Summary
骨格筋線維タイプの新式の識別子として浮上している免疫組織化学的染色ミオシン重鎖アイソ フォームの (すなわち、タイプ I、IIA を入力、IIX を入力、IIB を入力)。ここでは、繊維の種類や繊維の形態の迅速な評価を容易にする新しい半自動アルゴリズムとともに汚損のプロトコルを提案する.
Abstract
長年、骨格筋線維のタイプ間の区別されたミオシン ATPase 染色による視覚化に最適。最近では、ミオシン重鎖 (MyHC) 成分の免疫組織化学的染色繊維型の細かい識別子として浮上しています。タイプ I、IIA、IIX を入力を入力し、タイプ IIB 線維は、MyHC プロファイルに基づく精度で今識別できます。ただし、これらのデータの手動解析が遅いと右下をすることができます退屈。この点では、繊維の種類組成と形態の迅速で正確な評価は非常に望ましいツールです。ここでは、最新の免疫組織化学染色繊維の種類や繊維の形態の分析を加速する新たな半自動アルゴリズムとのコンサートでマウスの後肢筋から得られた凍結切片における MyHCs のためのプロトコルを提案する.ヒラメ筋が表示されます染色タイプ I およびタイプ IIA 線維、予想通り、ではなく、IIX またはタイプ IIB 線維。その一方で、前脛骨筋 IIX とタイプ IIB 線維、タイプ IIA 線維のごく一部の主にで構成されていた、またはほとんどないタイプ I 線維。いくつかのイメージの変換は、繊維形態を (すなわち、断面積 (CSA)、極大値と極小のフェレー径) のさまざまな側面を測定する目的について確率マップを生成する使用されました。これらのパラメーターが手動で得られた値と比較し、得られた値。CSA、最大または最小のフェレー径に関して解析のいずれかのモード間に有意差は認められなかった (すべてp > 0.05)、提案手法の精度を示します。したがって、私たちの免疫染色解析プロトコルは高齢化とミオパチーの多くのモデルで筋肉の組成に及ぼす影響の調査に適用できます。
Introduction
それは、骨格筋は多くのタイプ1の単繊維から成るいくつかの時間のために知られています。当初は、繊維の 2 つのグループがその収縮特性に基づく特徴付けられると名前は、適切に、遅筋 (タイプ I) と速筋 (タイプ II)。これらのカテゴリは、繊維の代謝に基づくさらに区別されていました。以来タイプ I 繊維はミトコンドリアで豊富であり、酸化的代謝に依存して、彼らを力強く肯定的なニコチン酸アミドアデニンジヌクレオチド ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドテトラゾリウム還元酵素 (NADH-TR) のジアホラーゼ2またはコハク酸脱水素酵素 (SDH) の3で解明しました。染色。対照的に、タイプ II 線維展示低い NADH TR ジアホラーゼの SDH 可変度染色と速筋の 2 つのサブグループに分けられた (タイプ IIA、IIB 型) の相対的な酸化能力に基づいてややぞんざい。繊維のこれらの違いは、ミオシン ATPase 染色によるより効果的に可視化されている型、pH 4.0 で前培養後繊維染色暗いとタイプ IIB 線維はタイプ IIA 線維で pH 10.0 に沈殿物次中古インキュベーションを吸収します。4を染色中間。
最近では、ミオシン重鎖 (MyHC) 成分の免疫組織化学的染色繊維タイプ5の細かい識別子として浮上しています。タイプ I、IIA 型し、タイプ IIB 線維がすべて識別する精度の MyHC プロファイルに基づきます。さらに、別の速筋代謝中間体繊維の種類は識別された6されている IIX を入力します。1 つ以上の MyHC を表現するハイブリッド繊維また確認された5,7,8をされています。猫やヒヒなどいくつかの種は、エクスプレス タイプ IIB MyHCs6にない知られています。MyHC 免疫染色は筋組成の最新の評価では現在、この手法で得られたデータの解析は面倒で時間のかかる自動支援なし。このため、半自動化された方法でこれらのデータを分析する一握りは先進5,9,10をされています。ここでは、半自動化された小説と一緒に筋線維タイプ5,7,8,10,の免疫組織化学的同定のため比較的標準的なプロトコルを提案します。アルゴリズムの精度で光ファイバー型および繊維の形態の分析を加速します。
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Protocol
マウスを含むすべてのプロシージャは、コロラド大学アンシュッツ医療キャンパス機関動物ケアおよび使用委員会によって承認された (91813(05)1D)
。1 です一日 1: プライマリ (1 °) ウシ血清アルブミン (BSA) ブロック染色
- マウスの後肢筋 (例えば、前脛骨筋、ヒラメ筋) の空気乾燥凍結切片の荷電のスライドに取付けた ~ 30 分。 11. 疎水性障壁 PAP のペンを使用してセクションに境界線を描画します 。
- 場所 ~ 5 %bsa/リン酸緩衝生理食塩水 (BSA/PBS) 非特異抗体の結合をブロックする各スライド上を 250 μ l 添加します。スライド 1 のため室温で孵化させなさい
- ブロック中準備 1:50 5% 培養上清 1 ° 抗体の希釈 BSA/PBS (すべてはマウス モノクローナル抗体; 表 1 6 , 12 を参照してください); の 250 μ L を準備スライドごとのソリューションです。氷に 1 ° 抗体株式および希薄を維持
テーブル 1: 一次抗体 MyHCs を区別するために使用します
- 5 %bsa/PBS ブロッキング液の吸引は、次の適切なスライドに 1 ° 抗体希釈の 250 μ L を追加。追加 250 μ L の 5 %bsa/PBS (2 °) 二次抗体だけネガティブ コントロールをスライドです 。 4 ° C、湿度の高い環境で 24-48 h で
- 加温します
。 注: 湿らせたろ紙をアルミ箔で覆われてペトリ皿は適切なインキュベーション室として役立つかもしれないです 。
2。日 2:2 ° 蛍光抗体染色
- 1 ° 抗体溶液を吸引または 5 %bsa/PBS 溶液を制御します。洗ってすべてスライド 3 回、10 分の 5 %bsa 。
- 洗濯中準備 5% の精製、fluorophore 共役 2 ° 抗体の希薄を 1: 200 BSA/PBS (表 2 を参照してくださいすべてがヤギ抗マウス)。スライドごとに解決策の 250 μ L を準備します。氷で暗闇の中 2 ° 蛍光標識抗体を保持
テーブル 2: 蛍光標識二次抗体を視覚化する一次抗体認識の MyHCs するために使用します
- 5 %bsa/PBS ブロック ソリューションの 3 番目のアプリケーションの吸引は、次のすべてのスライドに 2 ° 抗体希釈の 250 μ L を追加。暗く、湿気の多い環境で室温で 90 分間インキュベートします 。
- 吸引 2 ° 抗体溶液。洗ってすべてスライド 3 回 10 分 5% の BSA/PBS 。 PBS の
- リンス。10 分間乾燥
- マウント非常任理事、低粘度の水性取付中 coverglass 。
- 、乾燥時は、マニキュアとスライド エッジをシールします。乾燥し、暗い slidebox に格納します 。
3。落射蛍光顕微鏡でスライドをイメージング
- きれいに拭きます小、70% エタノールに浸したラボ - スライドです 。
- 写真装置 (材料の表 を参照) を搭載した落射蛍光顕微鏡を使って immunostained 筋セクションのデジタル画像を取得します。
- 約 1 mm 2 (10 × 対物、1.4 NA) の領域を選択します 。
- ビューを介して、505 アレクサ 488 共役 2 ° 抗体蛍光 nm ロングパス ・ フィルター。595 nm ロングパス ・ フィルターを介して Alexa 594 共役 2 ° 抗体の励起による蛍光を表示します。互換性のあるイメージング ソフトウェアを搭載した PC のコンピューターで画像をデジタル化します。イメージング ソフトウェアを後で分析からスケール バーが含まれます 。
4。フィジー画像の解析
注: 解析に進む、前にフィジー (健康の国民の協会、ベセスダ、MD から自由に利用可能) は、https://imagej.net/Fiji/Downloads 経由でインストールする必要があります。また、このプロセスで使用するマクロは、補足のファイル で提供されます。マクロ ファイルを簡単にアクセスできるディレクトリに配置します
。 フィジーで選択したセクションの- ロード、明視野イメージ。プラグインに移動 → 分割 → Trainable ウェカ ・ セグメンテーション 。 、光ファイバーの線を描画し、セクションの細胞領域を規定するために
- " クラス 1 に追加 "。繊維間空間に線を描画し、その後、" クラス 2 に追加 " 細胞外ドメインをマークします。各クラスで 5-10 ラベルがあるまでを繰り返します。
- クリック鉄道分類子。結果の赤と緑のオーバーレイで手動で複数のラベルを追加 (手順 4.2 参照)、必要な場合は、イメージの正しく分割部分に。繊維 (赤) は、繊維 (グリーン) 間のスペースから適切に分離されてまで繰り返します 。
- クリックして " 取得確率 " と新しくラベル付けされたフォルダーに画像を保存します 。
- は、同じフィールドから撮影した蛍光画像と (手順 4.2 4.3) の上記の手順を繰り返します。ラベルの immunostained 繊維として " クラス 1 " とすべての非蛍光性領域として " クラス 2 "。結果の確率マップを加工し、明視野イメージが格納されている同じフォルダーに保存します 。
- はフィジーで以前に保存した確率マップの 1 つを開きます。イメージング ソフトウェアによって提供されるスケール バーの直線を描画します。分析に行く → スケールを設定します。スケール バーで指定された適切な値 (すなわち、既知の距離、長さの単位) パラメーターを変更し、チェック、" グローバル " 各イメージの尺度を標準化します 。
- のプラグインに移動 → マクロ → を実行 → Tyagi ら 繊維定量 macro.ijm (補足ファイル を参照してください)。すぐに、ナビゲーション ウィンドウが表示されます。画像を開く ' s ホスト フォルダー;ダイアログ ボックスが表示されます。各ダイアログ ボックスの変更、" 背景 " ドロップ ダウン値 " 光 "
注: フォルダーが繊維アウトラインの画像と (CSA ・ フェレー径に最も関連する結果のスプレッドシート ソフトウェア ファイルが表示されます繊維形態の定量化測定されたパラメーターで調整できます設定測定の分析)。フィジーの細孔解析関数によって生成された繊維形態データをスプレッドシート ソフトウェア両方の蛍光および明るいフィールド画像のファイルに自動的に転送されます 。
- 蛍光繊維分野で対応する明視野イメージで総繊維数の数を割ることによってフィールドで指定された MyHC を表現する繊維の割合を計算します 。
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Representative Results
後肢筋 (すなわち、前脛骨筋、ヒラメ筋) 年齢不詳の男性 c57bl/6 マウスから解剖されたフラッシュ 10 月に筋肉を含むプラスチック金型の沈没によって固定されている液体窒素冷却イソペンタン化合物。8-10 μ m の切片が、cryotome を使用して、-20 ° C でカットし、異なる荷電ガラス スライド12に転送します。
これらの筋肉が高速と低速筋線維、それぞれ13,14主にで構成されるので、我々 は前脛骨筋とヒラメ筋を選んだ。次の免疫組織化学的染色個々 のタイプ I、IIA、IIX および IIB MyHCs、明視野と蛍光イメージは捕獲されました。図 1の左のパネル表示型とヒラメ筋の immunostained のセクション I、IIA、IIX と IIB MyHC 固有の抗体は、表 1に示します。
図 1: MyHC の免疫組織化学的染色タイプ I、IIA、IIX、マウスの筋に IIB 。左パネルの表示 (BA F8; I 型一次抗体をプローブ マウス ラットヒラメ筋のセクションから得られた蛍光画像A)、タイプ IIA (SC-71;B) 入力 IIX (6 H 1;C) IIB (BF F3; を入力D) MyHCs。右側のパネルでは、対応する左側のパネルに描かれている実験で使用される一次抗体が省略されたセクションを表示します。バー = 100 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
具体的には、見ました繊維の種類を表現することの実質的な分数 (図 1A、左)、タイプ IIA MyHCs (図 1B、左) 型の陽性を表示する残りの繊維の公正な量IIX の MyHCs (図 1C、左)。対照的に、事実上 IIB 線維はありませんでした明らか (図 1D、左)。これらの観察はヒラメ筋は以前の報告書と一致している型から大抵成り、IIA を入力し、IIX 繊維のほとんどないタイプ IIB 線維5,10,12型 (ほど)。重要なは、染色が認められなかった、一次抗体のプロトコル、抗体 (図 1A ~ D、右パネル) の特異性を示すから省略されていたセクションで。
図 2: MyHC の免疫組織化学的染色タイプ IIB、IIX、iia 期と私マウス前脛骨筋で。左パネルを表示、マウスの前脛骨筋の IIB (A) を入力、IIX (B) を入力、タイプ IIA (C) および (D) MyHCs 型に一次抗体をプローブのセクションから得られた蛍光画像。右側のパネルは、隣接する左側のパネルに描かれている実験で使用される一次抗体が省略されたセクションを表示します。バー = 100 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
我々 はまた前述の抗体と前脛骨筋前脛骨筋を染色しました。前脛骨筋前脛骨筋はタイプ IIA MyHCs (図 2C、左) を表現する繊維からより小さい貢献とタイプ IIB と種類 IIX MyHC 陽性の線維 (図 2A B、左パネル) の主構成されました。事実上ないの線維は型を表現する私 MyHC は (図 2D、左) を認めた。我々 のデータはマウス脛骨は主に速筋線維タイプ IIA、IIB 型、型 IIX 繊維が以前研究5,10,13と一致していることを示します。もう一度、染色が認められなかった、一次抗体のプロトコル (図 2A ~ D、右パネル) から省略されていたセクションで。
図 3: 反復のコンピューター化された繊維セグメンテーション。マウス脛骨前方セクション (A) の明視野イメージ。(B) 半自動アルゴリズムを使用して同じイメージに変換します。タイプ IIA MyHC (C) の染色を示す同じセクションの蛍光イメージ。変換イメージだけタイプ IIA MyHC 表現する繊維 (D) を示しています。バー = 100 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
形態計測学的解析を目的として immunostained フィールドの明視野画像も得られました。図 3Aに示す例は、IIA MyHCs13を入力する SC 71 抗体を用いて探る前脛骨筋セクションからです。元半自動化されたアルゴリズムを使用して、いくつかのイメージの変換は、明視野画像から確率マップを生成に使用されました。図 3Aに示すように明視野イメージから派生した典型的な画像変換は図 3Bに提示されます。変換とフィジーの細孔解析関数を使用して、最大値 (46.9 ± 1.3 μ m) とフィールドにおける個々 の繊維の最小 (26.0 ± 0.8 μ m) 平均フェレー径平均 CSA (891.4 ± 45.0 μ m2) を測定した.我々 の測定の再現性をテストするには、我々 はまた手動で明視野イメージでこれらのパラメーターを評価しました。平均 CSA (867.0 ± 52.0 μ2)、最大 (45.7 ± 3.5 μ m) と最小 (25.6 ± 1.9 μ m) 意味フェレー径より面倒な手動取得メソッドを使用して取得は半自動方式と大きく異なるでした (すべてのp >0.05、対になっていないt-テスト;表 3)。
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テーブル 3: タイプの前脛骨筋の immunostained の繊維形態と組成 I、IIA、IIB および IIX MyHCs 手動・半自動分析法によって決定される。繊維 CSA、フェレー径と提案手法と従来のマニュアル評価による定量化マウス脛骨の MyHC 型を意味します。合計分数が 1 つ以上の MyHC 型を表現する線維の存在のために 1 の値を超えることに注意してください。
図 3Cは、IIA MyHCs を入力する抗体と同じフィールド immunostained の蛍光イメージを示しています。フィールドで積極的に染色繊維番号 (図 3D) とした明視野変換フィールド (テーブル 3 の繊維の合計数で除して IIA MyHC 表現型繊維の割合を決定するには).当時はタイプ IIA 線維のフェレー径平均 CSA、最大値と最小評価 (表 3)。割合私 IIX とタイプ IIB 線維と同様、その寸法を入力し、このプロトコルを連続切片 immunostained BA f8 キー、6 H 1 BF F3 抗体とそれぞれ6,12(表 4 を繰り返すことによって決定されました。;図 4A ~ D)。
表 4: MyHC コンテンツとマウスのヒラメ筋と前脛骨筋の形態。ヒラメ筋と前脛骨筋の代表的なセクションの繊維の種類組成。平均 CSA の定量化の最小と最大のフェレー径は IIX を入力タイプ I、IIA を入力し、タイプ IIB のヒラメ筋と前脛骨筋の両方が表示されます。データは、平均 ±SEM で指定されます。
ヒラメ筋 (表 4から得られるフィールドでこれらのパラメーターを検討しました。図 4A ~ D)。3,052 と 2,876 個々 の繊維は前脛骨筋とヒラメ筋のそれぞれ数えられました。一緒に取られて、これらのデータは、ファイバー型と形態計測学的解析における提案方式の実現可能性を実証します。
図 4: 形態計測学的解析データ概要。前脛骨筋とヒラメ筋 (A) 代表的なセクションのファイバー型組成。平均 CSA の定量化、minimimal、最大フェレー径タイプ I、IIA、入力 IIX と anteriort 前脛骨筋とヒラメ筋タイプ IIB 繊維 (B D) で表示されます。±SEM。 脛骨間に有意差を意味データを与えられ、ヒラメが示されます (* pを示します < 0.05: * * pを示します < 0.01; * * * pを示します < 0.005; t 検定)。3,052 と 2,876 個々 の繊維は前脛骨筋とヒラメ筋のそれぞれ数えられました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
補足ファイル: 繊維定量マクロ。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。
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Discussion
ここでは、骨格筋線維の種類を識別するための有用な方向を提供しております。そうすることで、データの解析のための新たなアルゴリズムについて述べる.
我々 の結果は主前レポート5,8,10のものを確認して、私たち自身の手動測定を反映、アルゴリズムが正確に表示されます。まだ、アーティファクトを断面から生じる不透明繊維境界線を含むいくつかのまれな実験的落とし穴が発生しました。注意区分および分析の前に処理されたセクションの警戒の検討を通じてこれらの人工物の影響を最小化できます。特に、シャープなコントラストを達成するために同じ画像を再分類の複数回のラウンドをより少なくより最適な画像分割を回避する可能性があります。
我々 のプロトコルの最も重要なステップは 4.2 に定めるセクションの細胞および細胞外領域で特定の光ファイバー線を描画することによって「クラス 1」または「クラス 2」の領域をそれにより区別するステップです。明らかに、この手動の区別は重要な筋線維の境界を決定するのでこの手順ではエラーが悪影響をファイバーの寸法の評価。
本研究では、与えられたシリアル セクションに 1 つだけの MyHC のためのセクションがプローブされます。ところが、ハイブリッド繊維など、いくつかの線維は、MyHC、代謝・機能プロファイル (例えばIIX を入力し、入力 IIB) の重複を示すものの 2 種類を表現します。したがって、光ファイバー型値に合計の端数 > ヒラメ筋と脛骨 (図 4A) の両方のための 1。ハイブリッド繊維をダブル、またはもトリプル、李らによって説明されたものなどのプロトコルのラベルで識別できます。7Bloemberg と Quadrilatero5、それぞれ。重要なは、分析の手法は、これらのより複雑なプロトコルを汚すに適用できます。プロトコルの別の制限が完全に自動; です。しかし、このマイナーな譲歩により提案手法が速度のために厳しさを損なわないようになると考えています。
本研究では, ヒラメ筋や前脛骨筋前脛骨筋の MyHC 組成が以前研究5,6,7,10,14の結果を反映しながら、CSA の評価に関する先行研究といくつかのコントラストがあります。たとえば、平均 CSA の測定値は Bloemberg と Quadrilatero5 ・ アレンらによって報告されたものよりもやや小さい。15特に、我々 の CSA の測定 〜 539.86 ± 24.44 μ m2 1319.50 ± 57.47 μ m2繊維のタイプの間で彼らはスパン約 735.7 ± 31.2 μ m2 3073.8 ± 51.3 μ m2にしながら。しかし、私たちの価値観よりとよく似てアウグストらによって観測されました。13ルーカスら6平均 Csa 436 ± 605 μ m2 2404 ± 412.5 μ m2と 815 ± 221 μ m2 ~ 1904年 ± 570 μ m2に至るまでそれぞれを報告しました。したがって、マウスの後肢の繊維の形態計測学的解析のいくつかの変動は、文献の間で存在します。
免疫組織化学では、ラベルし、筋線維の MyHC コンテンツに基づいて分類する効率的な方法を示します。免疫組織化学的実験の正確な定量化データについて有意義な結論を作るには欠かせませんこのため、分析の退屈な部分を自動化するためメソッドは、数百、または数千も、繊維の測定し、分類する必要があるときに特にに役に立つものです。測定手動観測のように加え、我々 のアルゴリズムはバイアスなしこれらのデータの正確な評価を提供します。手動測定この優位は、科学的な厳密さを保証します。この点で、我々 の方法論は筋の整合性に影響を与える遺伝学的および実験的操作の効果の評価に有用かもしれない。具体的には、迅速分析の手法と相まって MyHC 免疫組織化学は筋ジストロフィーなどの疾患モデルにおける筋形態および代謝の変化を評価するために用いることができる ALS は、がん悪液質。また、萎縮を防ぐためや肥大を引き起こす介入の効果も評価可能性があります。
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Disclosures
著者は開示する利害の対立があります。
Acknowledgments
この研究の彼らのサポートのベッチャー財団と筋萎縮性側索硬化症協会 (#17-II-344) に感謝しております。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9418-100G | 5% in PBS |
| Hydrophobic Barrier Pap Pen | Scientific Device Laboratory | 9804-02 | |
| Microscope Slides | Globe Scientific | 1358W | |
| Coverglass | Fisher Scientific | 12-544-E | |
| Immumount | Thermo Scientific | 9990402 | |
| Nail Polish | L'Oreal | ||
| Nikon Eclipse TE-200 Inverted Fluorescence and Brightfield Microscope | Discontinued | ||
| SPOT RT/KE | SPOT Imaging Solutions | RT940 | |
| Dell Optiplex | |||
| BA-F8 Primary Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa | monoclonal mouse IgG2b; 1:50 | |
| SC-71 Primary Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa | monclonal mouse IgG1; 1:50 | |
| BF-F3 Primary Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa | monoclonal mouse IgGM; 1:50 | |
| 6H1 Primary Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa | monoclonal mouse IgGM; 1:50 | |
| Alexa Fluor 594 anti-IgG2b | Invitrogen | A21145 | goat anti-mouse; 1:200 |
| Alexa Fluor 488 anti-IgG1 | Invitrogen | A21121 | goat anti-mouse;1:200 |
| Alexa Fluor 594 anti-IgGM | Invitrogen | A21044 | goat anti-mouse;1:200 |
| OCT | Sakura Finetek | 4583 | |
| isopentane | Fisher Scientific | O3551-4 | cool with liguid nitrogen |
| PBS | Fisher Bioreagents | BP665-1 | 10x, dilute to 1x |
| Kim wipes | Kimberly-Clark | 06-666A |
References
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