Summary
Arrangören uttryck analyser är avgörande för att förbättra förståelsen av genreglering och spatiotemporal uttrycket av målgener. Här presenterar vi ett protokoll för att identifiera, isolera och klona en växt promotor. Vidare beskriver vi karakterisering av den knöl-specifika promotorn i gemensamma bean hårig rötterna.
Abstract
Uppströms sekvenser av gen kodande sekvenser kallas som arrangören sekvenser. Studera de uttrycksmönster av initiativtagare är mycket betydande i förståelsen av genreglering och spatiotemporal uttrycksmönster av målgener. Däremot, är det också avgörande för att fastställa verktyg för utvärdering av promotorn och genetisk transformation tekniker som är snabb, effektiv och reproducerbara. I denna studie undersökte vi spatiotemporal uttrycksmönstret av rhizobial symbios-specifika knöl starten (NIN) arrangören av Phaseolus vulgaris i transgena hårig rötterna. Använda växten arvsmassa databaser och analysverktyg som vi identifierat, isolerat och klonade P. vulgaris NIN arrangören i en transkriptionell fusion till chimära reporter β-glukuronidas (GUS) GUS-enhanced::GFP. Ytterligare, det här protokollet beskriver ett snabba och mångsidiga system för genetisk transformation i P. vulgaris med hjälp av Agrobacterium rhizogenes inducerad håriga rötter. Detta system genererar ≥2 cm håriga rötter på 10 till 12 dagar efter transformation. Nästa, vi bedömde spatiotemporal uttrycket av NIN arrangören i Rhizobium inokuleras håriga rötter med regelbundna mellanrum av efter inympningen. Våra resultat som skildras av GUS aktivitet visar att promotorn NIN var aktiva under processen av nodulationen. Tillsammans, visar detta protokoll hur till identifiera, isolera, klona och karakterisera en växt promotor i gemensamma bean hårig rötterna. Detta protokoll är dessutom lätt att använda i icke-specialiserade laboratorier.
Introduction
Initiativtagare är viktiga molekylär biologiska verktyg som spelar en avgörande roll i förståelsen regleringen av uttrycket av gener av intresse. Initiativtagare är DNA-sekvenser som ligger uppströms av översättningen inledandet kodon av genen sekvenser och de bär den centrala föreskrifter av gener; sin rätt anteckning och karakterisering är därför avgörande för att förstå geners funktion. Beroende på uttrycket mönstren klassificeras anläggningen initiativtagare som konstituerande, vävnadsspecifika, eller utveckling-scenen-specifika och inducerbara1. Framsteg inom transcriptomic teknik, förbättringar i datormodellering och tillgängligheten av ökande antal genomet sekvenser för olika växtarter har underlättat storskaliga förutsägelse av promotorn sekvenser2.
Däremot, är det också avgörande för att fastställa verktyg för utvärdering av promotorn och genetisk transformation tekniker som är snabb, effektiv och reproducerbara. Till skillnad från de andra plantorna för modell hindras funktionell karakterisering av gemensamma bean baljväxter (P. vulgaris) gener främst på grund av hur motsträviga Phaseolus sp. för stabil genetisk transformation. Övergående omvandling system fungera som ett alternativ för snabb gen funktionell karakterisering studier3. I baljväxter symbios forskning är samspelet mellan baljväxter värdväxt och rhizobial bakterien en av de mest lätthanterlig modellsystem för den funktionella analysen av knöl-specifika gener och arrangören studier. Hittills har flera baljväxter initiativtagare relaterade till dessa Symbiosar har varit kännetecknas, nämligen, Medicago truncatula PT44, SWEET115, Lotus japonicus Cyclops, UBQ6, VAG17, Glycine max PT5 8, Exo70J9, P. vulgaris RbohB10,11,12, TRE113, PI3K14, TOR15, etc. CIS element direkt påverka genreglering. Transkriptionsfaktor ENBP1A binder till en Cis regulatoriska region (−692 bp) i tidig nodulin VfENOD12, och detta underlättar uttrycket av en reporter gen i knöl primordia Vicia faba16. Byte av Cis regulatoriska regioner (−161 till −48 bp) av den knöl-specifika promotorn leghemoglobin GLB3 med den heterologa trunkeras initiativtagare δ-p35S och δ-pNOS, resulterade i en förlust av knöl specificitet och reducerad arrangören aktivitet17 .
Tidigare rapporter visar att den transkriptionsfaktor NIN krävs för inledande av rhizobial infektion i roten hårcellerna och är också viktigt för knöl organogenes hos L. japonicus18. I föreliggande studie beskriver vi ett protokoll för identifiering, isolering, kloning och karakterisering av knöl-specifika promotorn i gemensamma bean hårig rötterna. För att uppnå detta, vi valde en rhizobial symbios-specifika NIN promotorn av P. vulgaris och klonade i en transkriptionell fusion till chimära reporter GUS-enhanced::GFP. Ytterligare, det här protokollet beskriver ett snabba och mångsidiga system för genetisk transformation i P. vulgaris med A. rhizogenes inducerad håriga rötter. Detta system genererar håriga rötter i mindre än 2 veckor efter transformation. Slutligen bedömde vi spatiotemporal uttrycket av NIN arrangören i kväveformer koloniserade rot knölar av GUS färgning.
Proceduren som beskrivs här kan vara användbart för studien av nodulationen och mycorrhization11 av baljväxter växter, men också för studier av promotorn uttrycksmönster i rötter19. Detta protokoll är dessutom lätt att använda i icke-specialiserade laboratorier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. identifiering, isolering och kloning av P. Vulgaris NIN arrangören
- Identifiera sekvensen promotorn för gen av intresse. Det finns flera arvsmassa databaser och analysverktyg för växter såsom Phytozome, häckning växter, NCBI, etc. A baljväxter arrangören P. vulgaris NIN (PvNIN; Phvul.009G115800) användes i denna studie20.
- Design oligos antingen för Gateway eller traditionella restriktionsenzym kloning beroende på vector systemet används (figur 1A).
Obs: Standard (25-35 bp), desalted primers fungerar bra. Omvänd oligo-sekvenser som flankerar mellan arrangören och genen är tillrådligt. - Förstärka PvNIN promotor regionen (eller arrangören regionen av genen av intresse) från färska isolerade P. vulgaris genomiskt DNA med arrangören-specifika oligo uppsättningen. Använda en HiFi-polymeras med följande PCR villkor: 95 ° C i 5 min; 30 cykler (95 ° C i 30 s, 55 ° C för 30 s, 72 ° C i 1 min); och 72 ° C i 5 min.
- Kör det förstärkta fragmentet på 1% agarosgel på 60 V på en 7 x 10 cm gel bricka och eluera motsvarande ospädd (700 bp, figur 1B) och klon i pENTR/D-TOPO vektorn enligt tillverkarens anvisningar.
- Omvandla 2 µL av reaktionen till behöriga Escherichia coli celler med tillverkarens instruktioner och tallrik 150 µL av omvandling blandningen på lysogeny bror (LB) kompletteras med 50 mg/L kanamycin (Kan50). Växa de guldpläterade cellerna vid 37 ° C under natten.
- Plocka 3-6 kolonier och kultur dem över natten i LB medium som innehåller Kan50. Isolera plasmid DNA använder metoden för val och analysera plasmiden med PCR använder den vektor specifika M13 oligos. För PCR, användning 100 ng av plasmid, 0.3 pm av oligos, 10 X PCR buffer, 0.5 U Taq-DNA-polymeras och 10 mM dNTP.
- Använd följande PCR-amplifiering villkor; 95 ° C i 3 min. 30 cykler (95 ° C i 30 s, 58 ° C i 30 s, 72 ° C för 75 s); och 72 ° C under 7 min. visualisera PCR-produkter på en 1% agarosgel. Säkerställa att rätt infogningar har ett band på 1.024 bp och vektorer utan skär vilja ha ett 324 bp band (figur 1 c).
- Utföra LR reaktionen mellan en intrade vektor (pENTR/D-TOPO-PvNIN) och destination vektor pBGWFS7.021 använda en kommersiell enzym blandning enligt tillverkarens anvisningar.
- Omvandla 2 µL av LR reaktion till behöriga E. coli celler med standardtekniker som beskrivs i tillverkarens instruktioner och tallrik 150 µL av omvandling blandning på LB kompletteras med 100 mg/L av Spektinomycin (Spe100). Växa de guldpläterade cellerna vid 37 ° C under natten.
- Plocka ca 5 kolonier och kultur dem över natten i LB medium som innehåller Spe100. Isolera plasmiden DNA med hjälp av en metod för val och analysera plasmiden med PCR använder den arrangören-specifika oligos.
- Använda PCR villkoren i steg 1.3. Visualisera de PCR-produkterna på en 1% agarosgel att bekräfta förstärkning. Amplikoner är 700 bp.
- Sekvens av positiva plasmiden pBGWFS7.0/PvNIN::GUS-GFP (figur 1 d) med den arrangören-specifika oligos att kontrollera äktheten av skäret.
- Omvandla plasmidsna till A. rhizogenes stam K599 (dock några andra stammar av A. rhizogenes kan användas). Tillsätt 2 µL plasmid prep i 50 µL av electrocompetent celler och electroporate i en 1 mm kyvetten med följande inställningar: 1,8 kV, 25 µF och 200 Ω.
- Återställa celler i ~ 500 µL av SOC medium och skaka vid 28 ° C under 2 h. plattan på LB-Spe100 och växa vid 28 ° C i 2 dagar.
- Utföra kolonin screening som nämns i steg 1,7 och använda på PCR-villkor som steg 1.3. Gör glycerol bestånd från positiva kloner och lagra dem i-80 ° C.
- Använd A. rhizogenes kultur härbärgerat tom pBGWFS7.0 vektor som negativ kontroll.
2. A. Rhizogenes omvandlas håriga rötter av den gemensamma Bean
- Sterilisera (P. vulgaris cv. Negro Jamapa) frön (ca 20) i 50 mL 96% etanol för 1 min och släng etanol; Tillsätt därefter 50 mL 20% blekmedel (natriumhypoklorit) i 10 min, med konstant blandning i en LAF. Ta bort blekmedel och tvätta i överskott sterilt vatten 3 gånger.
Obs: Andra P. vulgaris sorter kan användas för hårig rot induktion. - Gror steriliserade frön på sterila filter papper fuktat med Broughton & Dilworth (B & D) lösning22 (tabell 1) för 2 dagar i mörker vid 28 ° C.
- Dagen innan omvandling förbereda följande:
- Strimma ut 150 µL av A. rhizogenes kultur härbärgerat binära vektorn (förberedd i steg 1.13 och 1,14) på solid LB Spe100 och växa vid 28 ° C över natten.
- Fyll en 15 mL tub med B & D lösning och ersätt skruvlocket med dubbla lager aluminiumfolie. Montera detta i en 22 cm glasrör innehållande 10 mL B & D lösning (figur 2 c) och autoklavera det.
- På dagen för omvandling, montera följande sterila material i en LAF: grodda frön från steg 2.2, kultur plattan från steg 2.3.1, rör från steg 2.3.2, sterila dubbel destillerat vatten (10 mL), pipetter och pipettspetsar, steril pincett, och 3 mL sprutor.
- Använda en böjd 200 µL spets att skrapa A. rhizogenes celler från plattan i en mikrocentrifug rör och återsuspendera i 1 mL av det dubbla sterilt vattnet. På samma sätt förbereda vector kontroll celler separat.
- Blanda försiktigt för att resuspendera cellerna. Gör inte vortex.
- Gör ett 3 mm hål på aluminiumfolie av rören från steg 2.3.2 med hjälp av en steril pipettspetsen.
- Samla cellerna (antingen arrangören eller vektor kontroll) från steg 2.5 med sprutan och något sticka hypocotyls av grodda frön med nålspetsen (figur 2 g).
Obs: Kontrollera nålen penetrerar (4 - 6 gånger) kärlvävnad och injicera små (~ 5 µL) droppar såret vid olika lägen runt hypocotyl celler. - Försiktigt in rötterna av injicerade plantorna i 3 mm hål för 15 mL-röret som innehåller B & D lösning. Tillbaka hela installationen in i de 22 mL glasrör och täta dem för att behålla fuktigheten.
- Inkubera rören i en tillväxt kammare upprätthålls vid 28 ° C med 16 h ljus: 8 h mörka fotoperiod.
Anteckningar: 3-4 dagar efter inkubation, växterna växer upp till kanten av de 22 mL glasrör.
Obs: Det är viktigt att upprätthålla B & D lösning hela tiden i både plast och glas rör.
3. Arrangören analys: NIN arrangören uttryck i Rhizobial knölar av gemensamma bönan
- För induktion av roten knölar, Inokulera Rhizobium tropici eller Rhizobium etli (som är kompatibel till den gemensamma bean) i 100 mL PY medium (0,5 g pepton, 0,3 g jästextrakt) kompletteras med 700 mM CaCl2 och 20 mg mL−1 nalidixic syra. Inkubera vid 30 ° C under 24 h med skakningar vid 300 rpm.
Obs: Några specifika antibiotika skulle kunna användas vid transgena Rhizobium. - Pellet cellerna i en centrifug för 3 min vid 2 800 x g i rumstemperatur och blandas i 10 mL 10 mM MgSO4. Justera OD av celler till 0,6 på OD600 genom utspädning med 10 mM MgSO4.
- Inokulera 1-2 mL av kulturen (beredd från steg 3,2) per planta (både arrangören och vector kontroll) inducera knöl tillväxt på håriga rötter. Vattna växterna med B & D lösning med begränsad kväve (2 mM KNO3) att främja nodulationen.
- Beroende på behovet av experimentell, samla hårig rötterna vid olika tidpunkter. Samla in prover för att studera infektion trådar mellan 3-5 dagar efter inympningen (dpi).
Obs: Primordial knöl och unga knölar kan studeras på 6-9 dpi och 10-12 dagar dpi, respektive. Slutligen, mogen och funktionella noduli kan studeras på 14-21 dpi och senesced knölar på > 28 dpi. - Bearbeta de rot/knölar för aktiviteten av reporter gener (GUS eller GFP). Analysera GUS aktivitet enligt protokollet beskrivs av Jefferson23. Iaktta god Jordbrukarsed i fluorescens Mikroskop. Excitera GFP fluorescens med blå argon ion laser (488 nm), och de utsända fluorescensen från 510 till 540 nm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Syftet med denna studie var att bedöma det spatiotemporal uttryck pattern knöl-specifika P. vulgaris NIN. Detta gör en 700 bp region uppströms i den översättning inledande Codonen av NIN gen valdes och en uppsättning oligos ritades som avbildas i figur 1A. Med en HiFi-polymeras, NIN arrangören fragmentet förstärktes, isolerade (figur 1B) och klonade in den destination binära vektor pBGWFS7.0 (figur 1 c) via en Gateway-metod för att generera en transkriptionell fusion till den chimära reporter GUS-förbättrade GFP (pBGWFS7.0/PvNIN::GUS-GFP). Den pBGWFS7.0/PvNIN::GUS-GFP vektor konstruktionen genererar vanligtvis hundratals oberoende kloner. Kolonin screening med PCR med gen-specifika oligos identifierar enkelt de rätta klonerna (figur 2D). PCR-positiva plasmiden var Sanger sekvenseras med den arrangören-specifika oligos för att kontrollera äktheten av skäret.
Att upprätthålla hög luftfuktighet hela experimentet är nödvändigt för induktion av förhårdnader och håriga rötter. På platsen för sårade, calli vanligtvis observeras vid 5 till 7 dagar (figur 2J) och ≥ 2 cm håriga rötter observeras vid 10 till 12 dagar efter transformation. Majoriteten av A. rhizogenes förvandlas växter framgångsrikt att producera håriga rötter genom 2 veckor (figur 2 K). Men kan antalet och längden av håriga rötter vara variabel. Därför välja de kraftigt växande rötterna för analys och ytterligare experiment. Punktskatt primära roten genom att klippa stammen 2 cm nedanför de håriga rötterna och transplantera dem i krukor som innehåller steril vermikulit (figur 2 L) eller i en hydroponics system.
För att studera det spatiotemporal uttrycket för den knöl-specifika NIN promotorn, håriga rötter var inokuleras med R. tropicioch GUS aktivitet observerades vid regelbundna intervall efter inympningen beroende på behovet av experimentell. Inympning med R. tropici induceras ett starkt GUS uttryck i transgena rötterna, som anger att kväveformer inducerar uttrycket NIN i den gemensamma bean (figur 3A). Ytterligare, provtagning på 6-9 dpi visade GUS uttryck i Rhizobium infekterade root hårcellerna (figur 3B). Phaseolus knöl primordium, och ung och mogen knutor också visat NIN uttryck (figur 3 c). I alla skeden av nodulationen sågs ingen sådan GUS uttryck i vector kontroll rötterna (figur 3D, 3E, 3F).
Figur 1 : Disposition av P. vulgaris NIN genstruktur och kloning. (A) A Schematisk bild av NIN genstruktur visar 5' UTR (grön), 4 exoner, 3 introner och 3' UTR (röd) på kromosom antal 9 P. vulgaris. Uppströms till den NIN översättning inledande Codonen ATG, visar en promotor regionen på vilka oligos utformades. FO, framåt oligo; RO, omvänd oligo; ATG, start kodon; TAA, stop kodon. (B) PvNIN promotor regionen förstärktes från färska isolerade P. vulgaris genomiskt DNA med arrangören-specifika oligo uppsättningen. M, 1 Kb stege; 1, PCR-reaktion med gDNA visar kopiestorlek 700 bp; 2, PCR-reaktionen utan gDNA (-ve kontroll). (C) Screening av plasmidsna pENTR/D-TOPO-PvNIN med PCR använder den vektor specifika M13 oligos. Rätt infogningar har ett band på 1.024 bp (lane 3-6) och vektorer utan skär kommer att ha ett 324 bp-band (lane 1 - 2). (D) arrangören uttryck binära vektor karta används i den aktuella studien, pBGWFS7.0 vector visar PvNIN arrangören i fusion med GUS och god Jordbrukarsed. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: A. rhizogenes omvandlas håriga rötter av den gemensamma bean. (A) den steriliserade frön av P. vulgaris cv. Negro Jamapa spira på sterila filterpapper. (B) frön, avlägnat. (C) Tube setup för hårig rot induktion. (D) skrapa ut A. rhizogenes kultur (pNIN & kontroll). (E) A. rhizogenes kultur resuspended i sterilt destillerat vatten. (F, G) Injicera bakterieceller i hypocotyles. (H) Tube setup med Phaseolus plantor injiceras med bakterieceller. (Jag, J) Calli bildas på sårade webbplats 5-7 dpi. (K) håriga rötter 15 dpi (L) excising tap rötterna 2 cm nedanför platsen för hårig rot induktion. (M) sammansatta plantor transplanteras in i sterila vermikulit inokuleras med R. tropici. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Arrangören analys av P. vulgaris NIN i transgena P. vulgaris rötter. Rumsliga och tidsmässiga mönster av NIN uttryck avslöjades av en promoterNIN::GUS-GFP construct i transgena håriga rötter inkuberas med GUS som substrat. Optiska mikroskopbilder av PvNIN: GUS: (A) rötter inokuleras med R. tropici, (B) GUS uttryck i böjda rothår och (C) unga knölar. Bilder av kontroll (tom vektor) visar ingen sådan GUS uttryck i (D) rötter inokuleras med R. tropici, böjt (E) rothår, och (F) unga knölar. RH, roten hår. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Under funktionell analys av gener spelar studiet av genen uttrycksmönster en avgörande roll i att förstå rumsliga och tidsmässiga regleringen av gener i vivo. En välkänd metod för att studera gen uttrycksmönster är att klona gen promotor regionen av intresse, uppströms till reporter gener som fluorescerande markörgener (GFP, RFP, etc.) eller β-glukuronidas. Häri, har vi valt en promotor regionen av roten knöl symbios (RNS) specifika genen, NIN, att studera plats och tid uttrycksmönster i P. vulgaris under RNS. Sekvensen valda Arrangören har blivit klonad uppströms GFP::GUS reportrar med metoden Gateway i en arrangören uttryck vektor.
Vi har beskrivit uttrycket av den symbios specifika promotor i hårig rotsystem av P. vulgaris. Hårig rotsystemet har använts för funktionell karakterisering av gener, inklusive RNAi medierad gen knock-down, ektopisk konstitutiva uttryck av gener, promotorn uttryck och protein lokalisering i motsträviga grödor. De främsta fördelarna med systemet är att det är lätt, reproducerbara, pålitlig, och samtidigt inte arbete intensivt. Hårig rotsystemet har antagits framgångsrikt i andra gröda baljväxter såsom G. max24, M. truncatula25, L. japonicus26,27, tomat28, etc., med ändringarna som behövs. Ytterligare, verktyget kan antas i andra baljväxter och icke-baljväxter arter när optimerad för den passande A. rhizogenes stam, metod för inympning och tillväxt villkorar.
Det finns många kritiska parametrar. När du väljer regionen promotorn, bör försiktighet iakttas att utforma den oligos som skulle förstärka de nödvändiga arrangören element, börjar från regionen uppströms i den översättning start sitein proteinet kodande gener; Arrangören analys bör genomföras med hjälp av tillgängliga programvaran att samla in information på de transkriptionsfaktorer som bindande till föreskrivande regionen. Ta omsorgstunder inducerande håriga rötter: injicera plantor i ett lämpligt stadium; under injektion, se till att nålen inte passerar genom hypocotyle; och upprätthålla hög fuktiga förhållanden. Ytterligare, medan du studerar arrangören uttrycket profiler i håriga rötter, håriga rötter producerad av A. rhizogenes alltid omvandlas inte, och därför är det viktigt att bekräfta transformerad natur av rötterna med GFP eller GUS reportrar före utför arrangören uttryck studier. Lämpliga stammar av Rhizobium bör väljas och koncentrationerna av Rhizobium bör justeras som anges i protokollet. Provtagning på lämpliga stadier är post inympning avgörande för att dokumentera plats och tid uttryck för arrangören i olika skeden av RNS.
A. rhizogenes omvandlas hårig rot produktion är en av de snabbaste och effektiva alternativa metoderna att generera sammansatta växter i P. vulgaris. Dessa sammansatta växter inte kan producera transgena frön, men kan producera transgena rötter inom några dagar. I detta protokoll, till skillnad från andra metoder29, upprätthålla slutna rören konstant hög luftfuktighet för att främja håriga rötter snabbare på 10 dagar dpi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete var delvis stöds av Dirección General de Asuntos del personliga Académico, DGAPA/PAPIIT-UNAM (bevilja nr. IN219916 till M.L och IA205117 till M-K. (A) och Consejo Nacional de Ciencia y Tecnològia (CONACYT grant nr 240614 att M.L.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primers for qRT-PCR assay | |||
| pNIN Forward | CACC ATA GCT CCC CAA AAT GGT AT | ||
| pNIN Reverse | CAT CTT CCT TCC ACT AAC TAA C | ||
| M13 Forward | GTA AAA CGA CGG CCA G | ||
| M13 Reverse | CAG GAA ACA GCT ATG AC | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| pENTR/D-TOPO Cloning Kit | Invitrogen | K243520 | |
| Gateway LR Clonase II Enzyme Mix | Invitrogen | 11791100 | |
| pBGWFS7.0 | Plant systems biology | https://gateway.psb.ugent.be/vector/show/pBGWFS7/search/index/ | |
| Platinum Taq DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific | 10966018 | |
| DNeasy Plant Mini Kit | Qiagen | 69104 | |
| PureLink Quick Gel Extraction Kit | ThermoFisher Scientific | K210012 | |
| Platinum Pfx DNA Polymerase | Invitrogen | 11708013 | |
| Certified Molecular Biology Agarose | Bio-Rad | 1613102 | |
| One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli | Invitrogen | C404006 | |
| Nacl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Tryptone | Sigma-Aldrich | T7293-250G | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1625-250G | |
| Bacteriological agar | Sigma-Aldrich | A5306-1KG | |
| Kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | 60615-25G | |
| Spectinomycin sulfate | Sigma-Aldrich | PHR1441 | |
| Ethyl alcohol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Bacteriological peptone | Sigma-Aldrich | P0556 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Nalidixic acid | Sigma-Aldrich | N8878 | |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Gel loading solution | Sigma-Aldrich | G7654 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EQUIPMENT | |||
| Thermocycler | Veriti Thermal Cycler | 4375786 | |
| Centrifuge | Sigma | Sigma 1-14K | |
| Gel documentation unit | Carestream | Gel Logic 212 PRO | |
| MaxQ SHKE6000 6000 Shaking Incubator - 115VAC | Thermo scientific | EW-51708-70 | |
| Plant growth chamber | MRC | PGI-550RH | |
| Horizantal laminarair flow cabinate | Lumistell | LH-120 | |
| Fluorescent microscope | Leica | DM4500 B | |
| Petridish | sym laboratorios | 90X15 | |
| Scalpel Blade | Fisher scientific | 53223 | |
| Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher scientific | 14-959-53A | |
| 22 mL glass tubes | Thomas scientific | 45048-16150 |
References
- Hernández-Garcia, C. M., Finer, J. J. Identification and validation of promoters and cis-actingregulatory elements. Plant Science. 217-218, 109-119 (2014).
- Dhanapal, A. P., Govindaraj, M. Unlimited Thirst for Genome Sequencing, Data Interpretation, and Database Usage in Genomic Era: The Road towards Fast-Track Crop Plant Improvement. Genetics Research International. , 684321 (2015).
- Nanjareddy, N., Arthikala, M. K., Blanco, L., Arellano, E. S., Lara, M. Protoplast isolation, transient transformation of leaf mesophyll protoplasts and improved Agrobacterium-mediated leaf disc infiltration of Phaseolus vulgaris: Tools for rapid gene expression analysis. BMC Biotechnol. 16 (1), 53 (2016).
- Pumplin, N., Zhang, X., Noar, R. D., Harrison, M. J. Polar localization of a symbiosis-specific phosphate transporter is mediated by a transient reorientation of secretion. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (11), E665-E672 (2012).
- Kryvoruchko, I. S., et al. MtSWEET11, a Nodule-Specific Sucrose Transporter of Medicago truncatula. Plant Physiol. 171 (1), 554-565 (2016).
- Suzaki, T., Yano, K., Ito, M., Umehara, Y., Suganuma, N., Kawaguchi, M. Positive and negative regulation of cortical cell division during root nodule development in Lotus japonicus is accompanied by auxin response. Development. 139 (21), 3997-4006 (2012).
- Suzaki, T., et al. Endoreduplication-mediated initiation of symbiotic organ development in Lotus japonicus. Development. 141 (12), 2441-2445 (2014).
- Qin, L., et al. The high-affinity phosphate transporter GmPT5 regulates phosphate transport to nodules and nodulation in soybean. Plant Physiol. 159 (4), 1634-1643 (2012).
- Wang, Z., Panfeng, L., Yan, Y., Chi, Y., Fan, B., Chen, Z. Expression and Functional Analysis of a Novel Group of Legume-specific WRKY and Exo70 Protein Variants from Soybean. Sci Rep. 6, 32090 (2016).
- Montiel, J., et al. A Phaseolus vulgaris NADPH oxidase gene is required for root infection by Rhizobia. Plant Cell Physiol. 53 (10), 1751-1767 (2012).
- Arthikala, M. K., et al. PvRbohB negatively regulates Rhizophagus irregularis colonization in Phaseolus vulgaris. Plant Cell Physiol. 54 (8), 1391-1402 (2013).
- Arthikala, M. K., Sánchez-López, R., Nava, N., Santana, O., Cárdenas, L., Quinto, C. RbohB a Phaseolus vulgaris NADPH oxidase gene, enhances symbiosome number, bacteroid size, and nitrogen fixation in nodules and impairs mycorrhizal colonization. New Phytol. 202 (3), 886-900 (2014).
- Barraza, A., et al. Down-regulation of PvTRE1 enhances nodule biomass and bacteroid number in the common bean. New Phytol. 197 (1), 194-206 (2013).
- Estrada-Navarrete, G., et al. An autophagy-related kinase is essential for the symbiotic relationship between Phaseolus vulgaris and both rhizobia and arbuscular mycorrhizal fungi. Plant Cell. 28 (9), 2326-2341 (2016).
- Nanjareddy, K., et al. A Legume TOR Protein Kinase Regulates Rhizobium Symbiosis and Is Essential for Infection and Nodule Development. Plant Physiol. 172 (3), 2002-2020 (2016).
- Frühling, M., Schröder, G., Hohnjec, N., Pühler, A., Perlick, A. M., Küster, H. The promoter of the Vicia faba L. gene VfEnod12 encoding an early nodulin is active in cortical cells and nodule primordia of transgenic hairy roots of Vicia hirsuta as well as in the prefixing zone II of mature transgenic V. hirsuta root nodules. Plant Science. 160 (1), 67-75 (2000).
- Szabados, L., Ratet, P., Grunenberg, B., de Bruijn, F. J. Functional analysis of the Sesbania rostrata leghemoglobin glb3 gene 5'-upstream region in transgenic Lotus corniculatus and Nicotiana tabacum plants. Plant Cell Online. 2 (10), 973-986 (1990).
- Madsen, L. H., Tirichine, L., Jurkiewicz, A., Sullivan, J. T., Heckmann, A. B., Bek, A. S., Ronson, C. W., James, E. K., Stougaard, J. The molecular network governing nodule organogenesis and infection in the model legume Lotus japonicus. Nat Commun. 12, 1-10 (2010).
- Montiel, J., Arthikala, M. K., Quinto, C. Phaseolus vulgaris RbohB functions in lateral root development. Plant Signal Behav. 8 (1), 1-3 (2013).
- Nanjareddy, K., Arthikala, M. K., Gómez, B. M., Blanco, L., Lara, M. Differentially expressed genes in mycorrhized and nodulated roots of common bean are associated with defense, cell wall architecture, N metabolism, and P metabolism. PLoS ONE. 12 (8), e0182328 (2017).
- Karimi, M., Inzé, D., Depicker, A. Gateway vectors for Agrobacterium-mediated plant transformation. Trends Plant Sci. 7 (5), 193-195 (2002).
- Broughton, W. J., Dilworth, M. J.
- Jefferson, R. A. Assaying chimeric genes in plants, the GUS gene fusion system. Plant Mol Biol Rep. 5 (4), 387-405 (1987).
- Cho, H. J., Farrand, S. K., Noel, G. R., Widholm, J. M. High-efficiency induction of soybean hairy roots and propagation of the soybean cyst nematode. Planta. 210 (2), 195-204 (2000).
- Deng, Y., Mao, G., Stutz, W., Yu, O. Generation of Composite Plants in Medicago truncatula used for Nodulation Assays. J. Vis. Exp. (49), e2633 (2011).
- Kumagai, H., Kouchi, H. Gene silencing by expression of hairpin RNA in Lotus japonicus roots and root nodules. Mol Plant Microbe Interact. 16 (8), 663-668 (2003).
- Okamoto, S., Yoro, E., Suzaki, T., Kawaguchi, M. Hairy Root Transformation in Lotus japonicus. Bio-protocol. 3 (12), e795 (2013).
- Jacobs, T. B., Martin, G. B. High-throughput CRISPR Vector Construction and Characterization of DNA Modifications by Generation of Tomato Hairy Roots. J. Vis. Exp. (110), e53843 (2016).
- Estrada-Navarrete, G., et al. Agrobacterium rhizogenes-transformation of the Phaseolus spp.: a tool for functional genomics. Mol Plant Microbe Interact. 19 (12), 1385-1393 (2006).
