Summary
ここでそのままマウス卵巣における受動的な明快さと卵巣の血管と濾胞性毛細血管の可視化における 3 D 画像再構成法の適応を提案する.
Abstract
卵巣は、女性の生殖器系の主要な器官と雌性の配偶子の生産構造の複雑な関係との三次元 (3 D) 血管アーキテクチャが、内分泌系を制御するために不可欠です、卵巣は記述されていません。3 D の接続とそのまま卵巣の血管の構造を視覚化するために最初の重要なステップは、光学的に透明の卵巣をすることです。ヒドロゲルを用いて組織の収縮を避けるためには、受動的な明快さの固定ベース (アクリルアミド ハイブリダイズ リジッドのオフ脂質交換イメージング/染色/の場-交配-互換性のある組織ハイドロゲル) プロトコルをそのまま卵巣をクリアする方法.染色、高度な多光子の共焦点顕微鏡と 3 D 画像再構成それから卵巣の血管と濾胞性毛細血管の可視化のために使用されました。このアプローチを使用すると、有意な正の相関を示した (P < 0.01) 卵胞の毛細血管と卵胞壁量の長さの間。
Introduction
卵胞が卵巣の構造と機能の基本単位とその開発は、卵巣内にある血管に関連性の高い。血管は栄養と卵胞ホルモンと成長と1卵胞の成熟に重要な役割を担っています。
選択的血管マーカー、トランスジェニック マウス モデル、医薬品開発などの技術の組み合わせは、卵巣の血管網、血管新生、血管の機能に関する知識を増加しています。卵胞形成。卵巣は、卵胞発育と排卵の間に様々 な組織や血管のネットワークを改造するためにアクティブな器官と呼ばれます。サイズと血管の構造のようなアクティブな改造開発、採用に卵胞の生物学的機能に必要です。
卵巣のセクションおよび血管の反応を使用して従来の組織学的および組織計量方法は二次元 (2 D) 画像2に限定されます。三次元 (3 D) 再構成技術の発展に伴い、組織スライスの 2 D 画像を 3 D 構造に重ねることができますが、この方法はまだいくつかの制限を持って-微細構造の一部を破壊することが組織の区分、組織は、不足していると多くの労働力がスライスから得られた画像からの 3次元再構成の製作にかかわっています。全体組織 3 D 共焦点顕微鏡イメージングは、これらの制限の多数を克服できるがこれらのメソッドは萌芽期卵巣3における血管新生の評価に限定。生後および成体卵巣におけるこれらの問題を解決するために可視化されたボリュームを増やして全体ティッシュ クリア透明度4などのメソッドを使用して、このようなメソッドは任意の構造変形せず卵巣の光のクリアランスを提供します。そのまま卵巣の 3 D 構造のイメージングは、本作で使用されている Imaris ソフトウェア パッケージなどの画像解析ソフトウェアの正確な画像データベースを提供します。
動的な生理学的システムの一部である成人期にわたって卵巣の改造、これ卵巣血管新生の調節に調査のための優秀なモデル。さらに、多嚢胞性卵巣症候群、卵巣癌などの女性生殖器系の病的な状態で卵巣血管の役割の評価は全卵巣組織イメージングを通じて学ぶことができます。パッシブのクラリティ法の開発と高度な画像解析ソフトウェアの使用は、血管や毛包などの卵巣構造の関係に関する詳細な空間情報を提供しました。
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Protocol
動物を対象とするすべてのプロシージャ上海医科大学、復旦大学 (承認番号 20160225-013) の動物倫理委員会のガイドラインに従った。
1. 透明なマウス卵巣の準備
-
溶液の調製
- リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) ソリューション (1 M、pH 7.6) 0.1% 準備トリトン X-100 (pbst;)。10 x PBS 原液 1 リットルを作るためには、87 g の塩化ナトリウム、NaH2PO4 · 3.1 g を混ぜる2 H2O、および Na2HPO4 ·12H2O. 28.7 g dH2O に 1 L 攪拌 ~ 2 h. 調整 pH 7.4 に 1 N naoh を追加し、常温で保存します。1/10 この 10 倍原液を希釈 dH2O を使用し、0.1% トリトン X-100 PBS で。
- 混合 (wt/巻) 4% パラホルムアルデヒド (PFA) ソリューション、4% (重量/巻) アクリルアミド、0.05% (重量/巻) bisacrylamide、ダブル蒸留水氷の上の 0.25% (重量/巻) VA 044 イニシエーターによるゲル溶液 (pH 7.5) を準備します。
- 4% (重量/巻) ドデシル硫酸ナトリウム (SDS) 二重蒸留水に 200 mM ホウ酸ナトリウム緩衝を混ぜてクリア ソリューション (Ph8.5) を準備します。
-
Transcardial 血流と卵巣の準備
- すべてのプロシージャの間に氷の上のすべてのソリューションをしてください。
- ペントバルビ タール (0.35 mg/kg) ソリューションの腹腔内注入成人女性野生型 c57bl/6 マウスを麻酔します。それはつま先ピンチの応答を示しています、一度マウスに麻酔がかかる適切。
- フラットの発泡ボードを伸ばして手足でマウスを固定する粘着テープを使用。
- ハサミで胸、肌や骨を剣状突起上を切開すること、心臓を公開します。
- 動物の右房切開を行い、20 ml 10ml/分で冷たい 1 × PBS の左心室を灌流します。
- 少なくとも 20 ml ゲル液 10 mL/分での動物を灌流します。
- ハサミには、全体の enterocoelia を公開している medioventral ラインに沿って腹部の皮膚を切開し、腸を削除します。卵巣の形態の整合性を維持するために子宮と卵巣を収集します。
- 顕微鏡下で卵巣の周りの脂肪組織を削除します。
-
脱ガス
- 3 日間の固定のための 4 ° C で 10 mL ゲル ソリューションに卵巣を配置します。
- 5 mL チューブに卵巣を転送し、ハイドロゲル ソリューションとチューブを入力します。チューブの上にパラフィルムをストレッチし、管の首にパラフィルムをラップします。
注意: は、パラフィルムとハイドロゲル ソリューションの泡がないことを確認します。 - 37 ° C で重合するハイドロゲルを許可する 3 h の最大のためのインキュベーターのシェーカーにチューブを置きます。
- ヘラを使用してゲルから卵巣を削除、ティッシュ ペーパーで卵巣の周りから余分なゲルを注意深く取り外します。1x PBS で 4 回卵巣を洗います。
-
パッシブ クリア
- クリア溶液 10 mL で卵巣が水没します。消去プロセスを開始する 37 ° C で 80 rpm で軽く振る。
- 最初の週に 3 日おきにソリューションを変更します。卵巣まで週が明確になったら、一週間後クリア ソリューションを更新します。通常このプロセスは、約 2-3 週間かかります。
注: 卵巣 immunostained を直接することができます。 またはに格納できるアジ化ナトリウム (0.02%) PBS の 4 ° C で免疫染色の前に数週間。
2. 免疫染色
- Pbst; で 2 回シェーカーで 37 ° C で 1 日目に卵巣を洗います。
- 37 ° C で 2-3 日目の主な抗体/PBST ソリューション (表 1) にシェーカーで卵巣を孵化させなさい血小板内皮細胞接着分子 1 (CD31) をされた一次抗体をここで提示する仕事でチロシン水酸化酵素それぞれ 1:10 と 1:50 PBST で希釈します。
注意: 一次抗体の 2 つ以上の種類を使用している場合は、別の動物の源があるを確認します。 - シェーカーで 4 日目に 37 ° C で PBST バッファーと一次抗体を洗浄します。
- シェーカーで 37 ° C で 5 - 6 日目 PBST 目的の二次抗体と卵巣を孵化させなさい。ここで紹介する作業、二次抗体はチロシン水酸化酵素と 1:50 PBST 内で希釈した CD31 の Alexa 小麦粉 594 が Alexa 小麦粉 488 とだった。
- シェーカーで 7 日で 37 ° C で PBST バッファーと二次抗体を洗浄します。
- 屈折率マッチング ソリューション 8 日目に屈折率の均質化のために組織を転送します。目盛線目盛線を見ることができるかどうかを確認することでその映像の明瞭さをチェックすると紙の上には、組織を置きます。組織が完全に明らかにされて、一度はイメージすることができます。
- 作ることをちょうど囲むパテ シリンダー、組織とし馬蹄形に形状、密閉された空間を作るためにスライド ガラスにしっかりと外縁隆起帯を押します。パテの高さは卵巣より少し背が高いはずです。
- パテの中心に明らかに卵巣を慎重に配置し、屈折率整合ソリューションを追加します。しっかりとパテの上にガラス底皿を置くし、お皿を修正するためパテを使用します。
3. 共焦点顕微鏡
- 共焦点顕微鏡を用いたイメージング、「Ni E」パネルで (この場合 2.0 mm) の適切な作動距離で (この場合は水浸漬 25 X 対物レンズ、1.1 NA、2 mm WD) レンズを選択します。
-
「取得」パネルでチャンネル数を選択します。ここでは、3 つのチャンネルを使用します。
- まず、顕微鏡接眼レンズを通じてチェックすることによって組織をフィールドの中央に移動するのに「目ポート」タブと XY コント ローラー ジョイスティックを使用します。
- シャッター光を切って"HV (利得)"、「レーザー パワー」を調整する「ライブ」のタブをクリックし、"オフセット ' 各チャネル個別に。ハイパワー レーザーおよび HV より高い信号をもたらすし、高いオフセットがバック グラウンド ノイズを減らすことができます。
- 適切な「スキャン サイズ」と「数」を選択します。スキャン サイズを 1024 x 1024 μ m2 4 ~ 8 のカウントを使用します。
-
「Z 強度補正」パネルで組織の深さを定義する画像品質を設定後、(で、組織の中心) 卵巣の最上位層のレンズを見つけるとトップ層の獲得を調整後、「プラス」をクリックトップにレイヤーを定義します。
- レンズを下に移動、適切な HV と組織の下のレーザー パワーを設定し、Z 強度補正テーブルに最低のレイヤー情報を追加します。「ND 取得」パネルで設定を同期するの"に ND"をクリックします。
-
「ND 取得」パネル、スキャン数のステップの最初のセット。その後、"Z"と「大きな画像」タブを選択します。
- 接眼レンズを通して組織の可視化の助けを借りて、組織の境界線に従ってフィールドのサイズを定義する「大きな画像をスキャン」ウィンドウに移動します。スキャン領域 (「フィールド」) のサイズを入力し、10% と 15% 間の重複を選択して「ND 取得」パネルに戻ります。
- 「実行 Z 補正」、ない「今すぐ実行」自動的に各レイヤーに適切な HV、レーザー出力とオフセットを設定し、画像を処理するのを待つをクリックしてします。
4. 個別包とその血管の三次元
- まず、ImageJ5を使用して、元の NIS ファイルを開きます。「イメージ」ボタンをクリックしてし、「色」と"分割チャンネル"を選択します。「ファイル」をクリックし、「名前を付けて保存」で「イメージ シーケンス」オプションを使用して tiff ファイル シリーズとしてチャンネルを個別に保存します。
- Imaris を使用すると、tiff ファイル シリーズのうちの 1 つを開きます。「編集」ボタンをクリックし、「チャンネルの追加」を選択してチャンネル残り部分を追加します。「ディスプレイの調整」タブでは、名前およびチャネルの色を変更できます。 されます組織の厚さは、「編集」下のドロップ ダウン リストで「イメージ プロパティ」パネルで修正される必要があります。
- 最終のイメージと余分な部分の除去の 3 D のトリミング、"Edit"ボタンをクリックし、「トリミング 3 D」を選択します。フィールドのサイズは、枠線をドラッグして調整できます。
-
サーパス パネルにおけるフィラメント アルゴリズムを用いた船舶信号を再構築するには、新しいフィラメントを作成し、次へをクリックする「フィラメント」をクリックします。
- 最大かつ最薄の直径を定義するために「スライス」パネルに移動しをトレース船を見つけます。容器の最大幅で 2 つの点を選択することにより、距離が自動的に「測定」パネルに表示されます。
- 「サーパス」パネルに戻ると幅の測定値を入力次へをクリックして。
- 開始とシード ポイントのしきい値を調整します。「カメラ」パネルで「選択」を選択します。自動的に作り出された球のいくつかが削除する場合は、shift キーを押し、ポイントをクリックします。「移動」を選択して、マウスを動かして、によってすべての正しいポイントが保持されている, し、次へをクリックを確認する構造を回転できます。
- 局所的なコントラストの高いしきい値を選択し、[次へ] をクリックします。「検出の棘」を選択しないし、血管柱の再構成を完了する続行。色は、「カラー」タブをクリックしてして編集できます。再建されたフィラメントの「統計」パネルで統計データを抽出できます。[編集] パネルで余分な部分を削除できます。
注: 合計卵胞または濾胞壁のボリュームを測定するための他のアルゴリズムを使用できます。ここで紹介する作業、卵母細胞は両方の二次抗体の蛍光によって示されました。データ量が大きいためワークステーションのサーバーは、データ分析のため使用されました。
5. 統計解析
注: ± 標準誤差を手段として、画像解析データが掲載されています。
- 独立したサンプルの t 検定を使用して卵胞の比較実行し、ピアソンの相関テストを使用して卵胞壁毛細血管の長さの相関係数を比較します。P の値設定 < 統計的有意性の制限と 0.05 です。
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Representative Results
我々 は受動的な卵巣の卵胞期と血管のアーキテクチャを維持すると、容器と包のラベル付きのマーカーからの最高の蛍光信号の取得をオフに迅速かつ簡単な方法にパッシブのクラリティ法を適応しました。卵胞血管の 3 D アーキテクチャは、CD31、内皮細胞6マーカーの免疫染色により決定されました。CD31 染色成体マウスの卵巣では卵胞の毛細血管とプライマリとセカンダリの卵胞 (図 1) との間の相互関係を示し, フィラメントのアルゴリズムを使用してトレースされました。
スポット変換と表面のアルゴリズムは、チロシン水酸化酵素 immunostained 卵母細胞と顆粒膜層を検出し、包7,8の総体積を計算する使用されました。卵胞の圧縮のためトリミング卵胞の一部が半手動で識別されました。個々 の卵胞ボリュームと卵母細胞のスポット変換と卵胞壁の層の表面再構成と血管のフィラメント再構成の後オフに個々 の卵胞血管などとの関係測定指標、特に顆粒と莢膜層のボリュームは、(図 2) を認められました。
図 1: 適応受動的な明快さのプロトコルとクリア後そのまま成体マウス卵巣の高分解能イメージングします。(A B)セクションと XYZ 大型スキャン取得。3 次元 (3 D) トリミング二次 (C) と (D) プライマリ卵胞 (上の行) と 3 D 再構成毛細血管、卵子、顆粒膜/包膜、フィラメントによって識別されるように同じ包 (下の行) のセルが表示されて、表面とスポット変換アルゴリズム。スケール バー 200 μ m (A ・ B)、50 μ m (C)、(D) 30 μ m を =。 この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: プライマリおよびセカンダリ卵胞とその血管との関係の比較指標。卵のボリューム (A) 卵胞体積とスポット変換アルゴリズムによって決定される個々 の卵胞の卵母細胞の 3次元再構成後抽出し、卵胞壁量 (B) は表面によって決定されました。アルゴリズムと毛細血管は、フィラメントのアルゴリズムによって追跡しました。卵胞ボリューム (C) 卵のボリューム/キャピラリー長さの比率 (D)、卵胞壁量/キャピラリー長さ比 (E)、卵胞のボリューム/キャピラリー長さ比 (F)、キャピラリー長さ (H) と適切なツールを使用してソフトウェア パッケージにキャピラリー長さと卵胞壁量 (G) の相関を求めた。誤差範囲は、平均の標準誤差を表しています。n = 6;* P < 0.05;* * P < 0.01。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3:マウス卵巣の二次卵胞の毛細血管の三次元再構成します。これは明らかに(白い四角は、空間の境界線を表示) 卵胞の卵母細胞側上の中空スペース。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
現在の研究では、毛細血管と個々 の発育卵胞の間の関係を評価するイメージング 3 D を提案する.筆者らは同じプロトコル9を使用して、大血管、毛包とそのままマウス卵巣内の卵胞の場所間の相互作用の役割を検討しました。パッシブわかりやすくアプローチでは、マイクロおよびマクロ生、卵胞形成、および黄体と卵胞だけでなくさまざまな発達段階で卵巣の建築を再建するための間の相互関係を検討することができました。
そのまま組織の 3次元画像データを取得するには、清算プロセスは、最初の重要なステップです。主な戦略は 2 つあります-脱水方法と受動的な明快さ10など、親水性試薬ベースのメソッド。脱水方法が頻繁に蛍光シグナルの低下につながる、しばしば有害有機廃液を作り出す、ので私達の注意に注力様々 な組織型の受動的な明快さ使用法のいくつかの手順を簡素化します。
清算プロセスの最初の重要な手順は、transcardial 血流です。灌、心臓の鼓動は、背景の蛍光性を減少するために血液を洗い流すことができる PBS、ハイドロゲルのソリューションの全身循環に重要な役割を果たしています。したがって、灌流外科を正確に実行する必要があります、すぐに、ハイドロゲルの前に動物の早死にを避けるために完全に全体に分散され、動物。全体の実験中に氷の上のすべてのエージェント必要がありますおく亮らによって述べられるように11、または彼らは、重合、灌流が完了する前に開始されます。次の重要なステップは、ハイドロゲルを削除して、抗体を保持するために、できるだけ余分なゲルとして削除する必要があります。組織をクリアすると、クリア ソリューションから削除され、クリア ソリューションにあまりにも多くの時間があまりにも多くのタンパク質が失われる原因となりますので、4 ° C で PBS で保存する必要があります。共焦点顕微鏡イメージング、X と Y の範囲の前に Z 設定を設定する必要が常に。最初に X と Y の範囲を設定すると、X と Y フィールドを全体に Z 設定を同期できません。
受動的な明快さヤンら初12プロトコルの彼らは灌流ステップ実行していないと、代わりに窒素を脱気します。また、そのクリア ソリューション ハイドロゲル ソリューションで bisacrylamide を含みませんでしたクリア ソリューションで 8 %sds を使用かつ屈折率整合メディア用リム。このメソッドは、SDS 濃度13を増加灌流ステップと窒素脱手順14を追加し、パルス mPACT15など他の清算方法とメソッドを組み合わせることによりその後改善されました。ここでは、我々 はさらに transcardial 潅流を組み合わせる窒素無料脱ガス、4% クリア ソリューションで SDS の減少と、屈折率整合より良い品質を提供するメディアとして FocusClear を使用してプロトコルを開発しました。顕微鏡画像。
受動的な明快さの後卵巣の卵胞血管のまま 3 D アーキテクチャ共多光子顕微鏡と画像解析を実行できます。このプロトコルは、光の透過性そのまま卵巣を抗体16などの高分子の浸透に適切な光学的に透明なハイドロゲル ハイブリダイズ ナノポーラス フォームに変換します。異なり、古典的な 2D 断面の組織学的解析、受動的な明快さと特定のマーカーの染色により、毛細血管と個々 の発育卵胞の関係の 3 D マッピングできます。
成体、アクティブな血管リモデリングと血管新生に主に創傷治癒、破壊修理、腫瘍や転移の形成、retinopathies、fibroses、およびリウマチ性関節炎17など病理学的プロセスの間に発生します。ただし、卵胞発育中に周期的な変化は、血管系の改造のための独自の能力を表します。二次卵胞の前庭の形成後、卵胞液がそれを塗りつぶし、適切な微小環境は、卵母細胞の成熟と卵胞発育18卵母細胞を囲みます。以前 2 D イメージング研究は、卵胞が卵胞国際19で毛細血管のネットワークによって囲まれていることを示した。顆粒層は、導管と各卵胞が独自の毛細血管に囲まれています。血管6CD31 の重要な役割に一貫した、我々 の増加が見つかりませんキャピラリー長さプライマリからセカンダリ卵胞 (数字の 2と2 H) への移行で卵胞発育中。個々 のプライマリまたはセカンダリの卵胞周囲毛細血管分布がランダムではなく毛細血管の 3次元構造復元包に分布する毛細血管の枝だった大きい卵胞で検出可能なことを実証し、ほとんどの場合、これらキャピラリーの枝は中空スペース (図 3) を結成しました。
1 つの主要な関心事は適応法、卵巣をオフに比較的長い時間がかかりますが、最高の効果をクリアに長い時間がかかります。いくつかの時間を保存すると、一度にすべての必要なサンプルの収集とクリアの組織は、数カ月 4 ° C で PBS と 0.02% アジに保存できますので、それらを一緒にクリアをお勧めします。別の制限は、共焦点顕微鏡の作動距離です。高倍率の対物レンズがある厚い試料のイメージングのための障害となる作業距離が短い。
いくつかのプロトコルは、バブ20・規模21、3DISCO22ClearT23、SeeDB24明快さ16、受動的な明快さを含む透明性とそのまま組織のイメージングのために導入されている (4またはハイドロゲル25)、なし協定12、26立方,27、FASTClear28, そして実際29、それらの 3 つだけがクリア全卵巣の組織の評価9、使用されています。 30,31。SeeDB30と ScaleA231全体卵巣組織のイメージングの導入されているが、これらのプロトコルのみ単一染色手順を許可します。本研究では、私たちの以前の研究9に示すように受動的な明快さは、ただし、複数のタンパク質ラベリング反応できます。
濾胞層と全く明らかに卵巣のティッシュを使用して血管の 3 D 構造的関係を決定するための私たちの適応プロトコルが卵巣のさまざまな病気で血管新生のように勉強の新しいアプローチを提供する結論としては、多嚢胞性卵巣症候群、卵巣癌。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
本研究は、ポスドクの中国特別基金からの助成金によって支えられた (YF に号 2014T70392)、中国の国家自然科学基金 (YF に号 81673766)、新しい教師プライミング基金、復旦大学、Zuoxue 財団、開発上海ピーク分野統合医学 (20150407) のプロジェクト。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acrylamide | Vetec | v900845 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/vetec/v900845 |
| Alexa Flour 488 (Dilution 1:50) | Life Technologies | A11039 | https://www.thermofisher.com/antibody/product/Goat-anti-Chicken-IgY-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11039 |
| Alexa Flour 594 (Dilution 1:50) | Life Technologies | A11012 | https://www.thermofisher.com/antibody/product/Goat-anti-Rabbit-IgG-H-L-Cross-Adsorbed-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11012 |
| Bisacrylamide | Amresco | 172 | http://www.amresco-inc.com/BIS-ACRYLAMIDE-0172.cmsx |
| Black wall glass bottom dish (Willco-Dish) | Ted Pella | 14032 | http://www.tedpella.com/section_html/706dish.htm#black_wall |
| Boric acid | Sinopharm Chemical Reagent | 10004818 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10004818 |
| Disodium hydrogen phosphate dodecahydrate (Na2HPO4 12H2O) | Sinopharm Chemical Reagent | 10020318 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10020318 |
| FocusClear | Celexplorer | FC-102 | http://www.celexplorer.com/product_list.asp?MainType=107&BRDarea=1 |
| Parafilm | Bemis | PM996 | http://www.parafilm.com/products |
| Paraformaldehyde | Sinopharm Chemical Reagent | 80096618 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=80096618 |
| PECAM1/CD31, platelet-endothelial cell adhesion molecule 1 (Dilution 1:10) | Abcam | ab28364 | http://www.abcam.com/cd31-antibody-ab28364.html |
| Photoinitiator VA044 | Wako | va-044/225-02111 | http://www.wako-chem.co.jp/specialty/waterazo/VA-044.htm |
| Sodium azide | Sigma | S2002 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/s2002?lang=en®ion=US |
| Sodium chloride (NaCl) | Sinopharm Chemical Reagent | 10019318 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10019318 |
| Sodium dihydrogen phosphate dihydrate (NaH2PO4 2H2O) | Sinopharm Chemical Reagent | 20040718 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=20040718 |
| Sodium dodecyl sulfate | Sinopharm Chemical Reagent | 30166428 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=30166428 |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sinopharm Chemical Reagent | 10019718 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10019718 |
| Triton X-100 | Sinopharm Chemical Reagent | 30188928 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=30188928 |
| Tyrosine hydroxylase (TH, Dilution 1:50) | Abcam | ab76442 | http://www.abcam.com/tyrosine-hydroxylase-phospho-s40-antibody-ab51206.html |
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