mediated toxicity. Cell Metab. 8, 425-436 (2008).
- Sultana, N., et al. Restricting calcium currents is required for correct fiber type specification in skeletal muscle. Development. 143 (9), 1547-1559 (2016).
- Guth, L., Samaha, F. J. Procedure for the histochemical demonstration of actomyosin ATPase. Exp Neurol. 28 (2), 365-367 (1970).
- Bloemberg, D., Quadrilatero, J. Rapid determination of myosin heavy chain expression in rat, mouse, and human skeletal muscle using multicolor immunofluorescence analysis. PLoS One. 7 (4), (2012).
- Lucas, C. A., Kang, L. H., Hoh, J. F. Monospecific antibodies against the three mammalian fast limb myosin heavy chains. Biochem Biophys Res Commun. 272 (1), 303-308 (2000).
- Lee, C. S., et al. Ca2+ permeation and/or binding to Cav1.1 fine-tunes skeletal muscle Ca2+ signaling to sustain muscle function. Skelet Muscle. 5 (4), (2015).
- Sawano, S., et al. A one-step immunostaining method to visualize rodent muscle fiber type within a single specimen. PLoS One. 11 (11), (2016).
- Meunier, B., Picard, B., Astruc, T., Labas, R. Development of image analysis tool for the classification of muscle fibre type using immunohistochemical staining. Histochem Cell Biol. 134 (3), 307-317 (2010).
- Kammoun, M., Casser-Malek, I., Meunier, B., Picard, B. A simplified immunohistochemical classification of skeletal muscle fibres in mouse. Eur J Histochem. 58 (2), 2254 (2014).
- Kumar, A., Accorsi, A., Rhee, Y., Girgenrath, M. Do's and don'ts in the preparation of muscle cryosections for histological analysis. J Vis Exp. (99), (2015).
- Schiaffino, S., et al. Three myosin heavy chain isoforms in type 2 skeletal muscle fibres. J Muscle Res Cell Motil. 10 (197), (1989).
- Augusto, V., Padovani, C. R., Campos, G. E. R. Skeletal muscle fiber types in C57Bl6j mice. Braz J Morphol Sci. 21 (2), 89-94 (2004).
- Schiaffino, S., Reggiani, C. Fiber types in mammalian skeletal muscles. Physiol Rev. 91 (4), 1447-1531 (2011).
- Allen, D. L., Harrison, B. C., Maass, A., Bell, M. L., Byrnes, W. C., Leinwand, L. A. Cardiac and skeletal muscle adaptations to voluntary wheel running in the mouse. J Appl Physiol. 90 (5), 1900-1908 (2001).
