نقدم هنا لتكيف من الوضوح السلبي وأسلوب إعادة البناء ثلاثي الأبعاد للتصور المفرج المبيض وجرابي الشعيرات الدموية في المبايض سليمة الماوس.
المبيض هو الجهاز الرئيسي للجهاز التناسلي الإناث، وهو أمر أساسي لإنتاج الأمشاج الإناث ومراقبة النظام الغدد الصماء، ولكن العلاقات الهيكلية المعقدة وأبنية المفرج ثلاثي الأبعاد (3D) المبيض ليست وصفاً جيدا. من أجل تصور اتصالات ثلاثية الأبعاد والهندسة المعمارية من الأوعية الدموية في المبيض سليمة، الخطوة الهامة الأولى جعل المبيض واضح بصريا. تفاديا لانكماش الأنسجة، استخدمنا المائية الوضوح السلبي القائم على التثبيت (مسح الدهن-وتبادل جامدة تهجين الاكريلاميد “المائية الأنسجة” التصوير/إيمونوستينينج/في الموقع-التهجين-متوافق مع) البروتوكول طريقة لمسح مبيض سليمة . ثم استخدمت Immunostaining ومتقدمة مولتيفوتون المجهري [كنفوكل]، والصورة ثلاثية الأبعاد-عمليات إعادة البناء للتصور من سفن المبيض وجرابي الشعيرات الدموية. باستخدام هذا النهج، واظهرنا ارتباط إيجابي كبير (ف < 0.01) بين طول الشعيرات الدموية جرابي وحجم الجدار الحبيبي.
المسام هي الوحدة الأساسية الهيكلية والوظيفية المبيض، وتطويره عالية تتصل المفرج داخل المبيض. توفير التغذية والهرمونات للمسام الأوعية الدموية وهكذا تلعب أدواراً هامة في نمو ونضج المسام1.
مزيج من التكنولوجيات، بما في ذلك علامات الأوعية الدموية انتقائية ونماذج الماوس المعدلة وراثيا وتطوير الأدوية، ازدادت معرفتنا حول المبيض شبكات الأوعية الدموية والأوعية، ووظيفة الأوعية الدموية في فوليكولوجينيسيس. ومن المعروف المبيض جهازا نشطاً نظراً لأنه يعيد تشكيل مختلف شبكات الأوعية الدموية والأنسجة أثناء فوليكولوجينيسيس والاباضه. هذا يعيد البناء النشطة في حجم وهيكل السفن المطلوب للوظيفة البيولوجية لتطوير وتوظيف المسام.
الأساليب التقليدية في غذائها وهيستومورفوميتريك باستخدام المقاطع المبيض وإيمونولابيلينج من الأوعية الدموية تقتصر على صور ثنائية الأبعاد (2D)2. مع تطوير تكنولوجيات إعادة الإعمار (3D) ثلاثي الأبعاد، يمكن أن تتداخل الصور 2D لشرائح الأنسجة جعل هيكل ثلاثي الأبعاد، ولكن هذا الأسلوب لا يزال لديها بعض القيود – تقطيع الأنسجة يمكن أن تدمر المجهرية، بعض أجزاء الأنسجة غالباً ما تكون مفقودة، وعمالة كبيرة وتشارك في إجراء عمليات إعادة البناء ثلاثي الأبعاد من الصور التي تم الحصول عليها من الشرائح. كل الأنسجة التصوير ثلاثي الأبعاد مع الفحص المجهري [كنفوكل] يمكن التغلب على كثير من هذه القيود، ولكن هذه الأساليب محدودة في تقييم الأوعية في المبيض الجنينية3. يمكن استخدام أنسجة كله تطهير الطرق مثل الوضوح4 زيادة حجم تصور لحل هذه المشاكل في المبيضين بعد الولادة والكبار، ومثل هذه الأساليب تقديم موافقة الضوئية المبيض دون أي تشوهات هيكلية. تصوير بنية ثلاثية الأبعاد من المبيض سليمة توفر قاعدة بيانات صورة دقيقة للبرنامج تحليل الصور، مثل مجموعة إيماريس من البرامج المستخدمة في هذا العمل.
إعادة عرض المبيض طوال مرحلة البلوغ جزء من نظام ديناميكي الفسيولوجية، وهذا يجعل المبيض نموذجا ممتازا لإجراء تحقيقات في تنظيم الأوعية. وعلاوة على ذلك، يمكن دراسة تقييم دور المبيض الأوعية الدموية في ظروف مرضية من الجهاز التناسلي الإناث مثل متلازمة تكيس المبيض أو سرطان المبيض عن طريق تصوير أنسجة المبيض كله. تطوير أسلوب الوضوح السلبي واستعمال برمجيات تحليل الصور المتقدمة قدمت المعلومات المكانية المفصلة عن العلاقات بين هياكل المبيض مثل المسام والأوعية الدموية.
في الدراسة الحالية، ونحن نقدم 3D التصوير لتقييم العلاقات بين الشعيرات الدموية والمسام تنامي الفردية. في أعمالنا السابقة باستخدام البروتوكول نفسه 9، قمنا بدراسة أدوار المفرج الكبيرة، والتفاعلات بين المسام، وموقع المسام في المبايض سليمة الماوس. النهج الوضوح السلبي الذي سمح لن…
The authors have nothing to disclose.
وأيد هذه الدراسة من المنح المقدمة من “الصندوق الخاص الصيني” عن Postdocs (رقم 2014T70392 إلى يلافن)، مؤسسة العلوم الطبيعية الوطنية الصينية (رقم 81673766 إلى يلافن) والصندوق فتيلة المعلم الجديد، زوزو مؤسسة جامعة فودان، وتطوير المشروع الذروة شانغهاي التكاملية تخصصات الطب (20150407).
Acrylamide | Vetec | v900845 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/vetec/v900845 |
Alexa Flour 488 (Dilution 1:50) | Life Technologies | A11039 | https://www.thermofisher.com/antibody/product/Goat-anti-Chicken-IgY-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11039 |
Alexa Flour 594 (Dilution 1:50) | Life Technologies | A11012 | https://www.thermofisher.com/antibody/product/Goat-anti-Rabbit-IgG-H-L-Cross-Adsorbed-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11012 |
Bisacrylamide | Amresco | 172 | http://www.amresco-inc.com/BIS-ACRYLAMIDE-0172.cmsx |
Black wall glass bottom dish (Willco-Dish) | Ted Pella | 14032 | http://www.tedpella.com/section_html/706dish.htm#black_wall |
Boric acid | Sinopharm Chemical Reagent | 10004818 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10004818 |
Disodium hydrogen phosphate dodecahydrate (Na2HPO4 12H2O) | Sinopharm Chemical Reagent | 10020318 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10020318 |
FocusClear | Celexplorer | FC-102 | http://www.celexplorer.com/product_list.asp?MainType=107&BRDarea=1 |
Parafilm | Bemis | PM996 | http://www.parafilm.com/products |
Paraformaldehyde | Sinopharm Chemical Reagent | 80096618 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=80096618 |
PECAM1/CD31, platelet-endothelial cell adhesion molecule 1 (Dilution 1:10) | Abcam | ab28364 | http://www.abcam.com/cd31-antibody-ab28364.html |
Photoinitiator VA044 | Wako | va-044/225-02111 | http://www.wako-chem.co.jp/specialty/waterazo/VA-044.htm |
Sodium azide | Sigma | S2002 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/s2002?lang=en®ion=US |
Sodium chloride (NaCl) | Sinopharm Chemical Reagent | 10019318 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10019318 |
Sodium dihydrogen phosphate dihydrate (NaH2PO4 2H2O) | Sinopharm Chemical Reagent | 20040718 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=20040718 |
Sodium dodecyl sulfate | Sinopharm Chemical Reagent | 30166428 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=30166428 |
Sodium hydroxide (NaOH) | Sinopharm Chemical Reagent | 10019718 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10019718 |
Triton X-100 | Sinopharm Chemical Reagent | 30188928 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=30188928 |
Tyrosine hydroxylase (TH, Dilution 1:50) | Abcam | ab76442 | http://www.abcam.com/tyrosine-hydroxylase-phospho-s40-antibody-ab51206.html |