Summary
여기 우리는 그대로 마우스 난소에서 수동 선명도 난소 맥 관 구조 및 follicular 모세 혈관의 시각화를 위한 3D 재구성 방법의 적응을 제시.
Abstract
난소는 여성의 생식 시스템의 주요 기관 이다 하 고 여성 gametes의 생산에 대 한 복잡 한 구조 관계와 3 차원 (3D) 맥 관 구조 아키텍처의 내 분 비 시스템을 제어 하기 위한 필수적 이다는 난소는 잘 기술 된다. 3D 연결과 그대로 난소에 혈관의 아키텍처를 시각화 하기 위해 첫 번째 중요 한 단계는 광학 투명 난소를 만드는 것입니다. 피하 조직의 수축, 우리가 사용 하는 하이드로 겔 고정 기반 수동 선명도 (아크릴 때 교배 고정 취소 지질 교환 이미징 / Immunostaining/에서 제자리 교 잡-호환 조직 히드로) 메서드는 그대로 난소를 프로토콜 . Immunostaining, 고급 multiphoton confocal 현미경 검사 법, 그리고 3D 이미지 복원 다음 난소 혈관 및 소 낭 모양 모 세관의 시각화를 위해 사용 되었다. 이 방식을 사용 하 여, 우리는 상당한 긍정적인 상관 관계 보였다 (P < 0.01) follicular 벽의 볼륨과 follicular 모 세관의 길이 사이.
Introduction
여 포는 난소의 기본적인 구조상과 기능 단위 이며 그 개발 높은 난소 내에서 맥 관 구조에 관련 된. 혈관 영양과 모 낭에 호르몬을 공급 하 고 따라서 성장과 낭1의 성숙에 중요 한 역할.
선택적 혈관 마커, 유전자 변형 마우스 모델 및 제약 개발을 포함 하 여 기술의 조합 난소 혈관 네트워크, 신생, 혈관의 기능에 대 한 우리의 지식을 증가합니다 folliculogenesis입니다. 난소는 그것 folliculogenesis와 배 란 기간 동안 다양 한 조직 및 혈관 네트워크를 개장 하기 때문에 활성 장기로 알려져 있다. 혈관의 구조와 크기에 이러한 활성 개장 하는 것은 개발 및 낭의 생물 학적 기능을 위한 필요 이다.
난소 및 혈관의 immunolabeling를 사용 하 여 전통적인 조직학 및 histomorphometric 메서드는 2 차원 (2D) 이미지2. 3 차원 (3D) 재구성 기술 개발 조직 조각의 2D 이미지 3 차원 구조를 만들기 위해 중첩 수 있습니다 하지만이 방법은 여전히 몇 가지 한계가-조직의 단면 마이크로 구조의 일부를 파괴할 수는 조직, 자주 그리고 상당한 노동은 조각에서 얻은 이미지에서 3 차원 개조를 제작에 관련 된. Confocal 현미경 검사 법으로 전체 조직의 3D 영상 많은, 이러한 한계를 극복할 수 있지만 이러한 방법은 배아 난소3신생의 평가에 제한 됩니다. 전체 조직의 선명도4 같은 방법의 선택을 취소를 사용 하 여 산 후 및 성인 난소에 이러한 문제를 해결할 수 있도록 시각화 된 볼륨을 증가 시킬 수 있습니다 그리고 이러한 방법을 모든 구조적 변형 없이 난소의 광학 정리 제공. 그대로 난소의 3D 아키텍처의 이미징이이 작품에 사용 된 Imaris 소프트웨어 패키지 같은 이미지 분석 소프트웨어에 대 한 정확한 이미지 데이터베이스를 제공 합니다.
성인 기에 걸쳐 난소의 개장 동적 생리 체계의 일부 이며 이것은 난소 신생의 규칙에 대 한 조사에 대 한 우수한 모델. 또한, polycystic 난소 증후군이 나 난소 암 등 여성 생식의 pathologic 상태에서 난소 혈관의 역할을 평가 전체 난소 조직 영상 통해 공부 될 수 있다. 수동 선명도 방법의 개발 및 고급 이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여 혈관과 모 낭 등 난소의 구조 간의 관계에 자세한 공간 정보 제공.
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Protocol
동물 주제와 관련 된 모든 절차에서 상해 의학 대학, 복 단 대학 (승인 번호 20160225-013) 동물 윤리 위원회의 지침에 따 랐 다.
1입니다. 투명 마우스 난소의 준비
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솔루션의 준비
- 준비 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 솔루션 (1 M, pH 7.6) 0.1% 트라이 톤 X-100 (PBST). 10 x PBS 재고 솔루션 1 L을 혼합 87 g의 NaCl, NaH2포4 · 3.1 g 2 H2O, 그리고 나2HPO4 ·12H2오의 28.7 g dH2O L 1과 볶음 ~ 2 h. pH 7.4에 조정 1 N NaOH를 추가 하 고 상 온에서 저장. 1/10이 10 배 재고 솔루션을 희석 0.1% 이며 dH2O를 사용 하 여 PBS에 트라이 톤 X-100.
- Mixings 4% (wt/vol) paraformaldehyde (PFA) 솔루션, 4% (wt/vol) 아크릴, 0.05% (wt/vol) bisacrylamide, 및 0.25% (wt/vol) VA-044 초기자 두 번 증 류 물 얼음에 의해 히드로 솔루션 (pH 7.5)를 준비 합니다.
- 4% (wt/vol) 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS) 이중 증 류 물에서 포함 된 200 m m 나트륨 붕 산 염 버퍼를 혼합 하 여 개간 솔루션 (pH 8.5)를 준비 합니다.
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Transcardial 관류와 난소 준비
- 모든 절차 동안 얼음에 모든 솔루션을 유지.
- 성인 여성 와일드 타입 C57BL/6 마우스 pentobarbital (0.35 mg/kg) 솔루션의 복 주사와 anesthetize 발가락-핀치 응답 보여줍니다, 일단 마우스 제대로 마 취.
- 사지와 마우스를 해결 하기 위해 사용 스티커 테이프 플랫 폼 보드에 밖으로 뻗어.
- 가 위로 가슴, 피부, 뼈를 통해 칼 프로세스에 절 개를 마음에 노출.
- 동물의 오른쪽 아 트리 움로 절 개 하 고 perfuse 10 mL/min에서 얼음 1 x PBS의 20 mL와 좌 심 실.
- 20 mL 이상 10 mL/min에서 히드로 솔루션으로 동물 perfuse
- 가 위, 전체 enterocoelia를 노출, medioventral 라인을 따라 복 부에 피부 incise 고 내장을 제거 합니다. 난소 뿐만 아니라 자 궁 난소 형태학의 무결성을 유지 하기 위해 수집 합니다.
- 현미경으로 난소 주위 지방 조직을 제거 합니다.
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기체 제거
- 3 일 동안 고정을 위한 4 ° C에서 10 mL 히드로 솔루션에 난소를 놓습니다.
- 5 mL 관으로 난소를 전송 하 고 히드로 솔루션 튜브를 입력 합니다. 튜브 위에 parafilm 스트레칭 하 고 튜브의 목 parafilm 포장.
주의:는 parafilm와 히드로 솔루션 사이 아무 거품 인지 확인 합니다. - 유해를 하이드로 겔 수 있도록 3 h의 최대 37 ° C에서 인큐베이터에서 통에 튜브를 놓습니다.
- 주걱을 사용 하 여 젤에서 난소를 제거 하 고 조심 스럽게 티슈 페이퍼에 의해 난소 주위에서 초과 젤을 제거. 4 번 1 x PBS 가진 난소를 씻어.
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수동 청소
- 청소 솔루션의 10 mL에 난소 잠수함 개간 과정을 시작 하는 37 ° C에서 80 rpm에서 부드럽게 흔들어.
- 첫 주에 3 일 마다 솔루션을 변경 합니다. 일단 난소까지 주 분명해 1 주일 후 청소 솔루션을 새로 고칩니다. 일반적으로이 프로세스는 약 2-3 주 걸립니다.
참고: 난소 또는 immunostained를 직접 수 저장할 수 있습니다 나트륨 아 지 드 (0.02%)에 PBS에 4 ° C에서 immunostaining 전에 몇 주 동안.
2입니다. Immunostaining
- 통에 37 ° C에서 1 일에 PBST에 두 번 난소를 씻어.
- 37 ° c.에 2-3 일에 1 차 항 체/PBST 솔루션 (표 1)에 통에 난소를 품 어 에 여기에 제시, 기본 항 체 혈소판 내 피 성장 세포 접착 분자 1 (CD31) 했다 일과 티로신 hydroxylase 각각 1시 10분, PBST에 1시 50분에 희석.
주의: 두 개 이상의 종류 1 차적인 항 체의 사용 하는 경우 다른 동물 소스 있는지 확인 합니다. - 하루에 4 통에 37 ° C에서 PBST 버퍼 기본 항 체를 씻어.
- 하루 5-6 통에 37 ° C에 PBST에서 원하는 보조 항 체와 난소를 품 어. 여기에 제시 된 작품에 2 차 항 체 티로신 hydroxylase와 알 렉 사 가루 594 CD31 PBST에 1시 50분에 희석에 대 한 알 렉 사 가루 488을 했다.
- 통에 7 일에 37 ° C에서 PBST 버퍼와 2 차 항 체를 씻어.
- 주 8에 굴절률 균질에 대 한 굴절률 매칭 솔루션으로 조직의 전송. 눈금선의 시각적 선명도 눈금선을 볼 수 있는지 여부를 확인 하 여 확인 하는 종이에 조직을 넣어. 일단 조직을 완전히 명확히 있다, 몇 군데 될 수 있습니다.
- 단지 주변을 수 퍼 실린더 조직, 그리고 말굽 모양으로 모양을 만들고 밀폐 공간을 만들기 위하여 유리 슬라이드에 밀접 하 게 외부 릿지를 누릅니다. 퍼 티의 높이 난소 보다 조금 키가 있어야 합니다.
- 명확히 난소 신중 하 게 퍼 티의 중심에 놓고 굴절률 일치 하는 솔루션을 추가 합니다. 유리 하단 접시 퍼 티에 단단히 넣고 퍼 티를 사용 하 여 요리를 해결.
3. confocal 현미경 검사 법
- Confocal 현미경 이미징, "Ni-E" 패널에서 선택 (이 경우 물 침수 25 X 렌즈, 1.1-나, 2 mm-WD)에 렌즈 (이 경우 2.0 m m)에 적절 한 작업 거리.
-
"수집" 패널에서 채널 수를 선택 합니다. 여기에, 3 개의 채널을 사용 합니다.
- 첫째, 사용 하 여 "눈 포트" 탭 및 XY 컨트롤러 조이스틱 현미경 접 안 렌즈를 통해 확인 하 여 조직 필드의 중심을 이동.
- 셔터 라이트를 끈 후 조정 "레이저 파워", "HV (이득)", "라이브" 탭을 클릭 하 고 "오프셋 ' 각 별도로 채널. 높은 레이저 전원 및 HV 높은 신호를 발생할 수 있습니다 그리고 더 높은 오프셋 배경 잡음을 줄일 수 있습니다.
- 적절 한 "스캔 크기"와 "수"를 선택 합니다. 사용 하 여 1024 x 1024 µ m2 의 스캔 크기와 4 ~ 8의 수 있습니다.
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설정 패널에서 조직의 깊이 정의 하기 위한 이미지 품질 "Z 강도 보정", 후 (조직 중심)에서 난소의 최상위 계층에 렌즈를 찾아서 최상위 계층에 대 한 인수를 조정 후, 클릭 "더하기" 버튼을 상위 계층을 정의 합니다.
- 렌즈를 이동 하 고 적절 한 HV 및 조직의 하단에 대 한 레이저 전원 설정 Z 강도 보정 테이블에 낮은 레이어 정보 추가. "하 차" "ND 수집" 패널 설정을 동기화 하려면 클릭 합니다.
-
"ND 수집" 패널, 스캔 수 단계 첫 번째 집합. 그런 다음, "Z"와 "큰 이미지" 탭 체크.
- 접 안경 통해 조직 시각화의 도움으로 조직의 경계에 따라 필드의 크기를 정의 하려면 "스캔 큰 이미지" 창으로 이동 합니다. 다시 검색 영역 ("필드")의 크기를 입력 하 고 10%와 15% 사이 오버랩 선택 "ND 수집" 패널으로 이동.
- "실행 Z 수정" 하지 "실행" 지금", 자동으로 각 계층에 대 한 적절 한 HV, 레이저 파워와 오프셋을 설정 하 고 이미지 처리를 위해 대기를 클릭 합니다.
4. 개별 낭과 그들의 Vasculatures의 3D 재구성
- 첫째, ImageJ5 를 사용 하 여 원래 NIS 파일을 엽니다. "이미지" 버튼을 클릭 하 고 "색상" 및 "분할 채널"을 선택 합니다. 다음, "파일"을 클릭 하 고 별도로 "다른 이름으로 저장"에서 "이미지 시퀀스" 옵션을 사용 하 여 tiff 파일 시리즈로 채널을 저장.
- Imaris를 사용 하 여 tiff 파일 시리즈 중 하나를 엽니다. "편집" 버튼을 클릭 하 고 "채널 추가"를 선택 추가 채널의 나머지를. 이름 및 색상 채널의 "디스플레이 조정" 탭에서 변경할 수 있습니다. 직물의 두께 "편집" 드롭 다운 목록에서 "이미지 속성" 패널에서 수정 해야 합니다.
- 3D 자르기 최종 이미지의 과잉 부분 제거, 대 한 "편집" 버튼을 클릭 하 고 "3D 자르기"를 선택 합니다. 테두리를 끌어 필드의 크기를 조정할 수 있습니다.
-
Surpass 패널에 필 라 멘 트 알고리즘으로 선박 신호를 재구성 하 새로운 필 라 멘 트를 생성 하 고 클릭 합니다 "필" 버튼을 클릭 합니다.
- 가장 크고 가장 얇은 직경을 정의 하기 위해 "슬라이스" 패널에가 고 추적 선박을 찾을. 거리 선박의 최대 너비에 두 포인트를 선택 하 여 "측정" 패널에 자동으로 표시 됩니다.
- "Surpass" 패널에 돌아가 측정된 폭을 입력을 클릭 합니다.
- 시작 및 씨앗 포인트 임계값을 조정 합니다. "카메라" 패널에서 "선택"을 선택 합니다. 자동으로 생산된 분야의 일부는 제거 될 필요가, shift 하 고 지점에 클릭 하십시오. "이동"을 선택 하 고 마우스를 이동, 구조는 모든 올바른 포인트 유지 되 고 다음을 클릭 합니다 회전할 수 있습니다.
- 로컬 대비를 위한 높은 임계값을 선택 하 고을 클릭 합니다. "쪽이 검출"를 선택한 혈관 실린더의 재건을 마무리 계속 하지 마십시오. 색상은 "색상" 탭을 클릭 하 여 편집할 수 있습니다. 통계 데이터는 복원 된 필 라 멘 트의 "통계" 패널에서 추출할 수 있습니다. "편집" 패널에서 초과 부분을 제거할 수 있습니다.
참고: 다른 알고리즘은 총 낭 또는 소 낭 모양 벽의 볼륨을 측정 하는 데 사용할 수 있습니다. 여기에 제시 된 작품에는 oocytes 두 이차 항 체의 autofluorescence에 의해 표를 했다. 많은 양의 데이터 때문에 워크스테이션 서버 데이터 분석을 위해 사용 되었다.
5. 통계 분석
참고: 이미지 분석 데이터는 ± 표준 오류를 의미 하는 대로 표시 됩니다.
- 독립 표본 t-검정를 사용 하 여 모 공 사이의 비교를 수행 하 고 피어슨의 상관 관계 테스트를 사용 하 여 상관 관계 계수 follicular 벽 및 모 세관 길이 비교. P의 값을 설정 < 0.05 통계적 의미에 대 한 제한.
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Representative Results
우리는 수동 난소 follicular와 혈관 구조를 보존 하 고 혈관과 모 낭의 레이블이 표시에서 높은 형광 신호를 취득 하는 동안 지우기에 대 한 신속 하 고 간단한 방법으로 수동 선명도 메서드를 적응. Follicular 맥 관 구조의 3D 아키텍처 CD31, 내 피 세포6표식에 대 한 immunostaining에 의해 결정 되었다. 필 라 멘 트 알고리즘을 사용 하 여 및 follicular 모 세관 및 기본 및 보조 모 공 (그림 1) 사이의 상호 관계를 보여주었다 CD31 성인 쥐의 난소에 얼룩 추적 했다.
티로신 hydroxylase immunostained oocytes granulosa와 thecal 층을 감지 하 고 낭7,8의 총 볼륨을 계산 하는 자리 변환 및 표면 알고리즘 사용 되었다. 여 포의 압축 때문에 자른된 낭의 일부 반 수동으로 확인 되었다. 자리 개별 follicular 볼륨과 oocytes의 변화와 follicular 벽 층의 표면 재건 및 혈관의 필 라 멘 트 재건, 후 취소 개별 follicular vasculatures와 다른 사이의 관계 측정된 지표, 특히 granulosa와 thecal 층 볼륨 (그림 2) 관찰 되었다.
그림 1 : 적응 수동 선명도 프로토콜 개간 후 그대로 성인 마우스 난소의 고해상도 영상. (A-B) 섹션 및 XYZ 큰 검색 수집 합니다. 3 차원 (3D) 잘립니다 (C) 및 기본 (D) 낭 (위쪽 행)와 3D 재구성 모세 혈관, oocytes, 및 granulosa/thecal 세포 같은 뿌리 (아래쪽 행)의 같은 필 라 멘 트, 식별 표시 됩니다 표면, 그리고 변환 알고리즘을 자리. 스케일 바 = 200 µ m (A-B), 50 µ m (C), 30 µ m (D). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 기본 및 보조 난소 낭과 그들의 vasculatures 간의 관계의 비교 인덱스. Oocyte 볼륨 (A) follicular 볼륨과 자리 변환 알고리즘에 의해 결정으로 개별 낭에 oocytes의 3D 개조 후 추출 된 고 follicular 벽 볼륨 (B) 표면에 의해 결정 되었다 알고리즘 및 모 세관은 필 라 멘 트 알고리즘에 의해 추적 했다. Follicular 볼륨 (C), oocyte 볼륨/모 세관 길이 비율 (D), 소 낭 모양 벽 볼륨/모 세관 길이 비율 (E), follicular 볼륨/모 세관 길이 비율 (F), 모 세관 길이 (H), 그리고 모 세관 길이 follicular 벽 볼륨 (G)의 상관 관계는 소프트웨어 패키지의 적절 한 도구를 사용 하 여 계산 했다. 오차 막대는 의미의 표준 오류를 나타냅니다. n = 6; * P < 0.05; * * P < 0.01. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 마우스 난소의 보조 여 포에서 모세 혈관의 3 차원 재구성. 이것을 계시 한다 (흰색 사각형 표시 공간의 테두리) 낭의 oocyte 측의 위 빈 공간. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
현재 연구에서 선물이 3D 이미징 모세 혈관과 개별 성장 낭 사이의 관계를 평가 하기 위해. 우리의 이전 작품에서는 동일한 프로토콜 9를 사용 하 여, 우리는 큰 맥 관 구조, 모 공, 그대로 마우스 난소에서 난 포의 위치 사이 상호 작용의 역할을 공부 했습니다. 수동 선명도 접근 수 마이크로 및 매크로 vasculatures, folliculogenesis, corpora lutea의 다른 발달 단계에서 난소 아키텍처를 재구성으로 낭도 간의 상호 관계를 공부 하 고 있었습니다.
데이터를 얻기 위해 3D 이미지 그대로 직물의, 개간 과정은 중요 한 첫걸음 이다. 두 가지 주요 전략-탈수 방법 및 수동 선명도10같은 친수성의 시 약-기반 방법. 탈수 방법 종종 형광 신호 감소 이어질 종종 독성 유기 솔루션 폐기물 생산 때문에 우리는 다양 한 조직 유형으로 사용 하기 위해 수동 선명도 방법의 몇 가지 단계를 단순화에 우리의 주의 집중 했다.
개간 과정에서 첫 번째 중요 한 절차는 transcardial 관류. 관류, 동안 배경 형광을 줄이기 위하여 혈액 밖으로 플러시 수 있다 PBS와 히드로 솔루션의 전신 혈액 순환에 중요 한 역할을 재생 심장 펌핑 합니다. 따라서, 관류 수술을 정확 하 게 수행 해야 하 고 신속 하 게는 히드로 전에 동물의 조기 사망을 피하기 위해 완전히 걸쳐 분산 되어 동물. 모든 에이전트 유지 되어야 한다 얼음에 전체 실험 동안 회담 외 에 의해 설명 했 듯이 11또는 그들은 유해는 관류가 완료 되기 전에 시작 됩니다. 다음 중요 한 단계는, 하이드로 겔을 제거 하 고 그리고 그것은 항 체를 유지 하기 때문에 가능한 많은 초과 젤 제거 하는 데 필요한. 조직에는 선택이 취소 되어, 일단 그것은 개간 솔루션에서 제거와 있어야 개간 솔루션에 너무 많은 시간 손실 됩니다 너무 많은 단백질을 일으킬 것입니다 때문에 4 ° C에서 PBS에 저장 합니다. Confocal 현미경 이미징, X Y 범위 전에 항상 Z-설정을 설정 해야 합니다. 첫번째 다운 X-Y 범위 설정, Z-설정은 전체 X-Y 필드에 동기화 할 수 없습니다.
수동 선명도 양 그 외 여러분 에 의해 처음 도입 되었다 12 그들의 프로토콜에 그들은 관류 단계를 수행 하지 않았다 고 질소 degassed 대신. 또한, 그들의 개간 솔루션 히드로 솔루션 bisacrylamide를 포함 하지 않았다, 그들은 개간 솔루션에서 8 %SDS 사용 하 고 그들은 굴절률 일치 하는 미디어에 대 한 테두리를 사용. 이 방법은 이후 SDS 농도13증가, 관류 단계 및 질소 무료 생성 절차14, 추가 및 동위 mPACT15등 다른 개간 방법으로 메서드를 결합 하 여 향상 되었습니다. 여기, 우리는 추가 개발 프로토콜 결합 하 여 transcardial 관류 및 질소 무료 기체 제거, 감소 하는 4%, 개간 솔루션에 SDS FocusClear를 사용 하 여 일치 하는 미디어, 더 나은 품질을 제공 하는 굴절률으로 현미경 이미지입니다.
수동 선명도, 후의 난소 follicular 맥 관 구조 그대로 3D 아키텍처를 confocal multiphoton 현미경 및 이미지 분석을 수행할 수 있습니다. 이 프로토콜16항 체 같은 고분자에 의해 침투에 대 한 적합 한 광학 투명 한 하이드로 겔 때 교배 성공 형식으로 빛을 투과 그대로 난소를 변환 합니다. 클래식 2D 단면 조직학 분석, 달리 수동 선명도 특정 마커 얼룩 모세 혈관과 개별 성장 낭 간의 관계의 3D 매핑이 있습니다.
성인 조직, 활성 혈관 개장 하 고 신생 주로 발생 합니다 상처 치유, 골절 수리, 종양 및 전이 형성, retinopathies, fibroses, 및17류 마티스 관절염 같은 병 적인 과정 동안. 그러나, folliculogenesis 동안 순환 변화 개장 하는 맥 관 구조에 대 한 고유한 용량을 나타냅니다. 보조 낭에 동굴의 형성, 소 낭 모양 액체 그것을 채우고 고 oocyte 성숙 및 follicular 개발18적합 한 microenvironment 제공 한다 oocyte 둘러싸고. 이전 2D 이미징 연구 보여주었다 난소 낭 티크 수영장19모세 혈관의 네트워크에 의해 포위 된다. Granulosa 레이어 nonvascular, 이며 각 뿌리 자체 모세 혈관으로 둘러싸여. Vasculogenesis6CD31의 필수적인 역할와 일치, 우리는 발견 증가 모 세관 길이에 기본에서 보조 낭 (그림 2G 및 2 H) 전환에 folliculogenesis 동안. 개별 주 또는 보조 모 낭 주위 모세 혈관의 무작위 배포, 대신 모세 혈관의 3 차원 재구성 시연 낭에 배포 하는 모 세관 분기 했다 큰 낭에서 감지 하 고 대부분의이 경우 모 세관 분 지 형성 빈 공간 (그림 3).
하나의 주요 관심사는 적응된 방법, 난소를 비교적 긴 시간이 걸립니다 하지만 오랜 시간 최고의 효과 지우기에 필요한. 몇 시간을 저장 하려면 한 번에 모든 필요한 샘플을 수집 하 고 허가 조직 PBS와 0.02% 나트륨 아 지 드 4 ° C에서 몇 달 동안 저장 될 수 있기 때문에 함께 그들을 삭제 하는 것이 좋습니다. 또 다른 한계는 confocal 현미경의 작동 거리. 높은 배율 렌즈 짧은 작업 거리, 두꺼운 시료의 이미징에 대 한 장애물이 될 수 있다.
BABB20, 규모21, 3DISCO22, ClearT23, SeeDB24, 선명도16, 수동 선명도 포함 하 여 투명 하 고 그대로 조직의 이미징에 대 한 여러 가지 프로토콜 도입 되었습니다 (4 또는 하이드로 겔25), 없이 협정12,27입방26,, FASTClear28및 사실29, 하지만 그들의 단지 3 개 사용 된 전체 난소 조직 삭제 및 평가9, 30,31. SeeDB30 , ScaleA231 전체 난소 조직의 이미징에 대 한 도입 되었습니다 하지만 이러한 프로토콜 허용 단일 immunostaining 단계. 그러나 현재 연구에서 하 고 우리의 이전 연구9같이 수동 선명도,, 여러 단백질 라벨 반응에 대 한 수 있습니다.
Follicular 레이어 사이의 혈관 전체 명확히 난소 조직을 사용 하 여 3 차원 구조 관계를 확인 하기 위한 우리의 적응된 프로토콜 같은 다른 난소 질병에 신생을 공부에 대 한 새로운 접근법을 제공 하는 끝으로, polycystic 난소 증후군 그리고 난소 암입니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 연구는 초나라에 대 한 중국 특별 기금에서 교부 금에 의해 지원 되었다 (YF No. 2014T70392), 국립 자연 과학 재단의 중국 YF (No. 81673766), 새로운 교사를 못쓰게 기금, 복 단 대학의 Zuoxue 재단 및 개발 상하이 최대 분야 통합 의학 (20150407)의 프로젝트.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acrylamide | Vetec | v900845 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/vetec/v900845 |
| Alexa Flour 488 (Dilution 1:50) | Life Technologies | A11039 | https://www.thermofisher.com/antibody/product/Goat-anti-Chicken-IgY-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11039 |
| Alexa Flour 594 (Dilution 1:50) | Life Technologies | A11012 | https://www.thermofisher.com/antibody/product/Goat-anti-Rabbit-IgG-H-L-Cross-Adsorbed-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11012 |
| Bisacrylamide | Amresco | 172 | http://www.amresco-inc.com/BIS-ACRYLAMIDE-0172.cmsx |
| Black wall glass bottom dish (Willco-Dish) | Ted Pella | 14032 | http://www.tedpella.com/section_html/706dish.htm#black_wall |
| Boric acid | Sinopharm Chemical Reagent | 10004818 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10004818 |
| Disodium hydrogen phosphate dodecahydrate (Na2HPO4 12H2O) | Sinopharm Chemical Reagent | 10020318 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10020318 |
| FocusClear | Celexplorer | FC-102 | http://www.celexplorer.com/product_list.asp?MainType=107&BRDarea=1 |
| Parafilm | Bemis | PM996 | http://www.parafilm.com/products |
| Paraformaldehyde | Sinopharm Chemical Reagent | 80096618 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=80096618 |
| PECAM1/CD31, platelet-endothelial cell adhesion molecule 1 (Dilution 1:10) | Abcam | ab28364 | http://www.abcam.com/cd31-antibody-ab28364.html |
| Photoinitiator VA044 | Wako | va-044/225-02111 | http://www.wako-chem.co.jp/specialty/waterazo/VA-044.htm |
| Sodium azide | Sigma | S2002 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/s2002?lang=en®ion=US |
| Sodium chloride (NaCl) | Sinopharm Chemical Reagent | 10019318 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10019318 |
| Sodium dihydrogen phosphate dihydrate (NaH2PO4 2H2O) | Sinopharm Chemical Reagent | 20040718 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=20040718 |
| Sodium dodecyl sulfate | Sinopharm Chemical Reagent | 30166428 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=30166428 |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sinopharm Chemical Reagent | 10019718 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10019718 |
| Triton X-100 | Sinopharm Chemical Reagent | 30188928 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=30188928 |
| Tyrosine hydroxylase (TH, Dilution 1:50) | Abcam | ab76442 | http://www.abcam.com/tyrosine-hydroxylase-phospho-s40-antibody-ab51206.html |
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