Summary
Promotor udtryk analyser er afgørende for at forbedre forståelsen af genregulering og spatiotemporelle udtryk for target gener. Heri præsenterer vi en protokol for at identificere, isolere og klone en plante promotor. Yderligere, at vi beskrive karakterisering af knude-specifikke promotor i de fælles bean behårede rødder.
Abstract
Opstrøms sekvenser af genet kodende sekvenser er betegnes som promotor sekvenser. At studere udtryk mønstre af initiativtagere er meget vigtige i forståelsen af genregulering og spatiotemporelle udtryk mønstre af target gener. På den anden side er det også afgørende at etablere promotor evalueringsværktøjer og genetiske transformation teknikken, der er hurtige, effektive og reproducerbare. I denne undersøgelse undersøgte vi spatiotemporelle udtryk mønster af rhizobial symbiose-specifikke knude inception (NIN) fredsskaber Phaseolus vulgaris i de transgene behårede rødder. Ved hjælp af planten genom databaser og analyseværktøjer vi identificeret, isoleret og klonet P. vulgaris NIN promotor i en transcriptional fusion til de kimære reporter β-glucuronidasesystemer (GUS) GUS-enhanced::GFP. Yderligere, denne protokol beskriver en hurtige og alsidige system af genetiske transformation i P. vulgaris brug af Agrobacterium rhizogenes induceret behårede rødder. Dette system genererer ≥2 cm behårede rødder på 10 til 12 dage efter transformation. Næste, vi vurderet de spatiotemporelle udtryk for NIN promotor i Rhizobium podes behårede rødder med periodiske mellemrum af efter podning. Vores resultater skildret af GUS aktivitet viser, at NIN initiativtageren var aktive i løbet af processen af nodulation. Sammen, demonstrerer denne protokol hvordan man kan identificere, isolere, klon og karakterisere en plante promotor i de fælles bean behårede rødder. Desuden, denne protokol er nem at bruge i ikke-specialiserede laboratorier.
Introduction
Initiativtagerne er vigtigt Molekylær biologiske funktioner, som spiller en afgørende rolle i at forstå reguleringen af udtrykket af gener af interesse. Initiativtagerne er DNA-sekvenser beliggende opstrøms oversættelse indledningen codon af genet sekvenser og de bære de centrale lovgivningsmæssige oplysninger af gener; Derfor, deres korrekte annotation og karakterisering er afgørende for at forstå genfunktion. Afhængigt af udtryk mønstrene, er plante initiativtagere klassificeret som konstituerende, væv-specifik, eller udvikling-fase-specifikke og inducerbar1. Fremskridt i transkriptom teknologier, forbedringer i computer-modellering og tilgængeligheden af stigende antal genom sekvenser for forskellige plantearter har lettet den storstilede forudsigelse af promotor sekvenser2.
På den anden side er det også afgørende at etablere promotor evalueringsværktøjer og genetiske transformation teknikken, der er hurtige, effektive og reproducerbare. I modsætning til de andre model planter vanskeliggøres den funktionelle karakterisering af fælles bean bælgplanter (P. vulgaris) gener hovedsagelig på grund af Phaseolus sp. for stabil genetiske transformation genstridige karakter. Forbigående transformation systemer fungere som et alternativ til hurtig gen funktionelle karakterisering undersøgelser3. I bælgplanter symbiose forskning er samspillet mellem bælgplanter vært plante og rhizobial bakterie en af de mest tractable modelsystemer for den funktionelle analyse af knude-specifikke gener og promotor undersøgelser. Så langt, flere bælgplanter initiativtagere relateret til disse symbioser er blevet karakteriseret, dvs, Medicago truncatula PT44, SWEET115, Lotus japonicus Cyclops, UBQ6, VAG17, Glycine max PT5 8, Exo70J9, P. vulgaris RbohB10,11,12, TRE113, PI3K14, TOR15, osv. CIS elementer direkte indflydelse genregulering. Transkriptionsfaktor ENBP1A binder sig til en SNG regulerende region (−692 bp) af tidlige nodulin VfENOD12, og dette letter udtryk af en reporter gen i knude primordia Vicia faba16. Udskiftning af Cis regulerede områder (−161 til −48 bp) af knude-specifikke promotor leghemoglobin GLB3 med den heterolog afkortet initiativtagere δ-p35S og δ-pNOS, resulterede i et tab af knude specificitet og reduceret promotor aktivitet17 .
Tidligere rapporter viser, at transkriptionsfaktor NIN er nødvendig for indledningen af rhizobial infektion i rod hårceller og er også afgørende for knude organogenesis i L. japonicus18. I den foreliggende undersøgelse beskriver vi en protokol for identifikation, isolation, kloning og karakterisering af knude-specifikke promotor i de fælles bean behårede rødder. For at opnå dette, vi valgt en rhizobial symbiose-specifikke NIN promotor af P. vulgaris og klonet i en transcriptional fusion til de kimære reporter GUS-enhanced::GFP. Yderligere, denne protokol beskriver en hurtige og alsidige system af genetiske transformation i P. vulgaris brug af A. rhizogenes induceret behårede rødder. Dette system genererer behårede rødder i mindre end 2 uger efter transformation. Endelig, vi vurderet de spatiotemporelle udtryk for NIN promotor i rhizobia koloniserede rodknolde af GUS farvning.
Proceduren beskrevet her kan være nyttigt ikke kun for studier af nodulation og mycorrhization11 af bælgplanter planter, men også for studiet af promotor udtryk mønstre i rødder19. Desuden, denne protokol er nem at bruge i ikke-specialiserede laboratorier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. identifikation, Isolation og kloning af S. Vulgaris NIN promotor
- Identificere promotor sekvensen for gen af interesse. Der er flere genom databaser og analyseværktøjer til rådighed for planter som Phytozome, Ensembl planter, NCBI, etc. A bælgplanter promotor P. vulgaris NIN (PvNIN; Phvul.009G115800) blev brugt i denne undersøgelse20.
- Design oligos enten for Gateway eller traditionelle begrænsning enzym kloning afhængigt af vektorsystem anvendes (figur 1A).
Bemærk: Standard (25-35 bp), skyllede primere fungerer fint. Omvendt oligo sekvenser, der flankerer mellem arrangøren og genet er tilrådeligt. - Forstærke PvNIN promotor region (eller promotor region af genet af interesse) fra frisk isolerede P. vulgaris genomisk DNA ved hjælp af promotor-specifikke oligo-sæt. Bruge et Hi-Fi-polymerase med følgende PCR betingelser: 95 ° C i 5 min; 30 cykler (95 ° C til 30 s, 55 ° C til 30 s, 72 ° C i 1 min); og mindst 72 ° C i 5 min.
- Kør den forstærkede fragment på 1%-agarosegel på 60 V på en 7 x 10 cm gel bakke, og elueres tilsvarende amplikonen (700 bp, figur 1B) og klon til pENTR/D-TOPO vektor ifølge producentens anvisninger.
- Omdanne 2 µL af reaktion i kompetente Escherichia coli celler ved hjælp af producentens anvisninger og plade 150 µL af transformation blandingen på lysogeny bror (LB) suppleret med 50 mg/L kanamycin (Kan50). Vokse forgyldt cellerne ved 37 ° C natten over.
- Pick 3-6 kolonier og kultur dem natten over i LB medium indeholdende Kan50. Isolere plasmid DNA ved hjælp af metoden til valg og analysere plasmid ved PCR ved hjælp af vektor specifikke M13 oligos. For PCR, brug 100 ng af plasmid, 0.3 pm af oligos, 10 X PCR buffer, 0,5 U Taq DNA polymerase og 10 mM dNTP'er.
- Brug følgende PCR forstærkning betingelser; 95 ° C i 3 min. 30 cykler (95 ° C til 30 s, 58 ° C til 30 s, 72 ° C i 75 s); og mindst 72 ° C i 7 min. visualisere PCR-produkter på en 1%-agarosegel. Sikre at de korrekte indsættelser har et band på 1.024 bp og vektorer uden indsatser vil have en 324 bp band (figur 1 c).
- Udføre LR reaktion mellem en post vektor (pENTR/D-TOPO-PvNIN) og destination vektor pBGWFS7.021 ved hjælp af en kommerciel enzym mix ifølge producentens anvisninger.
- Omdanne 2 µL af LR reaktion i kompetente E. coli celler ved hjælp af standard teknikker, som beskrives i producentens vejledning og plade 150 µL af transformation blanding på LB suppleret med 100 mg/L af spectinomycin (Spe100). Vokse forgyldt cellerne ved 37 ° C natten over.
- Pluk ca 5 kolonier og kultur dem natten over i LB medium indeholdende Spe100. Isolere plasmid DNA ved hjælp af en metode til valg og analysere plasmid ved PCR ved hjælp af promotor-specifikke oligos.
- Bruge PCR betingelser i trin 1.3. Visualisere PCR-produkter på en 1% agarosegel at bekræfte forstærkning. Amplikoner er 700 bp.
- Sekvens positive plasmidet pBGWFS7.0/PvNIN::GUS-NGL (fig. 1 d) med promotor-specifikke oligos at kontrollere ægtheden af indsatsen.
- Omdanne plasmider til A. rhizogenes stamme K599 (dog nogen andre stammer af A. rhizogenes kan blive brugt). Tilføj 2 µL plasmid prep til 50 µL electrocompetent celler og electroporate i en 1 mm kuvette med følgende indstillinger: 1,8 kV, 25 µF, og 200 Ω.
- Genskab celler i ~ 500 µL af SOC medium og ryste ved 28 ° C i 2 h. plade på LB-Spe100 og vokse ved 28 ° C i 2 dage.
- Udføre koloni screening som nævnt i trin 1.7 og bruge PCR betingelser som i trin 1.3. Gøre glycerol bestande fra positive kloner og gemme dem i-80 ° C.
- Bruge A. rhizogenes kultur husly Tom pBGWFS7.0 vektor som den negative kontrol.
2. A. Rhizogenes omdannet behårede rødder af fælles Bean
- Sterilisere (P. vulgaris cv. Negro Jamapa) frø (ca 20) i 50 mL 96% ethanol i 1 min og kassér ethanol; derefter tilsættes 50 mL 20% blegemiddel (natriumhypochlorit) i 10 min, med konstant blanding i en laminar flow hætte. Fjerne blegemiddel og vask i overskydende sterilt vand 3 gange.
Bemærk: Andre P. vulgaris kultivarer kan bruges til behårede root induktion. - Spire steriliseret frøene på sterile papirfiltre fugtet med Broughton & Dilworth (B & D) løsning22 (tabel 1) for 2 dage i mørke ved 28 ° C.
- Dagen før transformation forberede følgende:
- Streak ud 150 µL af A. rhizogenes kultur husly binære vektoren (udarbejdet i trin 1.13 og 1,14) på solid LB Spe100 og vokse ved 28 ° C natten over.
- Fyld en 15 mL tube med B & D løsning og erstat skruelåg med dobbelt lag aluminiumsfolie. Samle det til en 22 cm glasrør indeholdende 10 mL af B & D løsning (figur 2 c) og autoklave det.
- På dagen for transformation, samle følgende sterile materialer i en laminar flow hætte: spiret frø fra trin 2.2, kultur plade fra trin 2.3.1, rør fra trin 2.3.2, sterile dobbeltdestilleret vand (10 mL), pipetter og pipette tips, steril pincet, og 3 mL sprøjter.
- Bruge en bøjet 200 µL tip til at skrabe A. rhizogenes celler fra pladen ind i et microcentrifuge rør og resuspend i 1 mL af den dobbelt sterilt vand. På samme måde, forberede vektor kontrol celler separat.
- Bland celler forsigtigt til resuspend. Gør ikke vortex.
- Lav et 3 mm hul på aluminiumsfolie rør fra trin 2.3.2 ved hjælp af en steril pipette tip.
- Indsamle cellerne (enten promotor eller vektor kontrol) fra trin 2,5 med sprøjten og lidt punktere hypocotyls af spirede frø med nål-spids (fig. 2 g).
Bemærk: Sørg for, at nålen trænger (4 - 6 gange) karvæv og injicere små (~ 5 µL) dråber af celler på sår på forskellige positioner omkring hypocotyl. - Omhyggeligt indsætte rødderne af de injicerede stiklinger i 3 mm hul 15 mL rør indeholdende B & D løsning. Returnere hele opsætningen til 22 mL glasrør og forsegle dem for at bevare fugt.
- Inkuber rør i en vækst afdeling vedligeholdes ved 28 ° C med 16 h lys: 8 h mørke lysperiode.
Noter: 3-4 dage efter inkubation, planterne vokser op til randen af 22 mL glasrør.
Bemærk: Det er vigtigt at opretholde en B & D løsning konstant i både plast og glas rør.
3. initiativtager analyse: NIN promotor udtryk i Rhizobial knuder af fælles Bean
- Til induktion af rodknolde, podes Rhizobium tropici eller Rhizobium etli (der er kompatible hen til den fælles bean) i 100 mL PY medium (0,5 g pepton, 0,3 g gærekstrakt) suppleret med 700 mM CaCl2 og 20 mg mL1 nalidixic syre. Der inkuberes ved 30 ° C i 24 timer med rysten på 300 rpm.
Bemærk: Enhver specifik antibiotika kan bruges i tilfælde af transgene Rhizobium. - Sammenpresse cellerne i en centrifuge for 3 min på 2800 x g ved stuetemperatur og resuspend i 10 mL i 10 mM MgSO4. Justere OD af celler til 0,6 på OD600 ved fortynding med 10 mM MgSO4.
- Podes 1-2 mL af kultur (forberedt fra trin 3.2) pr. plante (både promotor og vektor kontrol) til at fremkalde knude vækst på de behårede rødder. Vande planterne med B & D løsning med begrænset kvælstof (2 mM KNO3) at fremme nodulation.
- Afhængigt af den eksperimentelle behov, indsamle de behårede rødder på forskellige tidspunkter. Indsamle prøver for at studere infektion tråde mellem 3-5 dage post podning (dpi).
Bemærk: Primordiale knude og unge knuder kan studeres på 6-9 dpi og 10-12 dage dpi, henholdsvis. Endelig, modne og funktionelle knuder kan studeres på 14-21 dpi, og senesced knuder på > 28 dpi. - Behandle rodknolde for aktiviteten af reporter gener (GUS eller normal god landbrugspraksis). Analyser GUS aktivitet i henhold til protokollen, beskrevet af Jefferson23. Observere normal god landbrugspraksis i et fluorescens mikroskop. Excite normal god landbrugspraksis fluorescens med en blå argon ion laser (488 nm), og indsamle de udsendte fluorescens fra 510 til 540 nm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Formålet med denne undersøgelse var at vurdere det spatiotemporelle udtryk mønster af knude-specifikke P. vulgaris NIN. For at gøre dette, en 700 bp region opstrøms af oversættelse indledningen codon af NIN gen blev valgt og et sæt af oligos var designet som afbilledet i figur 1A. Ved hjælp af en high-fidelity polymerase, NIN promotor fragment blev forstærket, isoleret (figur 1B), og klonet i destination binære vektor pBGWFS7.0 (figur 1 c) gennem en Gateway tilgang til at generere en transcriptional fusion til de kimære reporter GUS-forstærket normal god landbrugspraksis (pBGWFS7.0/PvNIN::GUS-NGL). PBGWFS7.0/PvNIN::GUS-NGL vektor konstruere typisk genererer hundredvis af uafhængige kloner. Koloni screening af PCR med gen-specifikke oligos identificerer nemt de korrekte kloner (figur 2D). PCR positive plasmid var Sanger sekventeret med promotor-specifikke oligos for at kontrollere ægtheden af indsatsen.
Opretholde høje luftfugtighed i hele eksperimentet er nødvendige for induktion af hård hud og behårede rødder. På webstedet af såret, calli er normalt observeret ved 5-7 dage (figur 2J) og ≥ 2 cm behårede rødder er observeret 10-12 dage efter transformation. Fleste af A. rhizogenes omdannet planter med held til at producere behårede rødder af 2 uger (figur 2 K). Antallet og længden af behårede rødder kan dog være variabel. Derfor Vælg de mest kraftigt voksende rødder for analyse og yderligere eksperimenter. Punktafgifter den primære rod ved at skære stænglen 2 cm under de behårede rødder og omplante dem i Potter der indeholder sterilt vermiculit (figur 2 L) eller i en hydroponics system.
For at studere de spatiotemporelle udtryk af knude-specifikke NIN promotor, behårede rødder blev podet med R. tropici, og GUS aktivitet blev observeret på periodiske intervaller efter podning afhængig af den eksperimentelle behov. Podning med R. tropici induceret en stærk GUS udtryk i de transgene rødder, der angiver, at rhizobia inducerer NIN udtryk i den fælles bean (figur 3A). Yderligere, prøveudtagning på 6-9 dpi viste GUS udtryk i Rhizobium inficeret rod hårceller (figur 3B). Phaseolus knude primordium, og unge og modne knuder viste også NIN udtryk (figur 3 c). På alle stadier af nodulation sås ingen sådan GUS udtryk i vektor kontrol rødder (figur 3D, 3E, 3F).
Figur 1 : Skitse af P. vulgaris NIN gen struktur og kloning. (A) A skematisk gengivelse af strukturen NIN gen viser 5' UTR (grøn), 4 exons, 3 introner og 3' UTR (røde) på kromosom nummer 9 af P. vulgaris. Opstrøms til NIN oversættelse indledningen codon ATG, viser en promotor-regionen på hvilke oligos blev designet. FO, fremad oligo; RO, reverse oligo; ATG, start codon; TAA, stop-codon. (B) PvNIN promotor-regionen var amplificeret fra frisk isolerede P. vulgaris genomisk DNA ved hjælp af promotor-specifikke oligo-sæt. M, 1 Kb stigen; 1, PCR reaktion med gDNA viser amplikon størrelse af 700 bp; 2, PCR reaktion uden gDNA (-ve kontrol). (C) Screening af pENTR/D-TOPO-PvNIN plasmider ved PCR ved hjælp af vektor specifikke M13 oligos. Korrekte indsættelser har et band på 1.024 bp (lane 3-6) og vektorer uden indsatser vil have en 324 bp band (lane 1 - 2). (D) promotor udtryk binary vektor kort anvendes i den foreliggende undersøgelse, pBGWFS7.0 vektor viser PvNIN promotor i fusion med GUS og normal god landbrugspraksis. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: A. rhizogenes forvandlet behårede rødder af fælles bean. (A) den steriliseret frø af P. vulgaris cv. Negro Jamapa spire på sterile filtrerpapir. (B) frø, frakke fjernet. (C) Tube setup for behårede root induktion. (D) skrabe ud A. rhizogenes kultur (pNIN & control). (E) A. rhizogenes kultur genopslemmes i sterilt destilleret vand. (F, G) Indsprøjte bakterieceller i hypocotyles. (H) Tube setup med Phaseolus frøplanter injiceres med bakterieceller. (Jeg, J) Calli dannet på sårede site 5-7 dpi. (K) behårede rødder 15 dpi (L) udtagelse tap rødder 2 cm under site af behårede root induktion. (M) sammensatte planter transplanteret ind i sterile vermiculit podet med R. tropici. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Promotor analyse af P. vulgaris NIN i transgene P. vulgaris rødder. Rumlige og tidsmæssige mønster af NIN udtryk afsløret af en promoterNIN::GUS-NGL konstruktion i transgene behårede rødder inkuberes med GUS som substrat. Optisk mikroskop billeder af PvNIN: GUS: (A) rødder podet med R. tropici, (B) GUS udtryk i krøllet rodtråde og (C) unge knuder. Billeder af kontrol (Tom vektor) viser ingen sådan GUS udtryk i (D) rødder podet med R. tropici, krøllet (E) rodtråde og (F) unge knuder. RH, rod hår. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Under funktionel analyse af gener spiller studiet af gen expression mønstre en afgørende rolle i at forstå den rumlige og tidsmæssige reguleringen af gener i vivo. En velkendt metode til at studere gen expression mønstre er at klone gen promotor region af interesse, opstrøms reporter gener såsom fluorescerende markørgener (normal god landbrugspraksis, RFP, etc.) eller β-glucuronidasesystemer. Heri, har vi valgt en promotor-regionen i den rod knude symbiose (RNS) bestemt gen, NIN, at studere spatio-temporale udtryk mønstre i P. vulgaris under RNS. Valgte promotor sekvens er blevet klonet opstrøms til GFP::GUS journalister ved hjælp af metoden Gateway til en promotor udtryk vektor.
Vi har beskrevet udtryk for symbiose specifikke promotor i behårede rodsystemet af P. vulgaris. Behårede rodsystemet har været meget udbredt for funktionelle karakterisering af gener, herunder RNAi medieret gen banke ned, ektopiske konstitutiv udtryk af gener, promoter udtryk og protein lokalisering i genstridige afgrøder. De vigtigste fordele ved systemet er, at det er let, reproducerbar, pålidelig, og på samme tid ikke arbejdskraft intensiv. Behårede Rodsystemet er vedtaget med succes i andre afgrøde bælgfrugter såsom G. max24 M. truncatula25, L. japonicus26,27, tomat28, osv., med de nødvendige ændringer. Yderligere, værktøjet kan vedtages i andre bælgplanter og ikke-bælgplanter arter når optimeret til den passende A. rhizogenes stamme, metode til podning og vækstbetingelser.
Der er mange kritiske parametre. Mens vælge promotor-regionen, der bør udvises forsigtighed til at designe den oligos, som vil forstærke de nødvendige promotor elementer, begynder fra det opstrøms region af oversættelse start sitein protein kodende gener; promotor analyse bør udføres ved hjælp af den tilgængelige software til at indsamle oplysninger om transkriptionsfaktorer bindende til det lovgivningsmæssige område. Tage sig mens inducerende behåret rødder: injicere stiklinger på passende tidspunkt; under injektion, sikre, at nålen ikke passere gennem hypocotyle; og opretholde høje fugtige forhold. Yderligere, mens de studerer promotor udtryk profiler i behårede rødder, behårede rødderne produceret af A. rhizogenes omsættes ikke altid, og derfor er det vigtigt at bekræfte den transformerede karakter af rødderne ved hjælp af normal god landbrugspraksis eller GUS reportere forud for udfører initiativtageren udtryk undersøgelser. Egnet stammer af Rhizobium bør vælges og koncentrationer af Rhizobium skal justeres som angivet i protokollen. Prøvetagning på de relevante faser er post podning afgørende for dokumenterer spatio-temporale udtryk for på forskellige stadier af RNS.
A. rhizogenes omdannet behårede root produktion er en af de hurtigste og effektive alternative metoder til at generere sammensatte planter i P. vulgaris. Disse sammensatte planter ikke kan producere genetisk modificerede frø, men kan producere transgene rødder inden for et par dage. I denne protokol, i modsætning til de andre metoder29, opretholde de lukkede rør konstant høj fugtighed for at fremme behårede rødder hurtigere på 10 dage dpi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev delvist støttet af Dirección General de Asuntos del personlige Académico, DGAPA/PAPIIT-UNAM (give nr. IN219916 til M.L og IA205117 til M-K. A) og Consejo Nacional de Ciencia y Tecnològia (CONACYT grant no. 240614 til M.L.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primers for qRT-PCR assay | |||
| pNIN Forward | CACC ATA GCT CCC CAA AAT GGT AT | ||
| pNIN Reverse | CAT CTT CCT TCC ACT AAC TAA C | ||
| M13 Forward | GTA AAA CGA CGG CCA G | ||
| M13 Reverse | CAG GAA ACA GCT ATG AC | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| pENTR/D-TOPO Cloning Kit | Invitrogen | K243520 | |
| Gateway LR Clonase II Enzyme Mix | Invitrogen | 11791100 | |
| pBGWFS7.0 | Plant systems biology | https://gateway.psb.ugent.be/vector/show/pBGWFS7/search/index/ | |
| Platinum Taq DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific | 10966018 | |
| DNeasy Plant Mini Kit | Qiagen | 69104 | |
| PureLink Quick Gel Extraction Kit | ThermoFisher Scientific | K210012 | |
| Platinum Pfx DNA Polymerase | Invitrogen | 11708013 | |
| Certified Molecular Biology Agarose | Bio-Rad | 1613102 | |
| One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli | Invitrogen | C404006 | |
| Nacl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Tryptone | Sigma-Aldrich | T7293-250G | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1625-250G | |
| Bacteriological agar | Sigma-Aldrich | A5306-1KG | |
| Kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | 60615-25G | |
| Spectinomycin sulfate | Sigma-Aldrich | PHR1441 | |
| Ethyl alcohol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Bacteriological peptone | Sigma-Aldrich | P0556 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Nalidixic acid | Sigma-Aldrich | N8878 | |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Gel loading solution | Sigma-Aldrich | G7654 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EQUIPMENT | |||
| Thermocycler | Veriti Thermal Cycler | 4375786 | |
| Centrifuge | Sigma | Sigma 1-14K | |
| Gel documentation unit | Carestream | Gel Logic 212 PRO | |
| MaxQ SHKE6000 6000 Shaking Incubator - 115VAC | Thermo scientific | EW-51708-70 | |
| Plant growth chamber | MRC | PGI-550RH | |
| Horizantal laminarair flow cabinate | Lumistell | LH-120 | |
| Fluorescent microscope | Leica | DM4500 B | |
| Petridish | sym laboratorios | 90X15 | |
| Scalpel Blade | Fisher scientific | 53223 | |
| Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher scientific | 14-959-53A | |
| 22 mL glass tubes | Thomas scientific | 45048-16150 |
References
- Hernández-Garcia, C. M., Finer, J. J. Identification and validation of promoters and cis-actingregulatory elements. Plant Science. 217-218, 109-119 (2014).
- Dhanapal, A. P., Govindaraj, M. Unlimited Thirst for Genome Sequencing, Data Interpretation, and Database Usage in Genomic Era: The Road towards Fast-Track Crop Plant Improvement. Genetics Research International. , 684321 (2015).
- Nanjareddy, N., Arthikala, M. K., Blanco, L., Arellano, E. S., Lara, M. Protoplast isolation, transient transformation of leaf mesophyll protoplasts and improved Agrobacterium-mediated leaf disc infiltration of Phaseolus vulgaris: Tools for rapid gene expression analysis. BMC Biotechnol. 16 (1), 53 (2016).
- Pumplin, N., Zhang, X., Noar, R. D., Harrison, M. J. Polar localization of a symbiosis-specific phosphate transporter is mediated by a transient reorientation of secretion. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (11), E665-E672 (2012).
- Kryvoruchko, I. S., et al. MtSWEET11, a Nodule-Specific Sucrose Transporter of Medicago truncatula. Plant Physiol. 171 (1), 554-565 (2016).
- Suzaki, T., Yano, K., Ito, M., Umehara, Y., Suganuma, N., Kawaguchi, M. Positive and negative regulation of cortical cell division during root nodule development in Lotus japonicus is accompanied by auxin response. Development. 139 (21), 3997-4006 (2012).
- Suzaki, T., et al. Endoreduplication-mediated initiation of symbiotic organ development in Lotus japonicus. Development. 141 (12), 2441-2445 (2014).
- Qin, L., et al. The high-affinity phosphate transporter GmPT5 regulates phosphate transport to nodules and nodulation in soybean. Plant Physiol. 159 (4), 1634-1643 (2012).
- Wang, Z., Panfeng, L., Yan, Y., Chi, Y., Fan, B., Chen, Z. Expression and Functional Analysis of a Novel Group of Legume-specific WRKY and Exo70 Protein Variants from Soybean. Sci Rep. 6, 32090 (2016).
- Montiel, J., et al. A Phaseolus vulgaris NADPH oxidase gene is required for root infection by Rhizobia. Plant Cell Physiol. 53 (10), 1751-1767 (2012).
- Arthikala, M. K., et al. PvRbohB negatively regulates Rhizophagus irregularis colonization in Phaseolus vulgaris. Plant Cell Physiol. 54 (8), 1391-1402 (2013).
- Arthikala, M. K., Sánchez-López, R., Nava, N., Santana, O., Cárdenas, L., Quinto, C. RbohB a Phaseolus vulgaris NADPH oxidase gene, enhances symbiosome number, bacteroid size, and nitrogen fixation in nodules and impairs mycorrhizal colonization. New Phytol. 202 (3), 886-900 (2014).
- Barraza, A., et al. Down-regulation of PvTRE1 enhances nodule biomass and bacteroid number in the common bean. New Phytol. 197 (1), 194-206 (2013).
- Estrada-Navarrete, G., et al. An autophagy-related kinase is essential for the symbiotic relationship between Phaseolus vulgaris and both rhizobia and arbuscular mycorrhizal fungi. Plant Cell. 28 (9), 2326-2341 (2016).
- Nanjareddy, K., et al. A Legume TOR Protein Kinase Regulates Rhizobium Symbiosis and Is Essential for Infection and Nodule Development. Plant Physiol. 172 (3), 2002-2020 (2016).
- Frühling, M., Schröder, G., Hohnjec, N., Pühler, A., Perlick, A. M., Küster, H. The promoter of the Vicia faba L. gene VfEnod12 encoding an early nodulin is active in cortical cells and nodule primordia of transgenic hairy roots of Vicia hirsuta as well as in the prefixing zone II of mature transgenic V. hirsuta root nodules. Plant Science. 160 (1), 67-75 (2000).
- Szabados, L., Ratet, P., Grunenberg, B., de Bruijn, F. J. Functional analysis of the Sesbania rostrata leghemoglobin glb3 gene 5'-upstream region in transgenic Lotus corniculatus and Nicotiana tabacum plants. Plant Cell Online. 2 (10), 973-986 (1990).
- Madsen, L. H., Tirichine, L., Jurkiewicz, A., Sullivan, J. T., Heckmann, A. B., Bek, A. S., Ronson, C. W., James, E. K., Stougaard, J. The molecular network governing nodule organogenesis and infection in the model legume Lotus japonicus. Nat Commun. 12, 1-10 (2010).
- Montiel, J., Arthikala, M. K., Quinto, C. Phaseolus vulgaris RbohB functions in lateral root development. Plant Signal Behav. 8 (1), 1-3 (2013).
- Nanjareddy, K., Arthikala, M. K., Gómez, B. M., Blanco, L., Lara, M. Differentially expressed genes in mycorrhized and nodulated roots of common bean are associated with defense, cell wall architecture, N metabolism, and P metabolism. PLoS ONE. 12 (8), e0182328 (2017).
- Karimi, M., Inzé, D., Depicker, A. Gateway vectors for Agrobacterium-mediated plant transformation. Trends Plant Sci. 7 (5), 193-195 (2002).
- Broughton, W. J., Dilworth, M. J.
- Jefferson, R. A. Assaying chimeric genes in plants, the GUS gene fusion system. Plant Mol Biol Rep. 5 (4), 387-405 (1987).
- Cho, H. J., Farrand, S. K., Noel, G. R., Widholm, J. M. High-efficiency induction of soybean hairy roots and propagation of the soybean cyst nematode. Planta. 210 (2), 195-204 (2000).
- Deng, Y., Mao, G., Stutz, W., Yu, O. Generation of Composite Plants in Medicago truncatula used for Nodulation Assays. J. Vis. Exp. (49), e2633 (2011).
- Kumagai, H., Kouchi, H. Gene silencing by expression of hairpin RNA in Lotus japonicus roots and root nodules. Mol Plant Microbe Interact. 16 (8), 663-668 (2003).
- Okamoto, S., Yoro, E., Suzaki, T., Kawaguchi, M. Hairy Root Transformation in Lotus japonicus. Bio-protocol. 3 (12), e795 (2013).
- Jacobs, T. B., Martin, G. B. High-throughput CRISPR Vector Construction and Characterization of DNA Modifications by Generation of Tomato Hairy Roots. J. Vis. Exp. (110), e53843 (2016).
- Estrada-Navarrete, G., et al. Agrobacterium rhizogenes-transformation of the Phaseolus spp.: a tool for functional genomics. Mol Plant Microbe Interact. 19 (12), 1385-1393 (2006).
