Summary
مروج تعبير تحاليل ضرورية لتحسين فهم تنظيم الجينات والتعبير الزمانية المكانية للجينات المستهدفة. وهنا نقدم بروتوكول لتحديد وعزل واستنساخ مروج نبات. علاوة على ذلك، يصف لنا وصف المروج العقيدات على حدة في جذور شعر الحبة المشتركة.
Abstract
تسلسل المراحل الأولى من الجينات ترميز تسلسلات توصف بأنها متواليات المروج. دراسة أنماط التعبير من المروجين هامة جداً في فهم تنظيم الجينات وأنماط التعبير الزمانية المكانية للجينات المستهدفة. من ناحية أخرى، من المهم أيضا إنشاء مروج تقييم أدوات وتقنيات تحويل الوراثية التي سريعة وفعالة، واستنساخه. في هذه الدراسة، ونحن التحقيق في نمط التعبير الزمانية المكانية مروج إنشائها (نين) رهيزوبيال الخاصة بالتكافل العقيدات فاصولياء الشائع في جذور شعر المحورة وراثيا. استخدام قواعد بيانات الجينوم المصنع وأدوات التحليل التي حددناها، معزولة، واستنساخ المروج الشائع P. نين في انصهار النسخي لمراسل تشيميريك β-glucuronidase (غوس) غوس-enhanced::GFP. علاوة على ذلك، يصف هذا البروتوكول نظام التحول الوراثي في P. الشائع استخدام جذور شعر rhizogenes المتبعة التي يسببها السريع وتنوعاً. هذا النظام يولد جذور شعر سم إيه تو في 10 إلى 12 يوما بعد التحول. بعد ذلك، قمنا بتقييم التعبير الزمانية المكانية للمروج نين في جذور شعر طعمت على فترات دورية للتطعيم بعد. وتبين النتائج لدينا يصور بنشاط غوس أن المروج نين نشطة أثناء عملية نودوليشن. معا، على هذا البروتوكول يوضح كيفية تحديد وعزل واستنساخ وتميز مروج نبات في جذور شعر الحبة المشتركة. علاوة على ذلك، من السهل استخدام هذا البروتوكول في المختبرات غير المتخصصة.
Introduction
مروجي هي أدوات هامة البيولوجية الجزيئية التي تلعب دوراً حاسما في فهم تنظيم الجينات للفائدة. المروجين تسلسل الحمض النووي الموجود في أعلى النهر من الترجمة تسلسل بدء كودون من الجينات وأنها تحمل المعلومات التنظيمية المركزية للجينات؛ ولذلك، وصف وشرح الصحيح أمر حيوي لفهم وظيفة الجينات. اعتماداً على أنماط التعبير، تصنف المروجين المصنع التأسيسي، والأنسجة على حدة، أو الخاصة بالتنمية-المرحلة وإيندوسيبلي1. أوجه التقدم في تكنولوجيات ترانسكريبتوميك وإدخال تحسينات على النمذجة الكمبيوتر وتوفر إعداد متزايدة من تسلسل الجينوم للأنواع النباتية المختلفة قد يسرت التنبؤ على نطاق واسع بتسلسل المروج2.
من ناحية أخرى، من المهم أيضا إنشاء مروج تقييم أدوات وتقنيات تحويل الوراثية التي سريعة وفعالة، واستنساخه. خلافا لغيرها من النباتات النموذجية، تعوق توصيف الوظيفية الشائعة الفول البقول (P. الشائع) الجينات أساسا نظراً لطبيعة المعاندة sp. فاصولياء للتحول الوراثي مستقرة. نظم التحويل عابر كبديل للجينات السريع دراسات التوصيف الوظيفي3. في البقول التكافل بين البحث والتفاعل بين النبات المضيف البقوليات وبكتيريا رهيزوبيال أحد أنظمة نموذجية جانب آخر للتحليل الوظيفي الجينات الخاصة بالعقيدات ودراسات المروج. تتميز حتى الآن، كانت المروجين البقول عدة تتصل بهذه متنافسة، أي، PT4 فصة برميلية 4، SWEET115، العملاق japonicus لوتس ، أوبق6،7من VAG1، PT5 ماكس جليكاين 8Exo70J9ربوهب الشائع ص 10،،من1112، TRE113، PI3K14، تور15،، إلخ. رابطة الدول المستقلة عناصر تنظيم الجينات تؤثر بصورة مباشرة. عامل النسخ ENBP1A بربط منطقة كومنولث الدول المستقلة تنظيمية (−692 bp) من أوائل نودولين فودافونENOD12، وهذا يسهل التعبير عن الجين المراسل في العقيدات primordia فول بيقية16. الاستعاضة عن المناطق التنظيمية المستقلة (−161 إلى −48 bp) من المروج الخاصة بالعقيدات ليغيموجلوبين GLB3 مع مغايرة اقتطاع المروجين δ-p35S و δ-بنوس وأدت إلى فقدان خصوصية العقيدات وانخفاض نشاط المروج17 .
وتظهر التقارير السابقة أن عامل النسخ نين مطلوب لبدء الإصابة رهيزوبيال في خلايا جذور الشعر وضروري أيضا للعقيدات organogenesis في japonicus ل18. في الدراسة الحالية، ويصف لنا بروتوكول تحديد هوية والعزلة، والاستنساخ، وتوصيف المروج العقيدات على حدة في جذور شعر الحبة المشتركة. لتحقيق هذا الهدف، علينا تحديد rhizobial مروج نين خاصة بتكافل من الشائع P. والمستنسخة في انصهار النسخي لمراسل تشيميريك غوس-enhanced::GFP. علاوة على ذلك، يصف هذا البروتوكول نظام التحول الوراثي في P. الشائع استخدام جذور شعر رهيزوجينيس أ التي يسببها السريع وتنوعاً. هذا النظام يولد جذور شعر في أقل من أسبوعين بعد التحول. وأخيراً، قمنا بتقييم التعبير الزمانية المكانية للمروج نين في العقيدات الجذرية رهيزوبيا المستعمر تلطيخ غوس.
قد يكون من المفيد ليس فقط لدراسة نودولاتيون وميكورهيزاتيون11 من نباتات البقول، ولكن أيضا لدراسة أنماط التعبير المروج في جذور19الإجراء الموضح هنا. علاوة على ذلك، من السهل استخدام هذا البروتوكول في المختبرات غير المتخصصة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-تحديد والعزلة، والاستنساخ من الشائع ص نين المروج
- تحديد تسلسل المروج للجينات للفائدة. هناك عدة قواعد بيانات الجينوم وأدوات التحليل المتاحة للنباتات مثل فيتوزومي، ونباتات انسيمبل، نكبي، إلخ بالبقول المروج الشائع ص نين (بفنين؛ واستخدمت في هذه الدراسة20Phvul.009G115800).
- يستخدم التصميم أوليجوس للعبارة أو التقليدية تقييد إنزيم الاستنساخ بالاعتماد على نظام مكافحة ناقلات (الشكل 1A).
ملاحظة: معيار (25-35 شركة بريتيش بتروليوم)، كبسولة تفجير ديسالتيد العمل غرامة. ينصح متواليات اليغو عكس ذلك الجناح بين المروج والجينات. - تضخيم المنطقة مروج بفنين (أو منطقة المروج من الجينات للفائدة) من طازجة معزولة الشائع P. الحمض النووي باستخدام مجموعة اليغو الخاصة بالمروج. استخدام بوليميريز عالية الدقة مع بكر الشروط التالية: 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق؛ دورات 30 (95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 55 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 72 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة)؛ و 72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
- تشغيل الجزء تضخيم على 1% [اغروس] هلام في 60 الخامس في علبة جل 7 × 10 سم، والوتي amplicon المقابلة (700 شركة بريتيش بتروليوم، الشكل 1B) واستنساخ داخل المتجهة بينتر/د-توبو وفقا لإرشادات الشركة المصنعة.
- تحويل 2 ميليلتر من رد الفعل إلى المختصة الإشريكيّة القولونية الخلايا باستخدام تعليمات الشركة المصنعة ولوحة 150 ميليلتر لتحويل المزيج على ليسوجيني الأخ (رطل) وتستكمل مع كاناميسين 50 مغ/لتر (Kan50). تنمو الخلايا مطلي في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
- بيك 3-6 المستعمرات والثقافة لهم بين عشية وضحاها في رطل المتوسطة التي تحتوي على Kan50. عزل بلازميد الحمض النووي باستخدام طريقة اختيار وتحليل بلازميد بالاسترداد باستخدام أوليجوس M13 محددة في مكافحة ناقلات. لبكر، استخدام 100 نانوغرام من بلازميد، 12:03 م أوليجوس، X 10 العازلة PCR 0.5 بوليميراز "الدنا بوليميراز يو" ودنتبس 10 ملم.
- استخدام PCR التضخيم الشروط التالية؛ 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق؛ دورات 30 (95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 58 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 72 درجة مئوية ل 75 s)؛ وتصور 72 درجة مئوية للحد الأدنى 7 منتجات بكر على 1% [اغروس] هلام. ضمان الإدراج الصحيح عصابة في 1,024 بي بي وناقلات دون إرادة إدراج لها عصابة bp 324 (الشكل 1).
- القيام برد فعل LR بين دخول ناقلات (بينتر/د-توبو-بفنين) ووجهة متجه pBGWFS7.021 باستخدام مزيج إنزيم تجارية وفقا لإرشادات الشركة المصنعة.
- تحويل 2 ميليلتر من رد فعل LR إلى المختصة كولاي الخلايا باستخدام التقنيات القياسية كما هو موضح في تعليمات الشركة المصنعة ولوحة 150 ميليلتر من خليط التحول على رطل وتستكمل مع 100 مغ/لتر السبيكتينوميسين (Spe100). تنمو الخلايا مطلي في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
- اختيار حوالي 5 مستعمرات والثقافة لهم بين عشية وضحاها في رطل المتوسطة التي تحتوي على Spe100. عزل بلازميد الحمض النووي باستخدام أسلوب لاختيار وتحليل بلازميد بالاسترداد باستخدام أوليجوس الخاصة بالمروج.
- استخدام شروط PCR في الخطوة 1، 3. تصور منتجات بكر على 1% [اغروس] هلام لتأكيد التضخيم. أمبليكونس هي 700 شركة بريتيش بتروليوم.
- التسلسل في بلازميد الإيجابية pBGWFS7.0/PvNIN::GUS-التجارة والنقل (الشكل 1) مع أوليجوس الخاصة بالمروج التحقق من صحة الإدراج.
- تحويل والبلازميدات rhizogenes ألف سلالة K599 (ومع ذلك، أي سلالات أخرى من رهيزوجينيس (أ) يمكن استخدامها). إضافة 2 ميليلتر من الإعدادية بلازميد إلى 50 ميليلتر من الخلايا اليكتروكومبيتينت واليكتروبوراتي في ومبومو 1 مم مع الإعدادات التالية: 1.8 كيلو فولت و 25 µF و 200 Ω.
- استعادة الخلايا في ~ 500 ميليلتر من شركة نفط الجنوب متوسطة ويهز في 28 درجة مئوية حاء 2 لوحة على Spe100 رطل وتنمو في 28 درجة مئوية لمدة يومين.
- إجراء الفحص مستعمرة كما هو مذكور في الخطوة 1، 7 واستخدام شروط بكر كما في الخطوة 1، 3. جعل الأرصدة والغليسيرول من استنساخ الإيجابية وتخزينها في-80 درجة مئوية.
- استخدام الثقافة rhizogenes) أ ( إيواء متجه pBGWFS7.0 الفارغة كعنصر سلبي.
2- رهيزوجينيس أ تحول شعر جذور الفاصوليا الشائعة
- تعقيم بذور الفول (عامالشائع P. جامبا نيغرو) (حوالي 20) في 50 مل إيثانول 96% لمدة 1 دقيقة وتجاهل الإيثانول؛ قم بإضافة 50 مل من 20% التبييض (هيبوكلوريت الصوديوم) لمدة 10 دقيقة، مع خلط مستمر في غطاء الاندفاق الصفحي. إزالة المبيض وتغسل في الماء المعقم الزائدة 3 مرات.
ملاحظة: يمكن استخدام الأصناف الأخرى الشائع P. لتحريض الجذر شعر. - تنبت بذور معقمة في ورقات تصفية معقم مبلل مع بروتون & Dilworth (ب & د) الحل22 (الجدول 1) لمدة يومين في الظلام في 28 درجة مئوية.
- قبل التحول اليوم إعداد الوثائق التالية:
- متتالية من 150 ميليلتر الثقافة rhizogenes) أ ( إيواء متجه ثنائي (أعد الخطوات 1.13 و 1.14) في صلب رطل Spe100 وينمو بمعدل 28 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
- ملء أنبوب 15 مل ب & د حل واستبدال سداده ملولبة مع رقائق الألومنيوم الطبقات المزدوجة. تجميع هذا في أنبوب زجاج 22 سم تحتوي على 10 مل ب & د حل (الشكل 2) والاوتوكلاف عليه.
- في يوم التحول، تجميع المواد التالية العقيمة في غطاء الاندفاق الصفحي: نامي البذور من الخطوة 2، 2، لوحة الثقافة من الخطوة 2.3.1 وتعقيم الماء المقطر مزدوجة (10 مل)، الماصات وأنابيب من الخطوة 2.3.2 نصائح ماصة، الملقط العقيمة، والمحاقن مل 3.
- استخدام تلميح 200 ميليلتر بنت كشط الخلايا رهيزوجينيس ألف من اللوحة في أنبوب ميكروسينتريفوجي وريسوسبيند في 1 مل الماء المعقم مزدوجة. وبالمثل، تعد ناقل التحكم الخلايا بشكل منفصل.
- مزيج من الخلايا بلطف إلى ريسوسبيند. عدم دوامة.
- جعل حفرة 3 مم على رقائق الألومنيوم الأنابيب من الخطوة 2.3.2 استخدام تلميح ماصة معقمة.
- جمع الخلايا (مراقبة المروج أو ناقل) من الخطوة 2، 5 مع المحاقن ووخز قليلاً هيبوكوتيلس إنبات البذور بطرف الإبرة (الشكل 2).
ملاحظة: تأكد من أن تخترق الإبرة (4-6 مرات) الأنسجة الوعائية وحقن صغيرة (~ 5 ميليلتر) قطرات من الخلايا على الجرح في مواقع مختلفة حول هيبوكوتيل. - إدراج جذور الشتلات حقن بعناية في حفرة 3 مم 15 مل الأنبوب الذي يحتوي على ب & د حل. إرجاع الإعداد الكامل إلى مل 22 أنابيب زجاجية وختم لهم بالاحتفاظ بالرطوبة.
- احتضان هذه الأنابيب في غرفة نمو الحفاظ على 28 درجة مئوية مع الضوء ح 16:8 ح كبيرة مظلمة.
ملاحظات: 3-4 أيام بعد الحضانة، النباتات تنمو على حافة أنابيب زجاجية مل 22.
ملاحظة: من المهم أن تحتفظ ب & د حل باستمرار في الأنابيب البلاستيكية والزجاج.
3-مروج التحليل: نين مروج التعبير في العقيدات Rhizobial من الفاصوليا الشائعة
- لتحريض العقيدات الجذرية، تطعيم الريزوبيوم تروبيسي أو اللحم (المتوافقة للحبة المشتركة) في 100 مل متوسطة PY (ببتون ز 0.5، 0.3 غ خميرة مقتطف) تستكمل مع 700 مم كاكل2 و 20 ملغ مل1 حمض الناليديكسيك. احتضان عند 30 درجة مئوية ل 24 ساعة مع الهز 300 لفة في الدقيقة.
ملاحظة: يمكن استخدام أي مضادات حيوية محددة في حالة المحورة وراثيا . - بيليه الخلايا في أجهزة الطرد مركزي لمدة 3 دقيقة في 2,800 س ز في درجة حرارة الغرفة وريسوسبيند في 10 مل من 10 مم MgSO4. ضبط القطر الخارجي للخلايا إلى 0.6 OD600 بتمييع مع 10 مم MgSO4.
- 1-2 مل ثقافة (أعد من الخطوة 3.2) كل مصنع (مراقبة المروج وناقلات) للحث على نمو العقيدات على جذور شعر تطعيم. ري النباتات مع ب & د حل مع النيتروجين محدودة (2 مم كنو3) لتعزيز نودوليشن.
- اعتماداً على الحاجة التجريبية، جمع جذور شعر في نقاط زمنية مختلفة. جمع عينات لدراسة المواضيع الإصابة بين 3-5 أيام بعد تلقيح (نقطة في البوصة).
ملاحظة: العقيدات البدائية والعقيدات الشباب يمكن دراستها في 6-9 إدارة شؤون الإعلام وإدارة شؤون الإعلام أيام 10-12، على التوالي. وأخيراً، يمكن دراسة العقيدات ناضجة والفنية 14-21 نقطة في البوصة، والعقيدات سينيسسيد في > 28 نقطة في البوصة. - عملية الجذر/العقيدات لنشاط الجينات مراسل (جوس أو بروتينات فلورية خضراء). تحليل النشاط غوس وفقا للبروتوكول، المذكورة جيفرسون23. مراقبة التجارة والنقل تحت مجهر الأسفار. تثير fluorescence بروتينات فلورية خضراء مع ليزر أيون أرجون أزرق (488 نانومتر)، وجمع الأسفار المنبعثة من 510 إلى 540 نانومتر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
والهدف من هذه الدراسة تقييم نمط التعبير الزمانية المكانية للعقيدات على حدة نين P. الشائع . للقيام بذلك، اختير 700 شركة بريتيش بتروليوم منطقة المنبع كودون الشروع في ترجمة الجين نين وصممت مجموعة من أوليجوس كما هو مبين في الشكل 1 ألف. استخدام بوليميريز عالية الدقة، يفتت المروج نين تم تضخيمها ومعزولة (الشكل 1B) والمستنسخة في pBGWFS7.0 ناقل ثنائي الوجهة (الشكل 1) من خلال نهج بوابة لتوليد انصهار النسخي مراسل تشيميريك غوس--تعزيز التجارة والنقل (pBGWFS7.0/PvNIN::GUS-التجارة والنقل). عادة ما يولد بناء ناقلات pBGWFS7.0/PvNIN::GUS-التجارة والنقل المئات من الحيوانات المستنسخة مستقل. ويحدد الفحص مستعمرة ببكر مع أوليجوس الخاصة بالجينات بسهولة المستنسخين الصحيح (الشكل 2D). وكان بلازميد إيجابية PCR سانغر التسلسل مع أوليجوس الخاصة بالمروج التحقق من صحة الإدراج.
الحفاظ على رطوبة عالية في جميع أنحاء التجربة ضروري لتحريض دشبذ وجذور شعر. في موقع إصابة، كالي عادة ما يلاحظ في 5 إلى 7 أيام (2J الشكل) و ≥ 2 سم شعر جذور لوحظت في 10 إلى 12 يوما بعد التحول. أغلبية رهيزوجينيس أ- تحول النباتات بنجاح لإنتاج جذور شعر قبل أسبوعين (الشكل 2 ك). ومع ذلك، عدد وطول جذور شعر يمكن أن يكون متغير. لذا، تحديد جذور معظم نشاط متزايد لتحليل وتجارب أخرى. المكوس الجذر الابتدائي بقطع الساق سم 2 أدناه جذور شعر وزرع لهم في الأواني التي تحتوي على الفيرميكوليت العقيمة (الشكل 2 لتر) أو في نظام الزراعة المائية.
دراسة التعبير الزمانية المكانية للمروج نين العقيدات على حدة، تم تلقيح جذور شعر مع ر. تروبيسي، ولوحظ نشاط غوس في التطعيم بعد انتهاء فترات دورية حسب الحاجة التجريبية. التطعيم مع تروبيسي ر الناجم عن تعبير غوس قوية في جذور المعدلة وراثيا, مشيراً إلى أن يدفع رهيزوبيا التعبير نين في الفول المشتركة (الشكل 3A). علاوة على ذلك، أخذ العينات في 6-9 نقطة في البوصة وأظهر التعبير غوس في خلايا جذور الشعر إصابة (الشكل 3B). فاصولياء بريمورديوم العقيدات، والعقيدات الشابات وناضجة أظهرت أيضا التعبير نين (الشكل 3). في جميع مراحل نودوليشن، وليس هذا التعبير غوس شهدت جذور مكافحة ناقلات (3D الشكل، 3E، 3F).
الشكل 1 : مخطط الشائع P. نين بنية الجينات والاستنساخ- (A) A التمثيل التخطيطي نين الجينات هيكل عرض 5 'UTR (الأخضر)، 4 exons، إينترونس 3، و 3' UTR (الأحمر) على كروموسوم رقم 9 من ص الشائع. المنبع إلى كودون بدء الترجمة نين ATG، يظهر منطقة مروج في أوليجوس التي تم تصميمها. FO، اليغو إلى الأمام؛ ريال عماني، اليغو العكسية؛ ATG، كودون ابدأ؛ ﻷعمالهم، كودون التوقف. (ب) بفنين منطقة المروج تم تضخيمه من طازجة معزولة استخدام مجموعة اليغو الخاصة بالمروج الشائع P. الحمض النووي. M، سلم 1 كيلوبايت؛ تفاعل PCR 1، مع جدنا عرض أمبليكون حجم 700 بي بي؛ تفاعل PCR 2، دون جدنا (-ve التحكم). (ج) فحص والبلازميدات بينتر/د-توبو-بفنين بالاسترداد باستخدام أوليجوس M13 محددة في مكافحة ناقلات. الملاحق الصحيح قد عصابة في 1,024 بي بي (لين 3-6) وناقلات دون إدراج سوف يكون عصابة bp 324 (لين 1-2). (د) المروج خريطة متجه ثنائي التعبير المستخدمة في هذه الدراسة، عرض ناقل pBGWFS7.0 بفنين المروج في الانصهار مع جوس والتجارة والنقل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: رهيزوجينيس أ تتحول جذور شعر من حبوب المشتركة. (أ) تعقيم بذور الشائع P. عام "جامبا نيغرو" الإنبات على ورق الترشيح العقيمة. (ب) البذور، معطف إزالتها. الأنبوب (ج) الإعداد لتحريض الجذر شعر. (د) إلغاء خارج الثقافة رهيزوجينيس أ (بنين & عنصر التحكم). (ﻫ) الثقافة رهيزوجينيس أ حراكه في تعقيم ماء مقطر. (و، ز) حقن الخلايا البكتيرية في هيبوكوتيليس. (ح) أنبوب الإعداد مع الشتلات فاصولياء حقن الخلايا البكتيرية. (أنا, J) شكلت كالي في الموقع أصيب 5-7 إدارة شؤون الإعلام. (ك) شعر جذور 15 نقطة في البوصة (L) نسق جذور الصنبور سم 2 أسفل الموقع الجذر شعر التعريفي. تلقيح النباتات المركبة (M) زرعها في الفيرميكوليت العقيمة مع تروبيسي ر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : تحليل المروج الشائع P. نين في محوره وراثيا الشائع P. الجذور. نمط التعبير نين كشفت عن طريق بناء promoterNIN::GUS-التجارة والنقل في جذور شعر المعدلة وراثيا المحتضنة مع جوس كركيزة المكانية والزمانية. صور المجهر الضوئي من بفنين: غوس: تلقيح جذور (A) مع تروبيسي ر، غوس (ب) التعبير في الكروشيه جذر الشعر، والعقيدات الشابات (ج). صور لعنصر التحكم (متجه فارغة) عرض لا هذا التعبير غوس في جذور (د) تلقيح مع تروبيسي ر.، (ه) كرة لولبية الشعر الجذر، والعقيدات الشابات (F). الصحة الإنجابية، جذر الشعر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
أثناء التحليل الوظيفي للجينات، دراسة أنماط التعبير الجيني يلعب دوراً حاسما في فهم التنظيم المكاني والزماني للجينات في الجسم الحي. طريقة معروفة لدراسة أنماط التعبير الجيني لاستنساخ منطقة المروج الجين موضع الاهتمام، المنبع لمراسل الجينات مثل الجينات علامة نيون (التجارة والنقل، وطلب تقديم العروض، إلخ) أو β-جلوكورونيداسي. وهنا، اخترنا منطقة مروج الجذر العقيدات التكافل (RNS) جين معين، نين، دراسة أنماط التعبير الزمانية في P. الشائع خلال RNS. وقد تم استنساخ التسلسل المحدد المروج المنبع للصحفيين GFP::GUS باستخدام الأسلوب العبارة إلى ناقل تعبير مروج.
لقد قمنا بوصف التعبير عن مروج التكافل المحددة في نظام الجذر شعر الشائع ص. شعر نظام الجذر قد استخدمت على نطاق واسع لتوصيف وظيفي للجينات، بما في ذلك [رني] وساطة الجينات هدم، حمل خارج الرحم التعبير التأسيسي للجينات والتعبير المروج والتعريب البروتين في محاصيل المعاندة. المزايا الرئيسية لهذا النظام هي أنه من السهل واستنساخه وموثوق بها، وفي الوقت نفسه عدم العمل المكثف. اعتمدت نظام الجذر شعر بنجاح في البقوليات المحاصيل الأخرى مثل غ. ماكس24، برميلية م.25، japonicus ل26،27، والطماطم28، إلخ، مع بإدخال التعديلات اللازمة. علاوة على ذلك، يمكن اعتماد الأداة في الأنواع الأخرى غير البقول والبقول عند الأمثل لمناسبة رهيزوجينيس أ سلالة، طريقة التطعيم، وظروف النمو.
وهناك العديد من المعالم الهامة. أثناء تحديد منطقة المروج، ينبغي الحرص على تصميم أوليجوس التي سوف تضخيم العناصر الضرورية المروج، ابتداء من منطقة المنبع سيتين بدء ترجمة البروتين ترميز الجينات؛ المروج وينبغي إجراء تحليل باستخدام البرمجيات المتاحة لجمع المعلومات عن عوامل النسخ ملزمة في المنطقة التنظيمية. العناية أثناء حمل جذور شعر: حقن الشتلات في المرحلة المناسبة؛ أثناء الحقن، التأكد من أن الإبرة لا تمر عبر هيبوكوتيلي؛ والمحافظة على الظروف الرطبة العالية. علاوة على ذلك، بينما يدرس ملامح التعبير المروج في جذور شعر، جذور شعر تنتجها رهيزوجينيس أ لا تتحول دائماً، وبالتالي من المهم تأكيد طبيعة جذور استخدام الصحفيين بروتينات فلورية خضراء أو جوس قبل تحويلها يقوم بإجراء دراسات التعبير المروج. ينبغي اختيار سلالات مناسبة من الريزوبيوم وتركيزات أن تعدل كما هو مبين في البروتوكول. أخذ العينات في مراحل مناسبة التطعيم وظيفة أمر حاسم لتوثيق التعبير الزمانية للمروج في مراحل مختلفة من RNS.
إنتاج جذر شعر رهيزوجينيس أ- حولت أحد الأساليب البديلة أسرع وكفاءة لتوليد النباتات المركبة في P. الشائع. هذه النباتات المركبة لا يمكن أن تنتج البذور المعدلة وراثيا، ولكن يمكن أن تنتج جذور المعدلة وراثيا في غضون أيام قليلة. في هذا البروتوكول، خلافا لسائر الأساليب29، صيانة الأنابيب المغلقة الرطوبة العالية المستمرة لتعزيز جذور شعر أسرع ب 10 أيام نقطة في البوصة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
وأيده هذا العمل جزئيا ديل المديرية العامة للشؤون التاريخ الشخصي، دجابا/بابيت-جامعة المكسيك الوطنية المستقلة (منحة لا. IN219916 M.L و IA205117 إلى م-ك. A) و y Consejo ناسيونال دي العلوم Tecnològia (منحة المجلس الوطني رقم 240614 لحركة التحرير).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primers for qRT-PCR assay | |||
| pNIN Forward | CACC ATA GCT CCC CAA AAT GGT AT | ||
| pNIN Reverse | CAT CTT CCT TCC ACT AAC TAA C | ||
| M13 Forward | GTA AAA CGA CGG CCA G | ||
| M13 Reverse | CAG GAA ACA GCT ATG AC | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| pENTR/D-TOPO Cloning Kit | Invitrogen | K243520 | |
| Gateway LR Clonase II Enzyme Mix | Invitrogen | 11791100 | |
| pBGWFS7.0 | Plant systems biology | https://gateway.psb.ugent.be/vector/show/pBGWFS7/search/index/ | |
| Platinum Taq DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific | 10966018 | |
| DNeasy Plant Mini Kit | Qiagen | 69104 | |
| PureLink Quick Gel Extraction Kit | ThermoFisher Scientific | K210012 | |
| Platinum Pfx DNA Polymerase | Invitrogen | 11708013 | |
| Certified Molecular Biology Agarose | Bio-Rad | 1613102 | |
| One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli | Invitrogen | C404006 | |
| Nacl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Tryptone | Sigma-Aldrich | T7293-250G | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1625-250G | |
| Bacteriological agar | Sigma-Aldrich | A5306-1KG | |
| Kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | 60615-25G | |
| Spectinomycin sulfate | Sigma-Aldrich | PHR1441 | |
| Ethyl alcohol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Bacteriological peptone | Sigma-Aldrich | P0556 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Nalidixic acid | Sigma-Aldrich | N8878 | |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Gel loading solution | Sigma-Aldrich | G7654 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EQUIPMENT | |||
| Thermocycler | Veriti Thermal Cycler | 4375786 | |
| Centrifuge | Sigma | Sigma 1-14K | |
| Gel documentation unit | Carestream | Gel Logic 212 PRO | |
| MaxQ SHKE6000 6000 Shaking Incubator - 115VAC | Thermo scientific | EW-51708-70 | |
| Plant growth chamber | MRC | PGI-550RH | |
| Horizantal laminarair flow cabinate | Lumistell | LH-120 | |
| Fluorescent microscope | Leica | DM4500 B | |
| Petridish | sym laboratorios | 90X15 | |
| Scalpel Blade | Fisher scientific | 53223 | |
| Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher scientific | 14-959-53A | |
| 22 mL glass tubes | Thomas scientific | 45048-16150 |
References
- Hernández-Garcia, C. M., Finer, J. J. Identification and validation of promoters and cis-actingregulatory elements. Plant Science. 217-218, 109-119 (2014).
- Dhanapal, A. P., Govindaraj, M. Unlimited Thirst for Genome Sequencing, Data Interpretation, and Database Usage in Genomic Era: The Road towards Fast-Track Crop Plant Improvement. Genetics Research International. , 684321 (2015).
- Nanjareddy, N., Arthikala, M. K., Blanco, L., Arellano, E. S., Lara, M. Protoplast isolation, transient transformation of leaf mesophyll protoplasts and improved Agrobacterium-mediated leaf disc infiltration of Phaseolus vulgaris: Tools for rapid gene expression analysis. BMC Biotechnol. 16 (1), 53 (2016).
- Pumplin, N., Zhang, X., Noar, R. D., Harrison, M. J. Polar localization of a symbiosis-specific phosphate transporter is mediated by a transient reorientation of secretion. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (11), E665-E672 (2012).
- Kryvoruchko, I. S., et al. MtSWEET11, a Nodule-Specific Sucrose Transporter of Medicago truncatula. Plant Physiol. 171 (1), 554-565 (2016).
- Suzaki, T., Yano, K., Ito, M., Umehara, Y., Suganuma, N., Kawaguchi, M. Positive and negative regulation of cortical cell division during root nodule development in Lotus japonicus is accompanied by auxin response. Development. 139 (21), 3997-4006 (2012).
- Suzaki, T., et al. Endoreduplication-mediated initiation of symbiotic organ development in Lotus japonicus. Development. 141 (12), 2441-2445 (2014).
- Qin, L., et al. The high-affinity phosphate transporter GmPT5 regulates phosphate transport to nodules and nodulation in soybean. Plant Physiol. 159 (4), 1634-1643 (2012).
- Wang, Z., Panfeng, L., Yan, Y., Chi, Y., Fan, B., Chen, Z. Expression and Functional Analysis of a Novel Group of Legume-specific WRKY and Exo70 Protein Variants from Soybean. Sci Rep. 6, 32090 (2016).
- Montiel, J., et al. A Phaseolus vulgaris NADPH oxidase gene is required for root infection by Rhizobia. Plant Cell Physiol. 53 (10), 1751-1767 (2012).
- Arthikala, M. K., et al. PvRbohB negatively regulates Rhizophagus irregularis colonization in Phaseolus vulgaris. Plant Cell Physiol. 54 (8), 1391-1402 (2013).
- Arthikala, M. K., Sánchez-López, R., Nava, N., Santana, O., Cárdenas, L., Quinto, C. RbohB a Phaseolus vulgaris NADPH oxidase gene, enhances symbiosome number, bacteroid size, and nitrogen fixation in nodules and impairs mycorrhizal colonization. New Phytol. 202 (3), 886-900 (2014).
- Barraza, A., et al. Down-regulation of PvTRE1 enhances nodule biomass and bacteroid number in the common bean. New Phytol. 197 (1), 194-206 (2013).
- Estrada-Navarrete, G., et al. An autophagy-related kinase is essential for the symbiotic relationship between Phaseolus vulgaris and both rhizobia and arbuscular mycorrhizal fungi. Plant Cell. 28 (9), 2326-2341 (2016).
- Nanjareddy, K., et al. A Legume TOR Protein Kinase Regulates Rhizobium Symbiosis and Is Essential for Infection and Nodule Development. Plant Physiol. 172 (3), 2002-2020 (2016).
- Frühling, M., Schröder, G., Hohnjec, N., Pühler, A., Perlick, A. M., Küster, H. The promoter of the Vicia faba L. gene VfEnod12 encoding an early nodulin is active in cortical cells and nodule primordia of transgenic hairy roots of Vicia hirsuta as well as in the prefixing zone II of mature transgenic V. hirsuta root nodules. Plant Science. 160 (1), 67-75 (2000).
- Szabados, L., Ratet, P., Grunenberg, B., de Bruijn, F. J. Functional analysis of the Sesbania rostrata leghemoglobin glb3 gene 5'-upstream region in transgenic Lotus corniculatus and Nicotiana tabacum plants. Plant Cell Online. 2 (10), 973-986 (1990).
- Madsen, L. H., Tirichine, L., Jurkiewicz, A., Sullivan, J. T., Heckmann, A. B., Bek, A. S., Ronson, C. W., James, E. K., Stougaard, J. The molecular network governing nodule organogenesis and infection in the model legume Lotus japonicus. Nat Commun. 12, 1-10 (2010).
- Montiel, J., Arthikala, M. K., Quinto, C. Phaseolus vulgaris RbohB functions in lateral root development. Plant Signal Behav. 8 (1), 1-3 (2013).
- Nanjareddy, K., Arthikala, M. K., Gómez, B. M., Blanco, L., Lara, M. Differentially expressed genes in mycorrhized and nodulated roots of common bean are associated with defense, cell wall architecture, N metabolism, and P metabolism. PLoS ONE. 12 (8), e0182328 (2017).
- Karimi, M., Inzé, D., Depicker, A. Gateway vectors for Agrobacterium-mediated plant transformation. Trends Plant Sci. 7 (5), 193-195 (2002).
- Broughton, W. J., Dilworth, M. J. Control of leghemoglobin synthesis in snake beans. Biochem J. 125 (4), 1075-1080 (1971).
- Jefferson, R. A. Assaying chimeric genes in plants, the GUS gene fusion system. Plant Mol Biol Rep. 5 (4), 387-405 (1987).
- Cho, H. J., Farrand, S. K., Noel, G. R., Widholm, J. M. High-efficiency induction of soybean hairy roots and propagation of the soybean cyst nematode. Planta. 210 (2), 195-204 (2000).
- Deng, Y., Mao, G., Stutz, W., Yu, O. Generation of Composite Plants in Medicago truncatula used for Nodulation Assays. J. Vis. Exp. (49), e2633 (2011).
- Kumagai, H., Kouchi, H. Gene silencing by expression of hairpin RNA in Lotus japonicus roots and root nodules. Mol Plant Microbe Interact. 16 (8), 663-668 (2003).
- Okamoto, S., Yoro, E., Suzaki, T., Kawaguchi, M. Hairy Root Transformation in Lotus japonicus. Bio-protocol. 3 (12), e795 (2013).
- Jacobs, T. B., Martin, G. B. High-throughput CRISPR Vector Construction and Characterization of DNA Modifications by Generation of Tomato Hairy Roots. J. Vis. Exp. (110), e53843 (2016).
- Estrada-Navarrete, G., et al. Agrobacterium rhizogenes-transformation of the Phaseolus spp.: a tool for functional genomics. Mol Plant Microbe Interact. 19 (12), 1385-1393 (2006).
