Summary
ניתוח ביטוי יזם מכריעים לשיפור ההבנה של הכונה וביטוי ייתכן היעד גנים. במסמך זה אנו מציגים פרוטוקול כדי לזהות, לבודד לשבט מקדם הצמח. עוד יותר, אנו מתארים את האפיון של האמרגן גולה ספציפיים שורשים שעירים שעועית נפוצות.
Abstract
רצפי במעלה הגן קידוד רצפים מכונים כמו יזם רצפים. לומד את דפוסי ביטוי של היזמים הם מאוד משמעותיים בהבנת הכונה ודפוסי ייתכן ביטוי של גנים היעד. מצד שני, חשוב גם כדי ליצור כלי הערכה יזם טכניקות שינוי גנטי מהיר, יעיל, ו לשחזור. במחקר זה, חקרנו למשמעות הביטוי ייתכן הקמתה (נין) rhizobial ספציפיים סימביוזה גולה האמרגן של מצויה הטרנסגניים שורשים שעירים. צמח הגנום מסדי נתונים באמצעות כלי ניתוח זיהינו, מבודד, שיכפל את המקדם נין דלקתית פ ב פיוז'ן תעתיק לכתב chimeric β-glucuronidase (גאס) גאס-enhanced::GFP. יתרה מזאת, פרוטוקול זה מתאר מערכת מהירה ופסיביות של שינוי גנטי דלקתית פ באמצעות שורשים שעירים Agrobacterium rhizogenes המושרה. מערכת זו יוצרת שורשים שעירים ≥2 ס מ- 10 עד 12 ימים לאחר השינוי. בשלב הבא, אנחנו העריכו הביטוי ייתכן של יזם נין בשורשים שעיר ריזוביום מחוסן במרווחים תקופתיים של פוסט-חיסון. התוצאות שלנו מתואר על ידי גאס פעילות להראות כי ייצוג המקדם נין היה פעיל במהלך התהליך של nodulation. יחד, בפרוטוקול הנוכחי מדגים כיצד לזהות, לבודד, שיבוט, לאפיין את הצמח מקדם מכירות שורשים שעירים שעועית נפוצות. יתר על כן, פרוטוקול זה הוא קל לשימוש במעבדות שאינם מיוחדים.
Introduction
היזמים הם כלים חשובים ביולוגית מולקולרית אשר לשחק תפקיד מכריע בהבנת ויסות הביטוי של הגנים של עניין. היזמים נמצאים רצפי DNA ממוקם במעלה הזרם של התרגום codon חניכה של ג'ין רצף והן נושאות את המידע התקינה המרכזית של גנים; לכן, ביאור נכון ואפיון שלהם הם חיוניים להבנת תפקוד הגן. בהתאם דפוסי ביטוי, היזמים צמח מסווגים מכוננת, רקמות ספציפיות, או פיתוח הבמה- וספציפיים inducible1. ההתקדמות transcriptomic טכנולוגיות, שיפורים ממוחשבות, והזמינות של מספר גדל והולך של רצפי הגנום מיני צמחים שונים יש הקלה התחזית בקנה מידה גדול של רצפי יזם2.
מצד שני, חשוב גם כדי ליצור כלי הערכה יזם טכניקות שינוי גנטי מהיר, יעיל, ו לשחזור. בניגוד דגם צמחים אחרים, אפיון פונקציונלי נפוצים בין קטניות (פ דלקתית) גנים מופרעת בעיקר בגלל אופי Phaseolus sp. לשינוי גנטי יציב הסרבן. מערכות טרנספורמציה ארעי לשמש חלופה עבור ג'ין מהירה אפיון פונקציונלי מחקרים3. במחקר סימביוזה קטניות, האינטראקציה בין חיידק rhizobial מצמח פונדקאי קטניות היא אחת המערכות דגם צייתן ביותר לניתוח פונקציונלי של גנים ספציפיים גולה ולימודים קדם. כל-כך רחוק, מספר היזמים קטניות הקשורים symbioses אלה היה מאופיין, בילוי, אספסת truncatula PT44, SWEET115, לוטוס ג'אפוניכאס קיקלופ, UBQ6, VAG17, PT5 מקסימום גליצין 8, Exo70J9, RbohB דלקתית פ 10,11,12, TRE113, PI3K14, טור15, ועוד. חבר העמים גורמים משפיעים ישירות על הכונה. הפקטור שעתוק ENBP1A נקשר באזור רגולטוריות חבר העמים (−692 bp) של nodulin מוקדם VfENOD12, זה מקל על הביטוי של גן כתב ב גולה primordia בקיה faba16. החלפה של אזורים רגולטוריות חבר העמים (−161 כדי −48 bp) של האמרגן ספציפיים גולה leghemoglobin GLB3 עם heterologous נחתכות היזמים אלפא-p35S, אלפא-פסנתרים, גרמו לאובדן היחודיות גולה ו מופחתת יזם פעילות17 .
בדו"חות קודמים מראים את גורם שעתוק נין נדרש עבור אתחול של זיהום rhizobial לתאי השורש, גם חיוני גולה organogenesis ג'אפוניכאס ל'18. במחקר הנוכחי, אנו מתארים פרוטוקול זיהוי, בידוד, שיבוט של אפיון של גולה ספציפיים יזם שורשים שעירים שעועית נפוצות. כדי להשיג זאת, אנו נבחר מקדם נין סימביוזה ספציפי rhizobial וולגריס פ , שיכפל ב פיוז'ן תעתיק לכתב chimeric גאס-enhanced::GFP. יתרה מזאת, פרוטוקול זה מתאר מערכת מהירה ופסיביות של שינוי גנטי דלקתית פ באמצעות שורשים שעירים rhizogenes א המושרה. מערכת זו יוצרת שורשים שעירים פחות משבועיים לאחר השינוי. בסופו של דבר, אנחנו העריכו הביטוי ייתכן נין יזם ב- rhizobia התנחלו פקעיות מאת GUS מכתים.
ההליך המתואר כאן עשוי להיות שימושי לא רק לצורך המחקר של nodulation ו- mycorrhization11 צמחים קטניות, אלא גם לצורך המחקר דפוסי ביטוי יזם שורשים19. יתר על כן, פרוטוקול זה הוא קל לשימוש במעבדות שאינם מיוחדים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. זיהוי, בידוד, שכפול של יזם נין עמ' דלקתית
- לזהות את רצף יזם עבור הגן עניין. יש מספר מסדי נתונים הגנום, כלי ניתוח זמינים עבור צמחים כגון Phytozome, Ensembl צמחים, NCBI, וכו A קטניות יזם דלקתית פ נין (PvNIN; Phvul.009G115800) היה בשימוש במחקר20.
- עיצוב oligos גם עבור שער או אנזים הגבלה מסורתי שיבוט בהתאם למערכת וקטור בשימוש (איור 1 א').
הערה: תקן (25-35 bp), תחל desalted העבודה בסדר. רצפים oligo הפוכה מחזיתות בין יזם הגן הם רצוי. - להגביר את האזור יזם PvNIN (או יזם אזור של הגן עניין) של טרי מבודד דלקתית פ הדנ א באמצעות ערכת oligo יזם ספציפי. שימוש של פולימראז באיכות גבוהה עם התנאים הבאים PCR: 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות; מחזורים (95 ° C ל 30 s, 55 ° C ל 30 s, 72 מעלות צלזיוס במשך 1 דקה); 72 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות.
- לרוץ השבר מוגבר על 1% ג'ל agarose 60 V על מגש ג'ל 7 x 10 ס מ, elute את אמפליקון המתאים (700 bp, איור 1B) ולשכפל לתוך וקטור pENTR/D-טופוגרפיה על פי הוראות היצרן.
- שינוי צורה µL 2 התגובה לתוך המוסמכת Escherichia coli תאים באמצעות צלחת 150 µL של תערובת שינוי הוראות היצרן על אחיו lysogeny (LB) בתוספת kanamycin 50 מ ג/ליטר (Kan50). לגדל את התאים מצופה ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
- לבחור המושבות והתרבות 3-6 שאותם בן לילה במדיום LB המכיל Kan50. לבודד פלסמיד DNA בשיטת הבחירה ולנתח את פלסמיד באמצעות PCR באמצעות oligos M13 ספציפית את וקטור. עבור ה-PCR, שימוש 100 ננוגרם של פלסמיד, 0-ב־15 pm של oligos, 10 X PCR מאגר 0.5 U Taq DNA פולימראז, dNTPs 10 מ מ.
- השתמש התנאים הבאים הגברה PCR; 95 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות; מחזורים (95 ° C ל 30 s, 58 ° C ל 30 s, 72 ° C עבור 75 s); ו- 72 מעלות צלזיוס במשך 7 דקות לדמיין את המוצרים PCR על ג'ל agarose 1%. ודא הוספות הנכונה שיש להקה-bp 1,024 ווקטורים ללא הוספת יש להקה bp 324 (איור 1C).
- לבצע את התגובה LR בין ערך וקטור (pENTR/D-טופוגרפיה-PvNIN) לבין היעד וקטור pBGWFS7.021 באמצעות שילוב אנזים מסחרי על פי הוראות היצרן.
- להפוך את 2 µL של תגובה LR לתוך המוסמכת e. coli תאים באמצעות טכניקות רגיל כפי שמתואר צלחת 150 µL תערובת שינוי הוראות היצרן-LB בתוספת 100 מ ג/ליטר של spectinomycin (Spe100). לגדל את התאים מצופה ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
- לאסוף כ 5 מושבות, תרבות אותם בן לילה במדיום LB המכיל Spe100. לבודד את פלסמיד הדנ א באמצעות שיטה של בחירה ולנתח את פלסמיד באמצעות PCR באמצעות oligos ספציפיים יזם.
- להשתמש בתנאי PCR בשלב 1.3. דמיינו את המוצרים PCR על ג'ל agarose 1% כדי לאשר הגברה. Amplicons הם 700 bp.
- רצף של פלסמיד חיובי pBGWFS7.0/PvNIN::GUS-GFP (איור 1D) עם oligos יזם ספציפיים כדי לאמת את המקוריות של הקדמי.
- להפוך את פלסמידים זן rhizogenes א K599 (עם זאת, יש זנים אחרים של rhizogenes א יכול לשמש). להוסיף 2 µL של ההכנות פלסמיד 50 µL של תאים electrocompetent electroporate ב cuvette 1 מ מ עם ההגדרות הבאות: 1.8 kV, 25 µF וω 200.
- לשחזר תאי ~ 500 µL SOC בינוני, לנער ב 28 ° C עבור 2 ח' בלוחית-LB-Spe100 ולגדול ב 28 מעלות צלזיוס במשך יומיים.
- לבצע סינון המושבה כאמור בשלב 1.7 ולהשתמש התנאים PCR כמו שלב 1.3. להפוך גליצרול מניות מן שיבוטים חיובי ואחסן אותם ב- 80 מעלות צלזיוס.
- השתמש rhizogenes א תרבות מחסה pBGWFS7.0 ריק וקטור של הפקד שלילי.
2. א Rhizogenes הפך שורשים שעירים של השעועית נפוצות
- עיקור הזרעים שעועית (דלקתית פ cv. נגרו Jamapa) (כ-20) 50 מ של אתנול 96% עבור 1 דקות ולמחוק האתנול; לאחר מכן להוסיף 50 מ של 20% מלבין (נתרן תת-כלורי) למשך 10 דקות, עם ערבוב מתמיד עם תא למינארי. להסיר את האקונומיקה ולשטוף במים סטריליים עודף 3 פעמים.
הערה: שאר הזנים דלקתית פ יכול לשמש עבור שורש שעיר אינדוקציה. - לנבוט הזרעים סטיריליים על ניירות סינון סטרילי-סוידיש ברוטון & דילוורט (B & D) פתרון22 (טבלה 1) במשך יומיים בחושך ב 28 º C.
- יום לפני השינוי להכין את הפעולות הבאות:
- צובעות את 150 µL התרבות rhizogenes א מחסה הווקטור בינארי (להכין בשלבים 1.13 ו- 1.14) על מוצק LB Spe100 ולגדול ב 28 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
- למלא את צינור 15 מ"ל B & D פתרון והחלף הכובע בורג ברדיד אלומיניום ושכבה כפולה. להרכיב את זה לתוך צינור זכוכית 22 ס מ המכיל 10 מ"ל של B & D פתרון (איור 2C) ותא לחץ זה.
- ביום של טרנספורמציה, להרכיב את החומרים הבאים סטרילי בתוך תא למינארי: מונבטים זרעים מהשלב 2.2, הצלחת תרבות שלב 2.3.1, צינורות מהשלב 2.3.2, סטרילי מים מזוקקים כפול (10 מ"ל), פיפטות ועצות פיפטה, מלקחיים סטרילי, 3 mL מזרקים.
- השתמש טיפ 200 µL כפופות כדי לגרד rhizogenes א התאים מהצלחת לתוך צינור microcentrifuge ו resuspend ב 1 מ"ל של המים סטרילי כפול. באופן דומה, להכין וקטור שליטה התאים בנפרד.
- מערבבים את התאים בעדינות כדי resuspend. לא מערבולת.
- תעשה חור 3 מ מ על רדיד האלומיניום של הצינורות מהשלב 2.3.2 באמצעות טיפ פיפטה סטרילי.
- לאסוף את התאים (פקד או יזם או וקטור) משלב 2.5 עם המזרק ומורחים מעט את hypocotyls של הזרעים מונבטים עם קצה המחט (איור 2G).
הערה: ודא המחט חודרת (4 - 6 פעמים) הרקמה וסקולריים ולהזריק קטן (~ 5 µL) טיפות של התאים על הפצע לעבר עמדות שונות סביב hypocotyl. - בזהירות הכנס שורשי השתילים מוזרק לתוך החור 3 מ מ של הצינור 15 מ"ל המכיל B & D פתרון. להחזיר לכל הארגון לתוך 22 mL צינורות זכוכית, לסגור אותם כדי לשמור על לחות.
- דגירה הצינורות בתוך תא הצמיחה ומתוחזק על 28 מעלות צלזיוס עם 16 h אור: 8 h photoperiod כהה.
הערות: 3-4 ימים לאחר דגירה, הצמחים גדלים על החישוק הצינורות זכוכית 22 מ"ל.
הערה: חשוב לשמור את B & D פתרון באופן קבוע צינורות פלסטיק וזכוכית.
3. קדם ניתוח: נין יזם ביטוי Rhizobial גושים של השעועית נפוצות
- עבור אינדוקציה של פקעיות, לחסן ריזוביום tropici או פידה טרי ונפלא ריזוביום (שיהיו תואמים לשעועית נפוצות) ב- 100 מ של מדיום PY (0.5 ג'י peptone, תמצית שמרים 0.3 גרם) בתוספת 700 מ"מ CaCl2 ו- 20 מ ג מ ל− 1 חומצה nalidixic. דגירה ב 30 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות ביממה ברעידות-300 סל ד.
הערה: אנטיביוטיקה מסוימת יכול לשמש במקרה של הטרנסגניים ריזוביום. - גלולה התאים צנטריפוגה למשך 3 דקות ב g x 2,800 בטמפרטורת החדר, resuspend ב- 10 מ ל 10 מ מ MgSO4. להתאים את יתר של תאים 0.6-OD600 דילול עם 10 מ מ MgSO4.
- לחסן 1-2 מ של תרבות (להכין משלב 3.2) לכל צמח (פקד יזם והן וקטורי) כדי לגרום לצמיחה גולה על השורשים שעיר. להשקיית הצמחים עם B & D פתרון עם חנקן מוגבלים (2 מ מ יודע3) כדי לקדם את nodulation.
- בהתאם הצורך ניסיוני, לאסוף את השורשים שעיר בנקודות זמן שונות. לאסוף דגימות ללמוד זיהום חוטים בין 3-5 ימים פוסט חיסון (dpi).
הערה: גולה הקדמוני נודולים צעיר ניתן יהיה ללמוד dpi 6-9 ו- 10-12 ימים dpi, בהתאמה. לבסוף, גושים בוגרת ופונקציונליים ניתן יהיה ללמוד 14-21 dpi, נודולים senesced-> 28 dpi. - לעבד את השורש/הגושים לפעילות של גנים כתב (גאס או GFP). לנתח את גאס פעילות לפי הפרוטוקול המתואר על ידי ג'פרסון23. להתבונן GFP תחת מיקרוסקופ זריחה. לרגש GFP זריחה עם יון ללייזר כחול (488 ננומטר), לאסוף את קרינה פלואורסצנטית הנפלט מן 510 כדי 540 nm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מטרת המחקר הייתה להעריך למשמעות הביטוי ייתכן גולה ספציפיים דלקתית פ נין. כדי לעשות זאת, נבחר 700 bp אזור במעלה הזרם codon חניכה התרגום של הגן נין , קבוצת oligos תוכנן כפי שהיא מתוארת איור 1A. באמצעות פולימראז אמינות גבוהה, השבר יזם נין היה מוגבר מבודד (איור 1B), משובטים לתוך pBGWFS7.0 וקטור בינארי (איור 1C) היעד באמצעות שער גישה ליצירת פיוז'ן תעתיק ל chimeric כתב GFP משופרת גאס (pBGWFS7.0/PvNIN::GUS-GFP). PBGWFS7.0/PvNIN::GUS-GFP וקטור הבונה בדרך כלל יוצר מאות שיבוטים עצמאית. ההקרנה המושבה על ידי ה-PCR עם גנים ספציפיים oligos מזהה בקלות שיבוטים הנכון (איור דו-ממדי). פלסמיד חיובית PCR היה שסנגר וסודרו עם oligos יזם ספציפיים כדי לאמת את המקוריות של הקדמי.
שמירה על לחות גבוהה לאורך כל הניסוי הוא הכרחי עבור אינדוקציה של קסם ושורשים שעיר. באתר של ופצעו, calli הם בדרך כלל נצפו על 5-7 ימים (איור 2J) ואת ≥ 2 ס מ שעיר השורשים הם נצפו על 10 עד 12 ימים לאחר השינוי. הרוב המכריע של rhizogenes א הפך צמחים בהצלחה לייצר שורשים שעיר על ידי 2 שבועות (איור 2 K). עם זאת, מספר ואורך שורשים שעירים יכול להיות משתנה. לפיכך, לבחור את השורשים גדל נמרצות ביותר עבור ניתוח וניסויים נוספים. לסלק את השורש העיקרי על ידי חיתוך הגבעול 2 ס מ מתחת שורשים שעירים, השתלת אותם לסירים המכיל ורמיקוליט סטרילי (איור 2 L) או בכל מערכת הידרופוניקה.
ללמוד הביטוי ייתכן של האמרגן נין גולה ספציפיים, חוסנו שורשים שעירים עם tropici רבי, גאס פעילות נצפתה ב חיסון שלאחר במרווחים תקופתיים בהתאם הצורך ניסיוני. חיסון עם ר' tropici המושרה ביטוי גאס. חזק שורשים מהונדס, המציין כי rhizobia המניע את הביטוי נין של השעועית נפוצות (איור 3 א). דגימה נוספת, ב- 6-9 dpi הראה ביטוי גאס בתאים שורש השיער ריזוביום נגוע (איור 3B). ראשית גולה Phaseolus , נודולים צעיר ובוגר הפגינו גם ביטוי נין (איור 3C). בכל שלבי nodulation, אין ביטוי כזה של גאס נראתה וקטור שליטה שורשים (דמות תלת-ממד, 3E, 3F).
איור 1 : קווי המתאר של פ דלקתית נין מבנה הגן, שיבוט. (א) A ייצוג סכמטי של מבנה הגן נין מציג 5' UTR (ירוק), 4 exons, אינטרונים 3, ו- 3' UTR (אדום) על כרומוזום מספר 9 פ דלקתית. במעלה codon חניכה תרגום נין ATG, מראה אזור יזם על oligos אשר תוכננו. FO, oligo קדימה; רו, oligo הפוכה; ATG, התחל codon; TAA, stop codon. PvNIN (B) יזם האזור היה מוגבר של טרי מבודדים דלקתית פ דנ א גנומי שימוש בערכת oligo יזם ספציפיים. M, סולם 1 Kb; תגובה 1, PCR עם gDNA מציג אמפליקון בגודל של 700 bp; תגובה 2, PCR בלי gDNA (-ve שליטה). (ג) הקרנת הסרט פלסמידים pENTR/D-טופוגרפיה-PvNIN על ידי PCR באמצעות oligos M13 ספציפית את וקטור. הוספות הנכונה יש להקה 1,024 bp (ליין 3-6), וקטורים ללא הוספת תהיה להקה bp 324 (ליין 1 - 2). (ד) יזם מפה וקטורית בינארי ביטוי השתמשו במחקר הנוכחי, מראה וקטור pBGWFS7.0 יזם PvNIN ב פיוז'ן עם גאס ו- GFP. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: Rhizogenes א הפך שורשים שעירים של השעועית נפוצים. (א) סטיריליים זרעי דלקתית פ cv. Jamapa נגרו הנבטת על נייר סינון סטרילי. זרעים (B), הסיר את המעיל. (ג) שפופרת ההתקנה עבור שורש שעיר אינדוקציה. (ד) גירוד את התרבות rhizogenes א (פנין & הבקרה). (E) א rhizogenes התרבות resuspended ב סטרילי מים מזוקקים. (F, G) הזרקת תאים חיידקיים לתוך hypocotyles. (H) שפופרת ההתקנה עם שתילים Phaseolus מוזרק עם תאים חיידקיים. (אני, J) Calli שהוקמה באתר הפצועים dpi 5-7. (K) שעיר שורשים 15 dpi (L) excising השורשים ברז 2 ס מ מתחת לאתר של השורש שעיר אינדוקציה. (ז) צמחים ללא הפרדות צבע מושתלים לתוך ורמיקוליט סטרילי מחוסן עם ר' tropici. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 : יזם ניתוח של פ דלקתית נין ב הטרנסגניים פ וולגריס שורשים. דוגמת מילוי יכולות הביטוי נין התגלה על ידי בונה promoterNIN::GUS-GFP בשורשים שעיר הטרנסגניים מודגרות עם גאס כמו מצע. מיקרוסקופ אופטי תמונות של PvNIN: גאס: (א) שורשים מחוסן עם tropici רבי, גאס (B) ביטוי שערות השורש מסולסל, גושים צעיר (C). תמונות של שליטה (וקטורית ריקים) מציג אין ביטוי כזה של גאס בשורשים (D) מחוסן עם tropici ר, (E) מכורבלת שערות השורש, גושים צעיר (F). Rh, שורש השיער. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
במהלך אנליזה פונקציונלית של גנים, המחקר של דפוסי ביטוי הגנים ממלא תפקיד מכריע בהבנת יכולות ויסות הגנים ויוו. שיטה ידועה ללמוד דפוסי ביטוי גנים הוא לשבט את האזור יזם גנים של עניין, במעלה כתב גנים כגון גנים סמן פלורסנט (GFP, RFP, וכו ') או β-glucuronidase. במסמך זה, בחרנו אזור יזם השורש גולה סימביוזה (האחיות המוסמכות) גנים ספציפיים, נין, ללמוד את דפוסי ביטוי-עתיים וולגריס פ במהלך האחיות המוסמכות. הרצף יזם שנבחר נשלטה במעלה הזרם לכתבים GFP::GUS באמצעות שיטת השער לתוך וקטור בביטוי יזם.
תארנו את הביטוי של promotor ספציפי סימביוזה במערכת השורש שעיר של דלקתית פ. מערכת השורשים שעיר כבר בשימוש נרחב עבור אפיון פונקציונלי של גנים, כולל RNAi בתיווך מצרי ג'ין דפיקה למטה, חוץ רחמי מכוננת ביטוי של גנים, יזם ביטוי חלבון לוקליזציה בגידולים הסרבן. היתרונות העיקריים של המערכת הם כי זה קל, אמין לשחזור, באותו זמן לא עבודה אינטנסיבית. מערכת השורשים שעיר כבר בהצלחה אומץ ב קטניות חיתוך אחרים כמו ג מקסימום24, truncatula מ25,26, ג'אפוניכאס ל'27, עגבניות28, וכדומה, עם השינויים הדרושים. עוד, הכלי יכול להיות מאומץ במינים אחרים קטניות, ללא קטניות כאשר ממוטבת עבורו מתאימה rhizogenes א להתאמץ, שיטה של חיסון, תנאי הגידול.
ישנם הרבה פרמטרים קריטיים. בעת בחירת האזור יזם, צריך לקחת כדי לעצב את oligos אשר להגביר את היסודות וכאמצעי הכרחי, החל מאזור במעלה sitein התחל תרגום החלבון קידוד גנים; ניתוח יזם צריך להתבצע באמצעות תוכנה הזמינים כדי לאסוף מידע על גורמי שעתוק מחייב את האזור רגולטוריות. . שמור על עצמך תוך גרימת שורשים שעירים: להזריק שתילים בשלב המתאים; במהלך זריקה, להבטיח כי המחט אינו עובר hypocotyle; ולשמור על תנאי לחות גבוהה. עוד יותר, תוך כדי לימוד פרופילי ביטוי יזם שורשים שעירים, השורשים שעיר המיוצר על ידי rhizogenes א לא הופכים תמיד, ולכן זה חשוב כדי לאשר את מהות השורשים באמצעות עיתונאים GFP או גאס לפני טרנספורמציה ביצוע מחקרים בביטוי יזם. זנים מתאימים של ריזוביום צריך להיבחר, צריך להיות מותאם את ריכוזי ריזוביום כמצוין בפרוטוקול. דגימה בשלבים המתאימים פוסט חיסון חיוני לתיעוד-עתיים ביטוי של האמרגן בשלבים שונים של האחיות המוסמכות.
הפקה הבסיס שעיר rhizogenes א הפך הוא באחת השיטות חלופי היעילה והמהירה ביותר כדי ליצור צמחים ללא הפרדות צבע וולגריס פ. צמחים ללא הפרדות צבע אלה לא יכול לייצר זרעים מהונדס, אך יכול לייצר שורשים הטרנסגניים תוך מספר ימים. ב פרוטוקול זה, שלא כמו שאר שיטות29, צינורות סגורה לשמור על לחות גבוהה מתמיד לקידום מהיר יותר ב 10 ימים dpi שעיר שורשים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו מומן בחלקו על ידי הגנרל Dirección דה Asuntos דל Académico אישי, DGAPA/PAPIIT-UNAM (מענק. לא. IN219916 M.L, IA205117 ל ז-ק... A) ו- y Consejo נאסיונאל דה Ciencia Tecnològia (CONACYT מענק מס 240614 מ. ל).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primers for qRT-PCR assay | |||
| pNIN Forward | CACC ATA GCT CCC CAA AAT GGT AT | ||
| pNIN Reverse | CAT CTT CCT TCC ACT AAC TAA C | ||
| M13 Forward | GTA AAA CGA CGG CCA G | ||
| M13 Reverse | CAG GAA ACA GCT ATG AC | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| pENTR/D-TOPO Cloning Kit | Invitrogen | K243520 | |
| Gateway LR Clonase II Enzyme Mix | Invitrogen | 11791100 | |
| pBGWFS7.0 | Plant systems biology | https://gateway.psb.ugent.be/vector/show/pBGWFS7/search/index/ | |
| Platinum Taq DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific | 10966018 | |
| DNeasy Plant Mini Kit | Qiagen | 69104 | |
| PureLink Quick Gel Extraction Kit | ThermoFisher Scientific | K210012 | |
| Platinum Pfx DNA Polymerase | Invitrogen | 11708013 | |
| Certified Molecular Biology Agarose | Bio-Rad | 1613102 | |
| One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli | Invitrogen | C404006 | |
| Nacl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Tryptone | Sigma-Aldrich | T7293-250G | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1625-250G | |
| Bacteriological agar | Sigma-Aldrich | A5306-1KG | |
| Kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | 60615-25G | |
| Spectinomycin sulfate | Sigma-Aldrich | PHR1441 | |
| Ethyl alcohol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Bacteriological peptone | Sigma-Aldrich | P0556 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Nalidixic acid | Sigma-Aldrich | N8878 | |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Gel loading solution | Sigma-Aldrich | G7654 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EQUIPMENT | |||
| Thermocycler | Veriti Thermal Cycler | 4375786 | |
| Centrifuge | Sigma | Sigma 1-14K | |
| Gel documentation unit | Carestream | Gel Logic 212 PRO | |
| MaxQ SHKE6000 6000 Shaking Incubator - 115VAC | Thermo scientific | EW-51708-70 | |
| Plant growth chamber | MRC | PGI-550RH | |
| Horizantal laminarair flow cabinate | Lumistell | LH-120 | |
| Fluorescent microscope | Leica | DM4500 B | |
| Petridish | sym laboratorios | 90X15 | |
| Scalpel Blade | Fisher scientific | 53223 | |
| Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher scientific | 14-959-53A | |
| 22 mL glass tubes | Thomas scientific | 45048-16150 |
References
- Hernández-Garcia, C. M., Finer, J. J. Identification and validation of promoters and cis-actingregulatory elements. Plant Science. 217-218, 109-119 (2014).
- Dhanapal, A. P., Govindaraj, M. Unlimited Thirst for Genome Sequencing, Data Interpretation, and Database Usage in Genomic Era: The Road towards Fast-Track Crop Plant Improvement. Genetics Research International. , 684321 (2015).
- Nanjareddy, N., Arthikala, M. K., Blanco, L., Arellano, E. S., Lara, M. Protoplast isolation, transient transformation of leaf mesophyll protoplasts and improved Agrobacterium-mediated leaf disc infiltration of Phaseolus vulgaris: Tools for rapid gene expression analysis. BMC Biotechnol. 16 (1), 53 (2016).
- Pumplin, N., Zhang, X., Noar, R. D., Harrison, M. J. Polar localization of a symbiosis-specific phosphate transporter is mediated by a transient reorientation of secretion. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (11), E665-E672 (2012).
- Kryvoruchko, I. S., et al. MtSWEET11, a Nodule-Specific Sucrose Transporter of Medicago truncatula. Plant Physiol. 171 (1), 554-565 (2016).
- Suzaki, T., Yano, K., Ito, M., Umehara, Y., Suganuma, N., Kawaguchi, M. Positive and negative regulation of cortical cell division during root nodule development in Lotus japonicus is accompanied by auxin response. Development. 139 (21), 3997-4006 (2012).
- Suzaki, T., et al. Endoreduplication-mediated initiation of symbiotic organ development in Lotus japonicus. Development. 141 (12), 2441-2445 (2014).
- Qin, L., et al. The high-affinity phosphate transporter GmPT5 regulates phosphate transport to nodules and nodulation in soybean. Plant Physiol. 159 (4), 1634-1643 (2012).
- Wang, Z., Panfeng, L., Yan, Y., Chi, Y., Fan, B., Chen, Z. Expression and Functional Analysis of a Novel Group of Legume-specific WRKY and Exo70 Protein Variants from Soybean. Sci Rep. 6, 32090 (2016).
- Montiel, J., et al. A Phaseolus vulgaris NADPH oxidase gene is required for root infection by Rhizobia. Plant Cell Physiol. 53 (10), 1751-1767 (2012).
- Arthikala, M. K., et al. PvRbohB negatively regulates Rhizophagus irregularis colonization in Phaseolus vulgaris. Plant Cell Physiol. 54 (8), 1391-1402 (2013).
- Arthikala, M. K., Sánchez-López, R., Nava, N., Santana, O., Cárdenas, L., Quinto, C. RbohB a Phaseolus vulgaris NADPH oxidase gene, enhances symbiosome number, bacteroid size, and nitrogen fixation in nodules and impairs mycorrhizal colonization. New Phytol. 202 (3), 886-900 (2014).
- Barraza, A., et al. Down-regulation of PvTRE1 enhances nodule biomass and bacteroid number in the common bean. New Phytol. 197 (1), 194-206 (2013).
- Estrada-Navarrete, G., et al. An autophagy-related kinase is essential for the symbiotic relationship between Phaseolus vulgaris and both rhizobia and arbuscular mycorrhizal fungi. Plant Cell. 28 (9), 2326-2341 (2016).
- Nanjareddy, K., et al. A Legume TOR Protein Kinase Regulates Rhizobium Symbiosis and Is Essential for Infection and Nodule Development. Plant Physiol. 172 (3), 2002-2020 (2016).
- Frühling, M., Schröder, G., Hohnjec, N., Pühler, A., Perlick, A. M., Küster, H. The promoter of the Vicia faba L. gene VfEnod12 encoding an early nodulin is active in cortical cells and nodule primordia of transgenic hairy roots of Vicia hirsuta as well as in the prefixing zone II of mature transgenic V. hirsuta root nodules. Plant Science. 160 (1), 67-75 (2000).
- Szabados, L., Ratet, P., Grunenberg, B., de Bruijn, F. J. Functional analysis of the Sesbania rostrata leghemoglobin glb3 gene 5'-upstream region in transgenic Lotus corniculatus and Nicotiana tabacum plants. Plant Cell Online. 2 (10), 973-986 (1990).
- Madsen, L. H., Tirichine, L., Jurkiewicz, A., Sullivan, J. T., Heckmann, A. B., Bek, A. S., Ronson, C. W., James, E. K., Stougaard, J. The molecular network governing nodule organogenesis and infection in the model legume Lotus japonicus. Nat Commun. 12, 1-10 (2010).
- Montiel, J., Arthikala, M. K., Quinto, C. Phaseolus vulgaris RbohB functions in lateral root development. Plant Signal Behav. 8 (1), 1-3 (2013).
- Nanjareddy, K., Arthikala, M. K., Gómez, B. M., Blanco, L., Lara, M. Differentially expressed genes in mycorrhized and nodulated roots of common bean are associated with defense, cell wall architecture, N metabolism, and P metabolism. PLoS ONE. 12 (8), e0182328 (2017).
- Karimi, M., Inzé, D., Depicker, A. Gateway vectors for Agrobacterium-mediated plant transformation. Trends Plant Sci. 7 (5), 193-195 (2002).
- Broughton, W. J., Dilworth, M. J. Control of leghemoglobin synthesis in snake beans. Biochem J. 125 (4), 1075-1080 (1971).
- Jefferson, R. A. Assaying chimeric genes in plants, the GUS gene fusion system. Plant Mol Biol Rep. 5 (4), 387-405 (1987).
- Cho, H. J., Farrand, S. K., Noel, G. R., Widholm, J. M. High-efficiency induction of soybean hairy roots and propagation of the soybean cyst nematode. Planta. 210 (2), 195-204 (2000).
- Deng, Y., Mao, G., Stutz, W., Yu, O. Generation of Composite Plants in Medicago truncatula used for Nodulation Assays. J. Vis. Exp. (49), e2633 (2011).
- Kumagai, H., Kouchi, H. Gene silencing by expression of hairpin RNA in Lotus japonicus roots and root nodules. Mol Plant Microbe Interact. 16 (8), 663-668 (2003).
- Okamoto, S., Yoro, E., Suzaki, T., Kawaguchi, M. Hairy Root Transformation in Lotus japonicus. Bio-protocol. 3 (12), e795 (2013).
- Jacobs, T. B., Martin, G. B. High-throughput CRISPR Vector Construction and Characterization of DNA Modifications by Generation of Tomato Hairy Roots. J. Vis. Exp. (110), e53843 (2016).
- Estrada-Navarrete, G., et al. Agrobacterium rhizogenes-transformation of the Phaseolus spp.: a tool for functional genomics. Mol Plant Microbe Interact. 19 (12), 1385-1393 (2006).
