Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

שחזור תלת מימדי של הארכיטקטורה כלי הדם של השחלה העכבר בהירות-והפנים פסיבי

Published: December 10, 2017 doi: 10.3791/56141
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1
1Department of Integrative Medicine and Neurobiology, School of Basic Medical Sciences; Institutes of Brain Science, Brain Science Collaborative Innovation Center, State Key Laboratory of Medical Neurobiology, Institute of Acupuncture and Moxibustion, Fudan Institutes of Integrative Medicine, Fudan University, 2Program of Reproductive and Stem Cell Biology, Department of Obstetrics and Gynecology, Stanford University School of Medicine, Stanford University
* These authors contributed equally

Summary

כאן אנו מציגים עיבוד של בהירות פסיבי, שיטת שחזור תלת-ממד עבור ויזואליזציה של השחלות להערכת, נימים הזקיקים השחלות העכבר ללא פגע.

Abstract

השחלה הוא האיבר הראשי של מערכת הרבייה הנשית, חיוני לייצור של גמטות הנשי ולבקרה המערכת האנדוקרינית, אבל את מערכות היחסים המורכבות מבני תלת מימד (3D) להערכת ארכיטקטורות של השחלה מתוארים לא טוב. על מנת להמחיש את חיבורי 3D ואדריכלות של כלי הדם בשחלה ללא פגע, הצעד החשוב הראשון היא להפוך את השחלה שטיחות ברורה. כדי למנוע התכווצות של רקמות, היינו את הידרוג המבוסס על קיבוע בהירות פסיבי (החלפת השומנים נקה קשיח hybridized אקרילאמיד הידרוג רקמות הדמיה / Immunostaining/ב באתרו הכלאה-תואם) פרוטוקול השיטה כדי לנקות שחלה ללא פגע . Immunostaining קונפוקלית multiphoton מתקדמות, תמונות 3D-שחזורים ואז שימשו את הפריט החזותי של כלים השחלות נימים הזקיקים. באמצעות גישה זו, אנחנו הראו מתאם חיובי משמעותי (P < 0.01) בין האורך נימים הזקיקים, נפח של הקיר הזקיקים.

Introduction

הזקיק הוא יחידת מבניים ופונקציונליים של השחלה, התפתחותו קשורה מאוד להערכת בתוך השחלה. כלי הדם לספק תזונה והורמונים לנשירה, וכך לשחק תפקידים חשובים גדילה, התבגרות של זקיקי1.

שילוב של טכנולוגיות, כולל כלי דם סלקטיבי סמני עכבר הטרנסגניים מודלים, פיתוח פרמצבטי, הגדילו את הידע שלנו אודות רשתות כלי דם השחלות, אנגיוגנזה את תפקוד כלי הדם folliculogenesis. השחלה מכונה איבר פעיל כי זה remodels שונים רקמות, רשתות כלי דם במהלך folliculogenesis, ביוץ. כזה שיפוץ פעיל ב גודל ומבנה של כלי נדרש עבור הפונקציה הביולוגי של פיתוח, גיוס זקיקים.

שיטות היסטולוגית ו histomorphometric מסורתיות באמצעות סעיפים השחלות ו immunolabeling של כלי הדם מוגבלות דו-ממדית (תמונות דו-ממד)2. עם התפתחות טכנולוגיות שחזור תלת מימדי (3D), תמונות דו-ממד של רקמות פרוסות יכול להיות חופף כדי להפוך מבנה תלת-ממדי, אך לשיטה זו יש עדיין כמה מגבלות — חלוקתה של הרקמה יכול להרוס את מזערים, חלקים מסוימים לעתים קרובות חסרים רקמות, עבודה משמעותית מעורב בביצוע שחזורים תלת-ממדיים מתמונות המתקבל פרוסות. כל רקמה הדמיה תלת-ממדית עם מיקרוסקופיה קונפוקלית יכול להתגבר על רבות מההגבלות הללו, אך שיטות אלה מוגבלות להערכת אנגיוגנזה של השחלה עובריים3. השימוש ברקמה כל ניקוי שיטות כגון בהירות4 יכול להגביר את עוצמת מטמיעים כדי לפתור את הבעיות האלה של השחלות כמחנכת, למבוגרים, שיטות כאלה לספק אישור אופטי של השחלה ללא כל העיוותים מבנית. הדמיה של הארכיטקטורה תלת-ממד של השחלה שלם מספק מסד נתונים של תמונה מדויקת עבור תוכנת ניתוח התמונה, כגון חבילת התוכנה Imaris נעשה שימוש בעבודה זו.

שיפוץ של השחלה ברחבי לבגרות הוא חלק מערכת פיזיולוגית דינאמית, וזה יהפוך השחלה מודל מצוין עבור חקירות ברגולציה של אנגיוגנזה. יתר על כן, להעריך את התפקיד של כלי הדם השחלות בתנאים פיפטות של מערכת הרבייה הנשית כגון תסמונת שחלות פוליציסטיות או סרטן השחלות יכול להילמד דרך רקמות השחלה כל הדמיה. הפיתוח של שיטת בהירות פסיבית ושימוש של תמונה מתקדם ניתוח תוכנה סיפקו מידע מרחבי מפורט על הקשרים בין כלי הדם ולא השחלה מבנים כמו זקיקי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

בכל ההליכים הכרוכים בנושאים בעלי חיים אחרי ההנחיות של ועדת האתיקה חיה בשנחאי מדיקל קולג ', אוניברסיטת פודאן (אישור מספר 20160225-013).

1. הכנת השחלה העכבר שקוף

  1. אופן ההכנה של פתרונות
    1. להכין תמיסת מלח באגירה פוספט (PBS) פתרון (1 מ', pH 7.6) עם 0.1% טריטון X-100 (PBST). כדי להפוך את 1 ליטר של פתרון מניות PBS x 10, לערבב 87 גר' NaCl, 3.1 גר' NaH2PO4 · 2H2O ו- 28.7 גר' נה2HPO4 ·12H2O. להוסיף dH2O ל- 1 L ומערבבים ~ 2 ה התאם ל pH 7.4 עם 1 N NaOH ולאחסן בטמפרטורת החדר. לדלל את הפתרון מניות 10 x 1/10 באמצעות dH2O ובצע 0.1% X-100 Triton ב- PBS.
    2. להכין את הפתרון הידרוג (pH 7.5) על ידי mixings 4% (wt/כרך) paraformaldehyde (PFA) פתרון, 4% (wt/כרך) אקרילאמיד, bisacrylamide 0.05% (wt/כרך) ו- 0.25% (wt/כרך) יוזם VA-044 במים מזוקק פעמיים על קרח.
    3. הכן את פתרון סליקה (pH 8.5) על ידי ערבוב נתרן בוראט 200 מ"מ מאגר המכיל 4% (wt/כרך) dodecyl סולפט נתרן (מרחביות) במים מזוקק פעמיים.
  2. הכנה זלוף, השחלה Transcardial
    1. לשמור על כל הפתרונות על קרח במהלך כל ההליכים.
    2. עזים ומתנגד למבוגרים נקבה פראי סוג העכבר C57BL/6 עם זריקה בקרום הבטן של פתרון פנטוברביטל (0.35 מ ג/ק ג). ברגע זה מראה שום תגובה הבוהן-קורט, העכבר הוא מורדם כראוי.
    3. שימוש בסרט. הדביק לתקן את העכבר עם הגפיים שרוע על לוח שטוח מוקצף.
    4. לחשוף את הלב על ידי חתך על הסרעפת דרך החזה, עור, עצמות עם מספריים.
    5. בחתך אל העלייה הימנית של החיה ולאחר מכן perfuse החדר השמאלי עם 20 מ של PBS קר כקרח 1 x ב- 10 מ ל/דקה.
    6. Perfuse החיה לפחות 20 מ"ל של הידרוג פתרון ב- 10 מ ל/דקה.
    7. תחתכי את העור מעל הבטן לאורך הקו medioventral עם מספריים, שחושף את כל enterocoelia, ולהסיר את המעיים. לאסוף את השחלות, כמו גם הרחם כדי לשמור על היושרה של מורפולוגיה השחלות.
    8. הסר את רקמות השומן סביב השחלה תחת מיקרוסקופ.
  3. Degassing
    1. מקם את השחלות 10 מ ל תמיסת הידרוג ב 4 ° C עבור קיבעון במשך 3 ימים.
    2. העברת השחלה לתוך צינור 5-mL ולמלא את הצינור עם הידרוג פתרון. למתוח את מצלמות-מיקרוסקופים מעל החלק העליון של הצינור, ואז לעטוף מצלמות-מיקרוסקופים סביב צווארה של הצינור.
      התראה: ודא כי ישנם אין בועות בין מצלמות-מיקרוסקופים את הפתרון הידרוג.
    3. מניחים את הצינורית על מטרף בחממה ב 37 מעלות צלזיוס לכל היותר 3 שעות כדי לאפשר את הידרוג פולימריזציה.
    4. להסיר את השחלה של הג'ל בעזרת מרית, בזהירות להסיר את הג'ל עודף מ סביב השחלה על ידי נייר טישו. לשטוף את השחלה ארבע פעמים עם 1 x PBS.
  4. סליקה פסיבי
    1. להטביע את השחלה ב 10 מ"ל של הפתרון סליקה. מנערים בעדינות על סל ד 80 ב 37 ° C כדי להתחיל את תהליך ניקוי.
    2. בשבוע הראשון, לשנות את הפתרון כל 3 ימים. אחרי שבוע אחד, לרענן את פתרון סליקה לאחר שבוע עד השחלה נעשה ברור. בדרך כלל תהליך זה לוקח כ- 2-3 שבועות.
      הערה: השחלה ניתן ישירות immunostained או יכול להיות מאוחסן אזיד הנתרן (0.02%) ב- PBS ב 4 מעלות צלזיוס במשך מספר שבועות לפני immunostaining.

2. Immunostaining

  1. לשטוף את השחלה פעמיים ב PBST ביום 1-37 מעלות צלזיוס על מטרף.
  2. דגירה השחלה על מטרף בפתרון נוגדנים ראשי/PBST (טבלה 1) על יום 2-3-37 מעלות צלזיוס. העבודה המוצגת כאן, הנוגדנים העיקרי היו תאי אנדותל-טסיות אדהזיה מולקולה 1 (CD31), טירוזין hydroxylase מדולל ב 1:10 ו- 1:50 ב- PBST, בהתאמה.
    התראה: אם שניים או יותר סוגים של נוגדן ראשוני משמשים, ודא כי ישנם מקורות בעלי חיים שונים.
  3. לשטוף הנוגדנים הראשי באמצעות מאגר PBST ב 37 מעלות צלזיוס ביום 4 על מטרף.
  4. דגירה השחלה עם נוגדנים משניים הרצוי ב- PBST-יום 5-6-37 מעלות צלזיוס על מטרף. העבודה המוצגת כאן, הנוגדנים משני היו אלכסה הקמח 488 טירוזין hydroxylase, אלכסה הקמח 594 עבור CD31 מדולל 1:50 ב- PBST.
  5. לשטוף את הנוגדנים משני עם מאגר PBST ב 37 מעלות צלזיוס ביום 7 על מטרף.
  6. להעביר את הרקמה לתוך שבירה התאמת פתרון שבירה המגון ביום 8. לשים את הרקמה על פיסת נייר עם קווי רשת כדי לבדוק את בהירות חזותית על-ידי בדיקה אם ניתן לראות את קווי הרשת. ברגע הרקמה יש מלא הובהרו, זה יכול לדימות.
  7. להפוך גליל putty יכול רק המקיף את הרקמה, לעצב אותם לצורת פרסה ואז הקש על הרכס החיצוני בחוזקה על זכוכית כדי להפוך חלל אטום. הגובה של הטיט צריך להיות גבוה יותר השחלה.
  8. למקם את השחלה מובהר בזהירות לתוך המרכז של הטיט ולהוסיף שבירה התאמת פתרון. לשים קערת זכוכית-התחתון מעל הטיט בחוזקה ולהשתמש פוטי לתקן את המנה.

3. מיקרוסקופיה קונפוקלית

  1. עבור הדמיה עם מיקרוסקופ קונפוקלי, שבלוח "ני-E" לבחור את העדשה (ב זה מקרה טבילה במי 25 X עדשה אובייקטיבי, 1.1-נה, מ מ 2-WD) עם המרחק עובד תקין (במ מ 2.0 במקרה הזה).
  2. בחלונית ' "רכישת" ', בחר את מספר הערוצים. . כאן, להשתמש בשלושה ערוצי.
    1. תחילה, השתמש הכרטיסיה "עין יציאה" והיא הג'ויסטיק בקר XY כדי לעבור את הרקמה במרכז השדה על-ידי בדיקה דרך עיניות מיקרוסקופ.
    2. לאחר כיבוי האור תריס, לחץ על הכרטיסיה "חי" כדי להתאים את "כוח לייזר", "HV (רווח)", ו "היסט" עבור כל ערוץ בנפרד. כוח עליון לייזר ו- HV יכול להוביל אותות גבוה יותר, היסט גבוה יותר יכול להפחית את רעשי הרקע.
    3. בחר את נאות "גודל סריקה" ואת "ספירה". השתמש גודל סריקה של 1024 x 1024 מיקרומטר2 ספירה של 4 עד 8.
  3. לאחר הגדרת איכות התמונה להגדרת עומק הרקמה בחלונית "Z בעוצמה correction", לאחר איתור העדשה ברובד העליון של השחלה (במרכז של הרקמה) והזזת הרכישה עבור השכבה העליונה, לחץ על "פלוס" לחצן כדי להגדיר את השכבה העליונה.
    1. להזיז את העדשה, להגדיר את HV מתאימה ואת עוצמת הלייזר על החלק התחתון של הרקמה ולהוסיף את המידע השכבה הנמוכה ביותר אל הטבלה תיקון Z-עוצמת. לחץ על "כדי ND" כדי לסנכרן את ההגדרה עם הפאנל "ND רכישה".
  4. בתוך "ND הרכישה" פנל, הסט הראשון מספר סריקה צעדים. לאחר מכן, לתקתק את הכרטיסיות "Z" ו- "תמונה גדולה".
    1. . לך לחלון 'סריקה תמונה גדולה' כדי להגדיר את גודל השדה לפי הגבול של הרקמה בעזרת ויזואליזציה רקמות דרך עיניות לחזור ללוח "ND רכישה" קלט את גודלו של אזור הסריקה ("שדות") ובחרו את החפיפה בין 10% ל-15%.
    2. לחץ על "הפעל Z correction", לא "תברח עכשיו", באופן אוטומטי לקבוע את נאות HV, עוצמת הלייזר, ההיסט עבור כל שכבה, ולחכות התמונה כדי לעבד.

4. 3D שחזור של זקיקי בודדים, Vasculatures שלהם

  1. תחילה, השתמש ImageJ5 כדי לפתוח את הקובץ המקורי ש ח. לחץ על הלחצן 'תמונה' ובחרו את "צבע" ואת 'פצל ערוצים'. לאחר מכן, לחץ על "קובץ", בנפרד לשמור את הערוצים כסידרה קובץ tiff באמצעות האפשרות "רצפי תמונות" ב- "שמירה בשם".
  2. השתמש Imaris כדי לפתוח את אחת מהאפשרויות הסדרה קובץ tiff. לחץ על כפתור "ערוך" ובחר באפשרות "הוסף ערוצים" כדי להוסיף את שאר הערוצים. הכרטיסיות "התאמת התצוגה" יכול לשנות את השם ואת הצבע של הערוץ. העובי של הרקמה ייתכן שיהיה עליך לתקן בחלונית 'תמונות מאפיינים' ברשימה הנפתחת תחת "עריכה".
  3. חיתוך תלת-ממד של תמונות הסופי, הסרה של חלקים עודף, לחץ על כפתור "ערוך" ובחר "חיתוך 3D". ניתן לכוונן את הגודל של השדה על-ידי גרירת הגבול.
  4. לשחזר את האותות כלי עם האלגוריתם חוטים בחלונית ' Surpass ', לחץ על לחצן "חוטים" כדי ליצור נימה חדשה ולחץ על הבא.
    1. על מנת להגדיר הגדול ביותר של הקוטר הדק, ללוח "פרוסה" ומצא את הספינה העקיבה. המרחק יוצגו באופן אוטומטי על הלוח "מדידה" על-ידי בחירת שתי נקודות-הרוחב המרבי של כלי השיט.
    2. חזור ללוח "Surpass", קלט את רוחב מדוד ולחץ על הבא.
  5. התאם את סף נקודת המוצא ואת הזרע. בחלונית ' "המצלמה" ', בחרו 'בחר'. אם חלק הכדורים באופן אוטומטי המיוצרים צורך להסיר, הקש shift ולחץ על הנקודה. על ידי בחירת "לנווט" ולאחר הזזת העכבר, ניתן לסובב את המבנה על מנת להבטיח כי כל הנקודות הנכונות שלו נשמרו ולאחר מכן לחץ על הבא.
  6. לבחור את הסף הגבוה ביותר עבור הניגוד מקומי, לחץ על הבא. לא בחר "לזהות קוצים" ולהמשיך לסיים את השחזור של הגליל כלי דם. ניתן לערוך את הצבע על ידי לחיצה על הכרטיסיה "צבע". הנתונים הסטטיסטיים ניתן לחלץ שבחלונית "סטטיסטיקת" של חוט הלהט המשוחזרת. ניתן להסיר חלקים עודף שבלוח "עריכה".
    הערה: אלגוריתמים אחרים יכול לשמש למדידת הנפח של זקיקי הכולל או קירות הזקיקים. עבודה המוצגת כאן, oocytes סומנו על ידי autofluorescence של שני נוגדנים משניים. בגלל כמות גדולה של נתונים, שרת העבודה שימשה ניתוח הנתונים.

5. ניתוח סטטיסטי

הערה: נתוני ניתוח התמונה מוצגים כפי שאומר ± תקן שגיאות.

  1. לבצע השוואות בין הזקיקים באמצעות דגימת עצמאית-t-test, והשתמש מבחן המתאם של פירסון להשוות מקדמי המתאם של קיר הזקיקים ואורך נימי. להגדיר ערך של P < 0.05 כמגבלת מובהקות סטטיסטית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

אנחנו ששולבו שיטת בהירות פסיבי שיטה מהירה ופשוטה השחלה פסיבי ניקוי תוך שמירה על האדריכלות הזקיקים ואת כלי הדם וקבלת ניאון האות הגבוה ביותר של סמנים שכותרתו של כלי זקיקים. הארכיטקטורה תלת-ממד של הזקיקים להערכת נקבע על-ידי immunostaining עבור CD31, סמן תאי אנדותל6. CD31 מכתים השחלות של עכברים בוגרים היה לעקוב אחריו באמצעות האלגוריתם פילמנט והראה את יחסי הגומלין בין נימים זקיקים זקיקים יסודי ותיכון (איור 1).

נקודת השינוי ואת פני אלגוריתמים שימשו כדי לזהות את טירוזין hydroxylase-immunostained oocytes, granulosa ושכבות thecal וכדי לחשב את הנפח הכולל של זקיקי7,8. בגלל הדחיסה של הזקיקים, חלקים מסוימים של זקיקי החתוכה אותרו חצי ידנית. לאחר שינוי מקום של נפח הזקיקים בודדים, oocytes, שיקום השטח של השכבות קיר הזקיקים ושיחזור נימה של כלי, לנקות את קשרי הגומלין בין הפרט vasculatures הזקיקים והשני מדדי נמדד, במיוחד granulosa ואמצעי אחסון thecal שכבה, נצפו (איור 2).

Figure 1
איור 1 : דימות ברזולוציה של שחלה העכבר למבוגרים ללא פגע לאחר ניקוי עם פרוטוקול בהירות פסיבי מותאם. (A-B) XYZ ומקטעים גדולים-scan רכישה. שלושת ממדי (3D) חתוכה משנית (ג) ו- (ד) ראשי זקיקים (שורה עליונה) ו 3D שיחזר נימים, oocytes ו granulosa/thecal תאים של הזקיק באותו (שורה תחתונה) מוצגות כפי שזוהו על ידי חוט הלהט, פני השטח, ו במקום שינוי אלגוריתמים. גודל ברים = 200 מיקרומטר (A-B), 50 מיקרומטר (ג), 30 מיקרומטר (D).  אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2 : מדדי השוואתית של קשרי הגומלין בין זקיקי השחלה והמשניים שלהם vasculatures. האחסון oocyte (א) היה שחולצו לאחר שחזורים תלת-ממד של oocytes בתוך זקיקי בודדים כפי שנקבע על ידי האלגוריתם שינוי מקום ונפח הזקיקים, האחסון קיר הזקיקים (B) נקבע על ידי פני אלגוריתם של הנימים שנקשרו על ידי האלגוריתם נימה. אמצעי האחסון הזקיקים (C), היחס אורך אמצעי האחסון/נים oocyte (D), היחס אורך אמצעי האחסון/נים קיר הזקיקים (E), היחס בין אורך אמצעי האחסון הזקיקים/נים (F), אורך צינור קפילר (H), ו המתאם של נימי אורך ונפח קיר הזקיקים (G) חושבו באמצעות הכלים המתאימים בחבילת התוכנה. קווי שגיאה מייצגים את השגיאות תקן של האמצעים. n = 6; * P < 0.05; * * P < 0.01. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: שחזור תלת מימדי של הנימים בתוך זקיקי השחלה העכבר המשני. כאן מתגלה חלל מעל הצד oocyte של הזקיקים (ריבועים לבנים מראים את גבולות המרחב). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

במחקר הנוכחי, אנו מציגים 3D הדמיה כדי להעריך את קשרי הגומלין בין נימים זקיקים גידול בודדים. בעבודה הקודמת שלנו באמצעות פרוטוקול זהה 9, למדנו את התפקידים של להערכת גדולים, האינטראקציות בין זקיקים, ואת המיקום של זקיקים של השחלות העכבר ללא פגע. הגישה בהירות פסיבי אפשר לנו ללמוד מיקרו, מאקרו vasculatures folliculogenesis, את יחסי הגומלין בין הקורפוסים lutea זקיקים גם כן כדי לשחזר את הארכיטקטורה השחלות בשלבים התפתחותיים שונים.

כדי לקבל תמונה תלת-ממדית נתונים של רקמות ללא פגע, תהליך ניקוי הוא הצעד החשוב הראשון. ישנן שתי אסטרטגיות הראשי – התייבשות שיטות ושיטות הידרופילית מבוססי ריאגנט, כגון בהירות פסיבי10. בגלל התייבשות שיטות לעיתים קרובות להוביל לירידה אותות פלואורסצנט לעיתים קרובות לייצר פסולת רעילה פתרון אורגני, אנחנו התמקדו תשומת ליבנו פישוט כמה צעדים של שיטת בהירות פסיבי לשימוש עם סוגים שונים של רקמות.

ההליך הראשון קריטי בתהליך ניקוי הוא זלוף transcardial. במהלך זלוף, הדופק ממלא תפקיד חשוב מחזור לכל הגוף PBS הידרוג פתרון, אשר ניתן לשטוף את הדם על מנת להקטין את רקע זריחה. לפיכך, הניתוח זלוף צריכה להתבצע במדויק, במהירות כדי להימנע מותו בטרם-עת של החיה לפני הידרוג לחלוטין והכהים החיה. כל הסוכנים חייב להישמר בקירור במהלך הניסוי כולו, כפי שהוזכר על ידי ליאנג. et al. 11, או יתחיל פולימריזציה לפני זלוף השלמת. השלב החשוב הבא מסיר את הידרוג, יש צורך להסיר ככל ג'ל הרבה עודף ככל האפשר כי זה יהיה לשמור על נוגדנים. ברגע הרקמה אינה מסומנת, הוא צריך להיות מוסר את פתרון סליקה, המאוחסן ב- PBS ב 4 ° C כי מדי זמן בפתרון ניקוי יגרום מדי חלבון ללכת לאיבוד. במיקרוסקופיה קונפוקלית ההדמיה, Z-ההגדרות צריך תמיד להיות מוגדר לפני הטווח X-Y. אם הטווח X-Y מוגדרת קודם, לא תהיה אפשרות לסנכרן את Z-ההגדרות למגרש X-Y כולו.

בהירות פסיבי הוצג לראשונה על ידי היאנג. et al. 12 בפרוטוקול שלהם, הם לא ביצעה את הצעד זלוף, במקום degassed עם חנקן. בנוסף, פתרון סליקה שלהם לא כללו bisacrylamide בפתרון הידרוג הם בשימוש מרחביות 8% פתרון סליקה, הם השתמשו חישוקים שבירה התאמת מדיה. שיטה זו היה משופר לאחר מכן על ידי הגדלת ריכוז מרחביות13הוספת השלב זלוף, נטולת חנקן degassing הליך14, שילוב שיטת עם שיטות ניקוי אחרות כגון PARS-mPACT15. כאן, בהמשך פיתחנו הפרוטוקול על ידי שילוב של transcardial זלוף, נטולת חנקן degassing, הפחתת זמנים תוססים בפתרון סליקה ל- 4% שימוש FocusClear השבירה התאמת מדיה, אשר מספק איכותיות תמונות מיקרוסקופ.

לאחר בהירות פסיבי, מיקרוסקופ multiphoton קונאפוקלית וניתוח התמונה יכולה להתבצע כדי להשיג הארכיטקטורה 3D שלם של להערכת הזקיקים בשחלות. פרוטוקול זה המרות של השחלה שלם ללא-אור חדיר לטופס nanoporous hybridized הידרוג שטיחות שקוף המתאים לחדירה על ידי מקרומולקולות כגון נוגדנים16. בניגוד ניתוח קלאסי 2D היסטולוגית ומדפים, בהירות פסיבי, מכתים עם סמנים ספציפי מאפשר מיפוי תלת-ממד של קשרי הגומלין בין נימים ו זקיקי גידול בודדים.

ברקמות למבוגרים, פעיל וסקולרית ואבו אנגיוגנזה בעיקר מתרחשת במהלך תהליכים פתולוגיים כגון ריפוי הפצע, תיקון שבר, גידול ותצורות גרורות, retinopathies, fibroses, דלקת מפרקים שגרונית17. עם זאת, שינויים מחזוריים במהלך folliculogenesis מייצגים קיבולת ייחודית להערכת החנות בשיפוצים. לאחר היווצרות antrum בתוך זקיקי משני, נוזל הזקיקים ממלא אותו, המקיף את oocyte, אשר מספק של microenvironment מתאים oocyte התבגרות התפתחות הזקיקים18. 2D הקודם הדמיה מחקרים הראו כי זקיקי השחלה מוקפים רשת של כלי דם theca interna19. השכבה granulosa nonvascular, כל זקיק מוקף נימים משלו. בקנה אחד עם התפקיד החיוני של CD31 vasculogenesis6, מצאנו עלייה באורך נימי במהלך folliculogenesis ב המעבר העיקרי משני זקיקים (דמויות 2G ו- 2 H). במקום התפלגות אקראית של נימים סביב זקיקי ראשית או משנית בודדים, שחזור תלת-ממד של נימים הדגימו כי ענפים נימי מופץ בזקיקים היו לזיהוי של זקיקים גדולים יותר, וברוב המקרים האלה סניפים נימי נוצר חלל (איור 3).

אחד הדאגה העיקרית היא השיטה מותאם לוקח זמן רב יחסית כדי לנקות את השחלה, אבל זמן רב נדרש ניקוי השפעה לטובה. כדי לחסוך זמן, אנו ממליצים איסוף כל הדגימות הדרוש בעת ובעונה אחת ומפנה אותם ביחד כי ניתן לאחסן הרקמות שנוקה אזיד הנתרן PBS ו- 0.02% ב 4 מעלות צלזיוס למשך מספר חודשים. מגבלה נוספת היא המרחק עבודה של מיקרוסקופ קונפוקלי. ההגדלה גבוה יותר אובייקטיבי עדשות יש מרחק עבודה, אשר יכול להיות מכשול עבור הדמיה של דגימות עבה.

מספר פרוטוקולים הוכנסו עבור ההדמיה של רקמות שקוף ללא פגע, כולל באב20, סולם21, 3DISCO22, ClearT23, SeeDB24, בהירות16, בהירות פסיבי (עם4 או בלי הידרוג25), ברית12, מעוקב26,27, FASTClear28, ואת העובדה29, אך רק שלושה מהם שימשו רקמות השחלה כל ניקוי והערכה9, 30,31. SeeDB30 ו ScaleA231 הוכנסו עבור הדמיה של רקמות השחלות לגמרי, אבל פרוטוקולים אלה אפשר רק צעד אחד immunostaining. בהירות פסיבי, מאפשר אולם, תגובות תיוג-חלבון מרובות, כפי שמוצג במחקר הנוכחי של המחקר הקודם שלנו9.

לסיכום, פרוטוקול שלנו מותאם לקביעת הקשר המבני 3D בין שכבות הזקיקים כלי הדם באמצעות רקמות השחלה שקופה לגמרי מספק גישה חדשה ללמוד אנגיוגנזה מחלות השחלות שונות כגון תסמונת השחלות הפוליציסטיות, סרטן השחלות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

מחקר זה נתמך על ידי מענקים מקרן מיוחד סינית עבור והפוסט-דוקטורנטים (2014T70392 מס כדי YF), את נבחרת מדעי הטבע קרן של סין (81673766 מס כדי YF), הקרן החדשה הטרמה המורה, היסוד Zuoxue של אוניברסיטת פודאן (fudan), לבין ההתפתחות פרויקט לרפואה אינטגרטיבית-דיסציפלינות שיא שנגחאי (20150407).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acrylamide Vetec v900845 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/vetec/v900845
Alexa Flour 488 (Dilution 1:50)  Life Technologies A11039 https://www.thermofisher.com/antibody/product/Goat-anti-Chicken-IgY-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11039
Alexa Flour 594 (Dilution 1:50) Life Technologies A11012 https://www.thermofisher.com/antibody/product/Goat-anti-Rabbit-IgG-H-L-Cross-Adsorbed-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11012
Bisacrylamide Amresco 172 http://www.amresco-inc.com/BIS-ACRYLAMIDE-0172.cmsx
Black wall glass bottom dish (Willco-Dish) Ted Pella 14032 http://www.tedpella.com/section_html/706dish.htm#black_wall
Boric acid Sinopharm Chemical Reagent 10004818 http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10004818
Disodium hydrogen phosphate dodecahydrate (Na2HPO4 12H2O) Sinopharm Chemical Reagent 10020318 http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10020318
FocusClear Celexplorer FC-102 http://www.celexplorer.com/product_list.asp?MainType=107&BRDarea=1
Parafilm Bemis PM996 http://www.parafilm.com/products
Paraformaldehyde Sinopharm Chemical Reagent 80096618 http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=80096618
PECAM1/CD31, platelet-endothelial cell adhesion molecule 1 (Dilution 1:10) Abcam ab28364 http://www.abcam.com/cd31-antibody-ab28364.html
Photoinitiator VA044 Wako va-044/225-02111 http://www.wako-chem.co.jp/specialty/waterazo/VA-044.htm
Sodium azide Sigma S2002 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/s2002?lang=en&region=US
Sodium chloride (NaCl) Sinopharm Chemical Reagent 10019318 http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10019318
Sodium dihydrogen phosphate dihydrate (NaH2PO4 2H2O) Sinopharm Chemical Reagent 20040718 http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=20040718
Sodium dodecyl sulfate Sinopharm Chemical Reagent 30166428 http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=30166428
Sodium hydroxide (NaOH) Sinopharm Chemical Reagent 10019718 http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10019718
Triton X-100 Sinopharm Chemical Reagent 30188928 http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=30188928
Tyrosine hydroxylase (TH, Dilution 1:50) Abcam ab76442 http://www.abcam.com/tyrosine-hydroxylase-phospho-s40-antibody-ab51206.html

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brown, H. M., Russell, D. L. Blood and lymphatic vasculature in the ovary: development, function and disease. Hum Reprod Update. 20 (1), 29-39 (2014).
  2. McFee, R. M., et al. Inhibition of vascular endothelial growth factor receptor signal transduction blocks follicle progression but does not necessarily disrupt vascular development in perinatal rat ovaries. Biol Reprod. 81 (5), 966-977 (2009).
  3. Coveney, D., Cool, J., Oliver, T., Capel, B. Four-dimensional analysis of vascularization during primary development of an organ, the gonad. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (20), 7212-7217 (2008).
  4. Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nat Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).
  5. Schindelin, J., et al. Fiji: an Open Source platform for biological image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  6. Cao, G., Fehrenbach, M. L., Williams, J. T., Finklestein, J. M., Zhu, J. X., Delisser, H. M. Angiogenesis in platelet endothelial cell adhesion molecule-1-null mice. Am J Pathol. 175 (2), 903-915 (2009).
  7. Manni, L., Holmäng, A., Lundeberg, T., Aloe, L., Stener-Victorin, E. Ovarian expression of alpha (1)- and beta (2)-adrenoceptors and p75 neurotrophin receptors in rats with steroid-induced polycystic ovaries. Auton Neurosci. 118 (1 - 2), 79-87 (2005).
  8. Chourasia, T. K., Chaube, R., Singh, V., Joy, K. P. Annual and periovulatory changes in tyrosine hydroxylase activity in the ovary of the catfish Heteropneustes fossilis. Gen Comp Endocrinol. 166 (1), 111-116 (2010).
  9. Feng, Y., et al. CLARITY reveals dynamics of ovarian follicular architecture and vasculature in three-dimensions. Sci Rep. 7, 44810 (2017).
  10. Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. Chemical principles in tissue clearing and staining protocols for whole-body cell profiling. Annu Rev Cell Dev Biol. 32, 713-741 (2016).
  11. Liang, H., Schofield, E., Paxinos, G. Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique. J Vis Exp. (108), e53673 (2016).
  12. Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
  13. Phillips, J., Laude, A., Lightowlers, R., Morris, C. M., Turnbull, D. M., Lax, N. Z. Development of passive CLARITY and immunofluorescent labelling of multiple proteins in human cerebellum: understanding mechanisms of neurodegeneration in mitochondrial disease. Sci Rep. 6, 26013 (2016).
  14. Roberts, D. G., Johnsonbaugh, H. B., Spence, R. D., MacKenzie-Graham, A. Optical clearing of the mouse central nervous system using passive CLARITY. J Vis Exp. (112), (2016).
  15. Woo, J., Lee, M., Seo, J. M., Park, H. S., Cho, Y. E. Optimization of the optical transparency of rodent tissues by modified PACT-based passive clearing. Exp Mol Med. 48 (12), e274 (2016).
  16. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
  17. Chung, A. S., Ferrara, N. Developmental and pathological angiogenesis. Annu Rev Cell Dev Biol. 27, 563-584 (2011).
  18. Rodgers, R. J., Irving-Rodgers, H. F. Formation of the ovarian follicular antrum and follicular fluid. Biol Reprod. 82 (6), 1021-1029 (2010).
  19. Siu, M. K. Y., Cheng, C. Y. The blood-follicle barrier (BFB) in disease and in ovarian function. Adv Exp Med Biol. 763, 186-192 (2014).
  20. Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nat Methods. 4, 331-336 (2007).
  21. Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).
  22. Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat Protoc. 7, 1983-1995 (2012).
  23. Kuwajima, T., et al. Clear(T): a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140, 1364-1368 (2013).
  24. Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat Neurosci. 16, 1154-1161 (2013).
  25. Lai, H. M., et al. Rationalisation and validation of an acrylamide-free procedure in three-dimensional histological imaging. PLOS ONE. 11, e0158628 (2016).
  26. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157, 726-739 (2014).
  27. Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159, 911-924 (2014).
  28. Liu, A. K. L., Lai, H. M., Chang, R. C. C., Gentleman, S. M. Free-of-acrylamide SDS-based tissue clearing (FASTClear): A novel protocol of tissue clearing for three-dimensional visualisation of human brain tissues. Neuropathol Appl Neurobiol. 43, 346-351 (2016).
  29. Xu, N., et al. Fast free-of-acrylamide clearing tissue (FACT)-an optimized new protocol for rapid, high-resolution imaging of three-dimensional brain tissue. Sci Rep. 7, 9895 (2017).
  30. Migone, F. F., Cowan, R. G., Williams, R. M., Gorse, K. J., Zipfel, W. R., Quirk, S. M. In vivo imaging reveals an essential role of vasoconstriction in rupture of the ovarian follicle at ovulation. Proc Natl Acad Sci U S A. 113, 2294-2299 (2016).
  31. Malki, S., Tharp, M. E., Bortvin, A. A whole-mount approach for accurate quantitative and spatial assessment of fetal oocyte dynamics in mice. Biol Reprod. 93 (113), (2015).

Tags

הנדסה ביו-רפואית גיליון 130 שחזור תלת מימדי להערכת בהירות פסיבי עכבר השחלה
שחזור תלת מימדי של הארכיטקטורה כלי הדם של השחלה העכבר בהירות-והפנים פסיבי
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hu, W., Tamadon, A., Hsueh, A. J.… More

Hu, W., Tamadon, A., Hsueh, A. J. W., Feng, Y. Three-dimensional Reconstruction of the Vascular Architecture of the Passive CLARITY-cleared Mouse Ovary. J. Vis. Exp. (130), e56141, doi:10.3791/56141 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter