Summary
प्रवर्तक अभिव्यक्ति विश्लेषण जीन विनियमन और लक्ष्य जीन की spatiotemporal अभिव्यक्ति की समझ में सुधार करने के लिए महत्वपूर्ण हैं । इस के साथ साथ हम एक प्रोटोकॉल की पहचान करने के लिए प्रस्तुत, अलग, और एक संयंत्र प्रवर्तक क्लोन । इसके अलावा, हम आम बीन बालों की जड़ों में पिंडी विशेष प्रमोटर के लक्षण वर्णन ।
Abstract
जीन कोडिंग अनुक्रम के ऊपर अनुक्रम प्रमोटर जुगाड़ के रूप में पद पर हैं । प्रवर्तकों के अभिव्यक्ति पैटर्न का अध्ययन करने से जीन विनियमन और लक्ष्य जीनों के spatiotemporal अभिव्यक्ति पैटर्न को समझने में बहुत महत्वपूर्ण हैं. दूसरी ओर, यह भी प्रमोटर मूल्यांकन उपकरण और आनुवंशिक परिवर्तन तकनीक है कि तेजी से कर रहे हैं, कुशल स्थापित करने के लिए महत्वपूर्ण है, और प्रतिलिपि । इस अध्ययन में हमने rhizobial सहजीवन-विशिष्ट पिंड स्थापना के spatiotemporal अभिव्यक्ति पैटर्न की जांच की (नीं) ट्रांसजेनिक बालों की जड़ों में Phaseolus के प्रवर्तक । संयंत्र जीनोम डेटाबेस और विश्लेषण उपकरण हम पहचान, पृथक का उपयोग करना, और एक transcriptional संलयन में P. नीं प्रमोटर क्लोन chimeric रिपोर्टर β-glucuronidase (गस) गस-बढ़ाया: GFP । इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल पी एग्रोबेक्टीरियम rhizogenes प्रेरित बालों की जड़ों का उपयोग कर में आनुवंशिक परिवर्तन की एक तेजी से और बहुमुखी प्रणाली का वर्णन । इस प्रणाली के परिवर्तन के बाद 10 से 12 दिनों में ≥ 2 सेमी बालों वाली जड़ें उत्पंन करता है । इसके बाद, हमने पोस्ट-टीका के आवधिक अंतरालों पर Rhizobium inoculated बालों की जड़ों में निं न प्रवर्तक की spatiotemporal अभिव्यक्ति का मूल्यांकन किया । हमारे गस गतिविधि द्वारा दर्शाया परिणाम बताते है कि nodulation की प्रक्रिया के दौरान नीं प्रमोटर सक्रिय था । साथ में, वर्तमान प्रोटोकॉल दर्शाता है कि कैसे की पहचान करने के लिए, अलग, क्लोन, और आम बीन बालों की जड़ों में एक संयंत्र प्रवर्तक विशेषताएं । इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल गैर विशेष प्रयोगशालाओं में उपयोग करने के लिए आसान है ।
Introduction
प्रवर्तक महत्वपूर्ण आणविक जैविक उपकरण हैं जो ब्याज के जीन की अभिव्यक्ति के नियमन को समझने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं. प्रवर्तकों डीएनए जीन अनुक्रम के अनुवाद दीक्षा codon के ऊपर स्थित अनुक्रम कर रहे है और वे जीन की केंद्रीय नियामक जानकारी ले; इसलिए, उनके सही एनोटेशन और लक्षण वर्णन जीन समारोह को समझने के लिए महत्वपूर्ण हैं । अभिव्यक्ति पैटर्न के आधार पर, संयंत्र प्रवर्तकों के रूप में वर्गीकृत किया जाता है, ऊतक विशिष्ट, या विकास-चरण-विशिष्ट और inducible1। transcriptomic प्रौद्योगिकियों में प्रगति, कंप्यूटर मॉडलिंग में सुधार, और विभिन्न प्रजातियों के पौधे के लिए जीनोम दृश्यों की बढ़ती संख्या की उपलब्धता प्रमोटर जुगाड़ की बड़े पैमाने पर भविष्यवाणी की सुविधा है2.
दूसरी ओर, यह भी प्रमोटर मूल्यांकन उपकरण और आनुवंशिक परिवर्तन तकनीक है कि तेजी से कर रहे हैं, कुशल स्थापित करने के लिए महत्वपूर्ण है, और प्रतिलिपि । अंय मॉडल संयंत्रों के विपरीत, आम बीन फली के कार्यात्मक लक्षण वर्णन (पी.) जीन मुख्य रूप से Phaseolus सपा के अड़ियल स्वभाव के कारण में बाधा है । स्थिर आनुवंशिक परिवर्तन के लिए । क्षणिक परिवर्तन प्रणालियों तेजी से जीन कार्यात्मक लक्षण वर्णन3अध्ययन के लिए एक विकल्प के रूप में सेवा । फली सहजीवन अनुसंधान में, फली मेजबान संयंत्र और rhizobial जीवाणु के बीच बातचीत पिंड के कार्यात्मक विश्लेषण के लिए सबसे योग्य मॉडल प्रणालियों में से एक है विशिष्ट जीन और प्रमोटर अध्ययन । अब तक इन symbioses से संबंधित कई फली प्रवर्तकों की विशेषता रही है, यथा, मेडिकागो truncatula PT44, SWEET115, लोटस japonicus Cyclops, UBQ6, VAG17, Glycine मैक्स PT5 8, Exo70J9, पी. के. RbohB10,11,12, TRE113, PI3K14, टो15, आदि । सीआईएस तत्वों सीधे जीन विनियमन को प्रभावित । प्रतिलेखन कारक ENBP1A जल्दी nodulin VfENOD12 के एक सीआईएस विनियामक क्षेत्र (− ६९२ bp) के लिए बाइंड कर देता है, और यह primordia Vicia16के पिंड faba में एक रिपोर्टर जीन की अभिव्यक्ति की सुविधा । सीआईएस विनियामक क्षेत्रों का प्रतिस्थापन (− १६१ से − ४८ बीपी) पिंड-विशिष्ट प्रवर्तक leghemoglobin GLB3 के heterologous के साथ कटा हुआ प्रवर्तकों δ-p35S और δ-pNOS, पिंड विशिष्टता और कम प्रमोटर गतिविधि की हानि के परिणामस्वरूप17 .
पिछली रिपोर्टों से पता चलता है कि प्रतिलेखन कारक जड़ बालों की कोशिकाओं में rhizobial संक्रमण की दीक्षा के लिए नीं आवश्यक है और एल japonicus18में पिंड organogenesis के लिए भी आवश्यक है । वर्तमान अध्ययन में, हम पहचान, अलगाव, क्लोनिंग के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन है, और आम बीन बालों की जड़ों में पिंड-विशिष्ट प्रमोटर के लक्षण वर्णन । इस लक्ष्य को प्राप्त करने के लिए, हम एक rhizobial सहजीवन-विशिष्ट नीं प्रवर्तक का चयन किया और एक transcriptional फ्यूजन में chimeric रिपोर्टर गस को क्लोन-बढ़ाया:: GFP । इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल पी. ए. rhizogenes प्रेरित बालों की जड़ों का उपयोग कर में आनुवंशिक परिवर्तन की एक तेजी से और बहुमुखी प्रणाली का वर्णन । इस प्रणाली से कम 2 हफ्तों में परिवर्तन के बाद बालों जड़ों उत्पंन करता है । अंत में, हम गस धुंधला द्वारा rhizobia बृहदांत्र जड़ पिंड में नीं प्रमोटर की spatiotemporal अभिव्यक्ति का आकलन किया ।
यहां वर्णित प्रक्रिया न केवल nodulation और फली संयंत्रों के mycorrhization11 के अध्ययन के लिए उपयोगी हो सकती है, लेकिन यह भी जड़ें19में प्रमोटर अभिव्यक्ति पैटर्न के अध्ययन के लिए । इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल गैर विशेष प्रयोगशालाओं में उपयोग करने के लिए आसान है ।
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Protocol
1. P की पहचान, अलगाव, और क्लोनिंग
- रुचि के जीन के लिए प्रवर्तक अनुक्रम की पहचान करें । ऐसे Phytozome, Ensembl पौधों, NCBI, आदि के रूप में पौधों के लिए उपलब्ध कई जीनोम डेटाबेस और विश्लेषण उपकरण हैं । एक फली प्रवर्तक पी. नीं (PvNIN; Phvul. 009G115800) का उपयोग इस अध्ययन में किया गया था20.
- या तो गेटवे या पारंपरिक प्रतिबंध के लिए डिजाइन ओलिगोस्पर्मिया एंजाइम क्लोनिंग सदिश प्रणाली (चित्र 1a) के आधार पर इस्तेमाल किया ।
नोट: मानक (25-35 bp), नमकीन प्राइमर काम ठीक है । रिवर्स oligo अनुक्रम है कि प्रमोटर और जीन के बीच पार्श्व सलाह दी जाती है । - PvNIN प्रवर्तक क्षेत्र (या ब्याज के जीन के प्रवर्तक क्षेत्र) हौसले से पृथक P. जीनोमिक डीएनए से प्रवर्तक-विशिष्ट oligo सेट का उपयोग कर बढ़ाना । निंनलिखित पीसीआर शर्तों के साथ एक उच्च निष्ठा पोलीमरेज़ का प्रयोग करें: 5 मिनट के लिए ९५ ° c; 30 एस, 30 एस के लिए ५५ ° c, 1 मिनट के लिए ७२ ° c के लिए ९५ ° c); और 5 मिनट के लिए ७२ ° c ।
- प्रवर्धित टुकड़ा पर 1% agarose जेल पर ६० V पर एक 7 x 10 सेमी जेल ट्रे, और elute संगत amplicon (७०० bp, आरेख 1b) और pENTR/D-टोपो वेक्टर में निर्माता के निर्देशों के अनुसार क्लोन चलाएं ।
- बदलने के निर्माता के निर्देश और प्लेट १५० µ एल lysogeny भाई (पौंड) ५० mg/L कनमीसिन (Kan50) के साथ पूरक पर परिवर्तन के मिश्रण का उपयोग कर सक्षम ई कोलाई कोशिकाओं में प्रतिक्रिया के 2 µ l. ३७ डिग्री सेल्सियस पर मढ़वाया कोशिकाओं को विकसित रातोंरात ।
- 3-6 कालोनियों उठाओ और उंहें पौंड Kan50 युक्त मध्यम में रातोंरात संस्कृति । अलग प्लाज्मिड डीएनए पसंद की विधि का उपयोग कर और पीसीआर द्वारा प्लाज्मिड का विश्लेषण वेक्टर विशिष्ट M13 ओलिगोस्पर्मिया का उपयोग कर । पीसीआर के लिए, प्लाज्मिड के १०० एनजी, ओलिगोस्पर्मिया के ०.३ pm, 10x पीसीआर बफर, ०.५ यू Taq डीएनए पोलीमरेज़, और 10 मिमी dNTPs का उपयोग करें ।
- निम्नलिखित पीसीआर प्रवर्धन शर्तों का उपयोग करें; 3 मिनट के लिए ९५ ° c; 30 एस के लिए ९५ डिग्री सेल्सियस, 30 एस के लिए ५८ डिग्री सेल्सियस, ७२ ° c ७५ s के लिए); और ७२ ° c 7 min. 1% agarose जेल पर पीसीआर उत्पादों कल्पना । सुनिश्चित करें कि सही सम्मिलन एक बैंड है १,०२४ बीपी और वैक्टर आवेषण के बिना एक ३२४ बीपी बैंड (चित्रा 1C) होगा.
- एक प्रवेश वेक्टर (pENTR/D-टोपो-PvNIN) और गंतव्य वेक्टर pbgwfs 7.021 के बीच LR प्रतिक्रिया प्रदर्शन निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक वाणिज्यिक एंजाइम मिश्रण का उपयोग कर ।
- के रूप में निर्माता के निर्देश और प्लेट १५० µ l में १०० मिलीग्राम के साथ पूरक के रूप में वर्णित मानक तकनीकों का उपयोग कर सक्षम ई. कोलाई कोशिकाओं में LR प्रतिक्रिया के 2 µ एल रूपांतरण (Spe100) । ३७ डिग्री सेल्सियस पर मढ़वाया कोशिकाओं को विकसित रातोंरात ।
- लगभग 5 कालोनियों और संस्कृति उंहें पौंड Spe100 युक्त मध्यम में रातोंरात उठाओ । प्लाज्मिड डीएनए अलग पसंद की एक विधि का उपयोग कर और पीसीआर द्वारा प्लाज्मिड का विश्लेषण प्रमोटर विशिष्ट ओलिगोस्पर्मिया का उपयोग कर ।
- चरण १.३ में पीसीआर शर्तों का उपयोग करें । प्रवर्धन की पुष्टि के लिए 1% agarose जेल पर पीसीआर उत्पादों कल्पना । Amplicons ७०० बीपी हैं ।
- अनुक्रम धनात्मक प्लाज्मिड pbgwfs 7.0/PvNIN:: गस-GFP (चित्र 1 d) प्रवर्तक-विशिष्ट ओलिगोस्पर्मिया के साथ सम्मिलित की प्रामाणिकता सत्यापित करने के लिए.
- plasmids को a. rhizogenes तनाव K599 में रूपांतरित करें (हालांकि, a. rhizogenes के किसी अंय उपभेदों का उपयोग किया जा सकता है) । १.८ केवी, 25 electroporate, और २०० Ω: 1 मिमी cuvette में electrocompetent कोशिकाओं और µF के ५० µ एल के लिए प्लाज्मिड तैयारी के 2 µ एल जोड़ें ।
- समाज माध्यम के ~ ५०० µ एल में कोशिकाओं को पुनर्प्राप्त और पौंड-Spe100 पर 2 ज. प्लेट के लिए 28 डिग्री सेल्सियस पर शेक और 2 दिनों के लिए 28 डिग्री सेल्सियस पर हो जाना ।
- १.७ चरण में वर्णित के रूप में कॉलोनी स्क्रीनिंग प्रदर्शन और १.३ चरण में के रूप में पीसीआर शर्तों का उपयोग करें । सकारात्मक क्लोनों से ग्लिसरॉल स्टॉक्स बनाओ और उंहें में स्टोर-८० ° c ।
- उपयोग A. rhizogenes culture खाली pbgwfs 7.0 वेक्टर नकारात्मक नियंत्रण के रूप में ।
2. ए. Rhizogenes आम बीन के बालों की जड़ें बदल
- बाँझ बीन (P. cv. नीग्रो Jamapa) बीज (लगभग 20) ९६% इथेनॉल के ५० मिलीलीटर में 1 मिनट के लिए और इथेनॉल त्यागें; फिर एक लामिना फ्लो हुड में लगातार मिश्रण के साथ, 10 मिनट के लिए 20% ब्लीच (सोडियम हाइपोक्लोराइट) की ५० मिलीलीटर जोड़ें । ब्लीच निकालें और अधिक बाँझ पानी में 3 बार धोने ।
नोट: अन्य P. किस्मों बालों जड़ प्रेरण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । - बाँझ फ़िल्टर कागज पर निष्फल बीज अंकुरित Broughton & #38; Dilworth (B & #38;D) समाधान22 (तालिका 1) के लिए अंधेरे में 2 दिनों के लिए 28 ° c.
- परिवर्तन के पहले दिन निंनलिखित तैयार:
- लकीर बाहर १५० µ एल के ए. rhizogenes संस्कृति द्विआधारी सदिश बंदरगाह (चरणों में तैयार १.१३ और १.१४) ठोस पौंड Spe100 पर और 28 ° c रातोंरात पर हो जाना ।
- B & #38;D समाधान के साथ एक 15 मिलीलीटर ट्यूब भरें और डबल स्तरित एल्यूमीनियम पंनी के साथ पेंच टोपी की जगह । एक 22 सेमी ग्लास ट्यूब जिसमें बी & #38;D सॉल्यूशन (figure 2c) के 10 मिलीलीटर और इसे आटोक्लेव में इकट्ठा करें ।
- परिवर्तन के दिन, एक लामिना फ्लो हूड में निम्नलिखित बाँझ सामग्री इकट्ठा: कदम से अंकुरित बीज २.२, कदम से संस्कृति प्लेट 2.3.1, ट्यूबों से कदम 2.3.2, बाँझ डबल आसुत जल (10 मिलीलीटर), पिपेट और पिपेट युक्तियाँ, बाँझ संदंश, और 3 एमएल सीरिंज ।
- एक तुला २०० µ एल टिप का उपयोग करने के लिए एक microcentrifuge ट्यूब में प्लेट से एक. rhizogenes कोशिकाओं परिमार्जन और डबल बाँझ पानी की 1 मिलीलीटर में reसस्पैंड । इसी प्रकार, वेक्टर नियंत्रण कक्ष अलग से तैयार करें ।
- धीरे reसस्पैंड करने के लिए कोशिकाओं को मिलाएं । भंवर मत करो ।
- एक बाँझ पिपेट टिप का उपयोग कर कदम 2.3.2 से ट्यूबों के एल्यूमीनियम पंनी पर एक 3 मिमी छेद बनाओ ।
- सिरिंज के साथ कदम २.५ से कोशिकाओं (या तो प्रमोटर या वेक्टर नियंत्रण) लीजिए और थोड़ा सुई टिप (चित्रा 2g) के साथ अंकुरित बीज के जैसे चुभन.
नोट: सुनिश्चित करें कि सुई प्रवेश (4-6 बार) संवहनी ऊतक और छोटे सुई (~ 5 µ एल) hypocotyl के आसपास विभिन्न पदों पर घाव पर कोशिकाओं की बूँदें. - ध्यान से 15 मिलीलीटर ट्यूब युक्त 3 मिमी छेद में इंजेक्शन अंकुर की जड़ों डालें B & #38;D समाधान । 22 मिलीलीटर ग्लास ट्यूबों में पूरे सेटअप लौटें और उंहें नमी बनाए रखने के लिए सील ।
- 16 ज लाइट के साथ 28 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा विकास चैंबर में ट्यूबों मशीन: 8 एच डार्क photoperiod ।
नोट: 3-4 दिन की मशीन के बाद, पौधों को 22 मिलीलीटर कांच ट्यूबों के रिम तक हो जाना ।
नोट: यह बी & #38;D समाधान लगातार दोनों प्लास्टिक और ग्लास ट्यूबों में बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है ।
3. प्रमोटर एनालिसिस: कॉमन बीन के Rhizobial पिंड में नीं पाऊडर एक्सप्रेशन
- रूट पिंड की प्रेरण के लिए, लगाना Rhizobium tropici या Rhizobium etli (जो आम बीन करने के लिए संगत कर रहे हैं) में PY मध्यम (०.५ g peptone, ०.३ g खमीर निकालने) ७०० मिमी CaCl के साथ पूरक है2 और 20 मिलीग्राम एमएल− 1 nalidixic अम्ल. ३०० rpm पर झटकों के साथ 24 एच के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर मशीन ।
नोट: किसी भी विशिष्ट एंटीबायोटिक दवाओं ट्रांसजेनिक Rhizobiumके मामले में इस्तेमाल किया जा सकता है । - एक कमरे के तापमान पर २,८०० x g में 3 मिनट के लिए एक केंद्रापसारक में कोशिकाओं को गोली और 10 मिमी MgSO4में से 10 मिलीलीटर में reसस्पैंड । 10 mM MgSO4के साथ कमजोर पड़ने से आयुध डिपो६०० पर ०.६ करने के लिए कोशिकाओं के आयुध डिपो समायोजित करें ।
- संस्कृति के 1-2 एमएल लगाना (३.२ कदम से तैयार) संयंत्र के प्रति (दोनों प्रमोटर और वेक्टर नियंत्रण) बालों की जड़ों पर पिंड विकास प्रेरित करने के लिए । nodulation को बढ़ावा देने के लिए सीमित नाइट्रोजन (2 mM KNO3) के साथ बी & #38;D सॉल्यूशन के साथ पौधों की सिंचाई करें ।
- प्रायोगिक जरूरत पर निर्भर करता है, अलग समय बिंदुओं पर बालों की जड़ों को इकट्ठा । 3-5 दिन पोस्ट टीका (dpi) के बीच संक्रमण थ्रेड का अध्ययन करने के लिए नमूने एकत्रित करें ।
नोट: मौलिक पिंड और युवा पिंड क्रमशः 6-9 डीपीआई और 10-12 दिन डीपीआई, पर अध्ययन किया जा सकता है । अंत में, परिपक्व और कार्यात्मक पिंड 14-21 डीपीआई पर अध्ययन किया जा सकता है, और senesced पिंड & #62 पर; 28 डीपीआई । - रिपोर्टर जीन (गस या GFP) की गतिविधि के लिए रूट/ 23जेफरसन द्वारा वर्णित प्रोटोकॉल के अनुसार गस गतिविधि का विश्लेषण । एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत GFP निरीक्षण । एक ब्लू आर्गन आयन लेजर (४८८ एनएम) के साथ GFP प्रतिदीप्ति उत्तेजित, और ५१० से ५४० एनएम उत्सर्जित प्रतिदीप्ति इकट्ठा ।
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Representative Results
इस अध्ययन का मकसद पिंडी-विशिष्ट पी. spatiotemporal की अभिव्यक्ति पैटर्न का आंकलन करना था । ऐसा करने के लिए, निं न जीन की अनुवाद दीक्षा codon के ७०० bp क्षेत्र के ऊपर का चयन किया गया था और चित्र 1aमें दर्शाए गए ओलिगोस्पर्मिया का एक सेट बनाया गया था । एक उच्च निष्ठा पोलीमरेज़ का उपयोग करना, निं न प्रवर्तक अंश को परिलक्षित किया गया था, पृथक (आंकड़ा 1b), और गंतव्य बाइनरी वेक्टर pbgwfs 7.0 (चित्रा 1C) में एक transcriptional फ्यूजन के लिए एक गेटवे दृष्टिकोण के माध्यम से क्लोन की गई chimeric रिपोर्टर गस-संवर्धित GFP (pbgwfs 7.0/PvNIN:: गस-GFP) । pbgwfs 7.0/PvNIN:: गस-GFP वेक्टर का निर्माण आम तौर पर स्वतंत्र क्लोन के सैकड़ों उत्पंन करता है । पीसीआर द्वारा कॉलोनी जांच जीन विशिष्ट ओलिगोस्पर्मिया के साथ आसानी से सही क्लोन (चित्रा 2d) की पहचान करता है । पीसीआर पॉजीटिव प्लाज्मिड को सम्मिलित करने की प्रामाणिकता सत्यापित करने के लिए प्रवर्तक-विशिष्ट ओलिगोस्पर्मिया के साथ सैंज अनुक्रम किया गया ।
प्रयोग भर में उच्च आर्द्रता बनाए रखना घट्टा और बालों की जड़ों की प्रेरण के लिए आवश्यक है । घाव भरने के स्थल पर, calli आम तौर पर 5 से 7 दिनों में मनाया जाता है (चित्रा 2J) और ≥ 2 सेमी बालों वाली जड़ों परिवर्तन के बाद 10 से 12 दिनों में मनाया जाता है । ए. rhizogenes के अधिकांश पौधों को सफलतापूर्वक 2 सप्ताह (चित्रा 2k) द्वारा बालों की जड़ों का उत्पादन करने के लिए बदल दिया । हालांकि, बालों की जड़ों की संख्या और लंबाई चर जा सकता है । इसलिए विश्लेषण और आगे के प्रयोगों के लिए सबसे जोरदार तरीके से बढ़ती जड़ों का चयन करें । उत्पाद को बालों की जड़ों के नीचे स्टेम 2 सेमी काट कर प्राथमिक जड़ और उंहें बाँझ vermiculite (चित्रा 2L) या एक हीड्रोपोनिक्स प्रणाली में युक्त बर्तन में प्रत्यारोपण ।
पिंडी-विशिष्ट नीं प्रवर्तक की spatiotemporal अभिव्यक्ति का अध्ययन करने के लिए, बालों की जड़ें R. tropiciसे inoculated थीं, और प्रायोगिक आवश्यकता के आधार पर आवधिक अंतरालों के बाद गस गतिविधि देखी गई थी । आर tropici के साथ टीका ट्रांसजेनिक जड़ों में एक मजबूत गस अभिव्यक्ति प्रेरित है, यह दर्शाता है कि rhizobia आम बीन में नीं अभिव्यक्ति (चित्रा 3) लाती है । इसके अलावा, 6-9 डीपीआई पर नमूना Rhizobium संक्रमित रूट बाल कोशिकाओं (चित्र बी) में गस अभिव्यक्ति दिखाया । Phaseolus पिंड primordium, और युवा और परिपक्व पिंड भी नीं अभिव्यक्ति (आंकड़ा 3सी) का प्रदर्शन किया । nodulation के सभी चरणों में, कोई ऐसी गस अभिव्यक्ति वेक्टर नियंत्रण जड़ों में देखा गया था (चित्रा 3d, 3E, 3F) ।
चित्र 1 : की बाह्यरेखा पी. जीन संरचना और क्लोन िंग की गई. (क) नीं जीन संरचना का एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व 5 ' UTR (हरा), 4 exons, 3 introns, और 3 ' UTR (लाल) पी.के गुणसूत्र संख्या 9 पर । नीं अनुवाद दीक्षा codon ATG को ऊपर, एक प्रमोटर क्षेत्र है जिस पर ओलिगोस्पर्मिया डिजाइन किए गए थे दिखाता है । फो, फॉरवर्ड oligo; आरओ, रिवर्स oligo; ATG, प्रारंभ codon; ताा, रोक codon । (ख) PvNIN प्रवर्तक क्षेत्र हौसले से पृथक पी. जीनोमिक डीएनए प्रवर्तक-विशिष्ट oligo सेट का उपयोग करके परिवर्धित किया गया. M, 1 केबी सीढ़ी; 1, पीसीआर ७०० बीपी के amplicon आकार दिखा gDNA के साथ प्रतिक्रिया; 2, पीसीआर gDNA (-ve नियंत्रण) के बिना प्रतिक्रिया । (ग) pENTR/डी की स्क्रीनिंग-टोपो-PvNIN plasmids का उपयोग कर पीसीआर द्वारा वेक्टर विशिष्ट M13 ओलिगोस्पर्मिया । सही सम्मिलन १,०२४ bp (लेन 3-6) और वैक्टर आवेषण के बिना एक ३२४ बीपी बैंड (लेन 1-2) होगा पर एक बैंड है । (D) प्रवर्तक अभिव्यक्ति बाइनरी वेक्टर मैप वर्तमान अध्ययन में प्रयुक्त, pbgwfs 7.0 वेक्टर गस और GFP के साथ फ्यूजन में दिखा PvNIN प्रमोटर । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 2: A. rhizogenes आम बीन के बालों की जड़ें बदल । (क) उ. प्र. का निष्फल बीज cv. नीग्रो Jamapa उगना पर बाँझ फिल्टर कागज. (B) बीज, कोट हटाया । (ग) बालों की जड़ प्रेरण के लिए ट्यूब सेटअप । (घ) बाहर परिमार्जन क. rhizogenes संस्कृति (pNIN & #38; नियंत्रण). (ङ) A. rhizogenes संस्कृति बाँझ आसुत जल में reसस्पैंड । (च, छ) hypocotyles में बैक्टीरियल कोशिकाओं इंजेक्शन. (ज) बैक्टीरियल कोशिकाओं के साथ इंजेक्शन Phaseolus अंकुरों के साथ ट्यूब सेटअप । (I, J) Calli घायल साइट पर गठित 5-7 डीपीआई । (K) बालों वाली जड़ें 15 डीपीआई (एल) ठोकर की जड़ें बालों की जड़ प्रेरण की साइट के नीचे 2 सेमी उत्पाद । (M) समग्र पौधों आर tropiciके साथ बाँझ vermiculite inoculated में प्रत्यारोपित । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 3 : के प्रवर्तक विश्लेषण ट्रांसजेनिक पी. के बातो में पी. नीं अभिव्यक्ति की स्थानिक और लौकिक पैटर्न एक promoterNIN द्वारा पता चला:: गस-GFP ट्रांसजेनिक बालों जड़ों में निर्माण एक सब्सट्रेट के रूप में गस के साथ मशीन । PvNINके ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप छवियां: गस: (क) आर tropiciके साथ जड़ें inoculated, (ख) कर्ल्ड रूट बाल में गस अभिव्यक्ति, और (ग) युवा पिंड । नियंत्रण की छवियां (खाली वेक्टर) में कोई ऐसी गस अभिव्यक्ति दिखा (घ) जड़ें inoculated आर tropiciके साथ, (ई) कर्ल्ड रूट बाल, और (च) युवा पिंड । आरएच, जड़ बाल । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
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Discussion
जीन के कार्यात्मक विश्लेषण के दौरान, जीन अभिव्यक्ति पैटर्न का अध्ययन vivo मेंजीन के स्थानिक और लौकिक विनियमन को समझने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । एक अच्छी तरह से ज्ञात विधि जीन अभिव्यक्ति पैटर्न का अध्ययन करने के लिए ब्याज की जीन प्रवर्तक क्षेत्र क्लोन, इस तरह फ्लोरोसेंट मार्कर जीन (GFP, आरएफपी, आदि) या β-glucuronidase के रूप में रिपोर्टर जीन के लिए ऊपर है । इस के साथ साथ, हम रूट पिंड सहजीवन (RNS) के एक प्रवर्तक क्षेत्र का चयन किया है विशिष्ट जीन, नीं, RNS के दौरान पी में spatio लौकिक अभिव्यक्ति पैटर्न का अध्ययन । चयनित प्रवर्तक अनुक्रम GFP करने के लिए नदी के ऊपर क्लोन किया गया है:: गस रिपोर्टर एक प्रवर्तक अभिव्यक्ति वेक्टर में गेटवे विधि का उपयोग कर ।
हमने पी. ए. के बालों की जड़ प्रणाली में सहजीवन विशिष्ट मोटर की अभिव्यक्ति का वर्णन किया है. बालों जड़ प्रणाली व्यापक रूप से जीन के कार्यात्मक लक्षण वर्णन के लिए इस्तेमाल किया गया है, RNAi मध्यस्थता जीन नीचे दस्तक, जीन की अस्थानिक गठन अभिव्यक्ति, प्रमोटर अभिव्यक्ति, और अड़ियल फसलों में प्रोटीन स्थानीयकरण सहित । प्रणाली का मुख्य लाभ कर रहे है कि यह आसान है, प्रतिलिपि, विश्वसनीय, और एक ही समय में श्रम गहन नहीं है । बालों की जड़ प्रणाली को सफलतापूर्वक जी. मैक्स24, एम. truncatula25, एल japonicus26,27, टमाटर28, आदिके रूप में अंय फसल फलियां में अपनाया गया है के साथ आवश्यक संशोधनों । इसके अलावा, उपकरण अंय फली और गैर फली प्रजातियों में अपनाया जा सकता है जब उपयुक्त ए rhizogenes तनाव, टीका की विधि, और विकास की स्थिति के लिए अनुकूलित ।
कई महत्वपूर्ण पैरामीटर हैं । जबकि प्रवर्तक क्षेत्र का चयन, देखभाल ओलिगोस्पर्मिया जो आवश्यक प्रवर्तक तत्वों बढ़ाना होगा डिजाइन लिया जाना चाहिए, अनुवाद शुरू के ऊपर क्षेत्र से शुरुआत प्रोटीन जीन कोडन sitein; प्रमोटर विश्लेषण उपलब्ध सॉफ्टवेयर का उपयोग करने के लिए नियामक क्षेत्र के लिए बाध्यकारी प्रतिलेखन कारकों पर जानकारी एकत्र किया जाना चाहिए । बालों की जड़ों उत्प्रेरण जबकि ध्यान रखना: उचित स्तर पर अंकुर इंजेक्षन; इंजेक्शन के दौरान, सुई hypocotyle के माध्यम से पारित नहीं करता है कि यह सुनिश्चित; और उच्च आर्द्रता की स्थिति बनाए रखें । इसके अलावा, बालों की जड़ों में प्रमोटर अभिव्यक्ति प्रोफाइल का अध्ययन करते हुए, बालों की जड़ें ए. rhizogenes द्वारा उत्पादित हमेशा बदल नहीं रहे हैं, और इसलिए यह GFP या गस पत्रकारों का उपयोग करने से पहले जड़ों के रूपांतरित प्रकृति की पुष्टि करने के लिए महत्वपूर्ण है प्रमोटर एक्सप्रेशन स्टडीज का प्रदर्शन । Rhizobium के उपयुक्त उपभेदों को चुना जाना चाहिए और Rhizobium की सांद्रता को प्रोटोकॉल में दर्शाए अनुसार समायोजित किया जाना चाहिए । उपयुक्त चरणों पर नमूना पोस्ट टीका RNS के विभिंन चरणों में प्रमोटर की spatio-लौकिक अभिव्यक्ति का दस्तावेजीकरण के लिए महत्वपूर्ण है ।
ए rhizogenes बालों वाली जड़ उत्पादन में तब्दील सबसे तेज और कुशल वैकल्पिक तरीकों में से एक है पी.में मिश्रित पौधों उत्पंन । इन समग्र पौधों ट्रांसजेनिक बीज का उत्पादन नहीं कर सकते, लेकिन कुछ ही दिनों के भीतर ट्रांसजेनिक जड़ों का उत्पादन कर सकता । इस प्रोटोकॉल में, अंय तरीकों29के विपरीत, बंद ट्यूब लगातार उच्च आर्द्रता बनाए रखने के लिए बालों की जड़ों को बढ़ावा देने के तेजी से 10 दिनों डीपीआई ।
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
यह काम आंशिक रूप से Dirección जनरल डी Asuntos डेल पर्सनल Académico, DGAPA/PAPIIT-उणां (अनुदान सं द्वारा समर्थित किया गया था । एम. एल. और IA205117 को एम-के IN219916 । क) तथा द Consejo Nacional डे Ciencia y Tecnològia (CONACYT अनुदान सं. २४०६१४ ते एमएल).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primers for qRT-PCR assay | |||
| pNIN Forward | CACC ATA GCT CCC CAA AAT GGT AT | ||
| pNIN Reverse | CAT CTT CCT TCC ACT AAC TAA C | ||
| M13 Forward | GTA AAA CGA CGG CCA G | ||
| M13 Reverse | CAG GAA ACA GCT ATG AC | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| pENTR/D-TOPO Cloning Kit | Invitrogen | K243520 | |
| Gateway LR Clonase II Enzyme Mix | Invitrogen | 11791100 | |
| pBGWFS7.0 | Plant systems biology | https://gateway.psb.ugent.be/vector/show/pBGWFS7/search/index/ | |
| Platinum Taq DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific | 10966018 | |
| DNeasy Plant Mini Kit | Qiagen | 69104 | |
| PureLink Quick Gel Extraction Kit | ThermoFisher Scientific | K210012 | |
| Platinum Pfx DNA Polymerase | Invitrogen | 11708013 | |
| Certified Molecular Biology Agarose | Bio-Rad | 1613102 | |
| One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli | Invitrogen | C404006 | |
| Nacl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Tryptone | Sigma-Aldrich | T7293-250G | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1625-250G | |
| Bacteriological agar | Sigma-Aldrich | A5306-1KG | |
| Kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | 60615-25G | |
| Spectinomycin sulfate | Sigma-Aldrich | PHR1441 | |
| Ethyl alcohol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Bacteriological peptone | Sigma-Aldrich | P0556 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Nalidixic acid | Sigma-Aldrich | N8878 | |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Gel loading solution | Sigma-Aldrich | G7654 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EQUIPMENT | |||
| Thermocycler | Veriti Thermal Cycler | 4375786 | |
| Centrifuge | Sigma | Sigma 1-14K | |
| Gel documentation unit | Carestream | Gel Logic 212 PRO | |
| MaxQ SHKE6000 6000 Shaking Incubator - 115VAC | Thermo scientific | EW-51708-70 | |
| Plant growth chamber | MRC | PGI-550RH | |
| Horizantal laminarair flow cabinate | Lumistell | LH-120 | |
| Fluorescent microscope | Leica | DM4500 B | |
| Petridish | sym laboratorios | 90X15 | |
| Scalpel Blade | Fisher scientific | 53223 | |
| Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher scientific | 14-959-53A | |
| 22 mL glass tubes | Thomas scientific | 45048-16150 |
References
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