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Biology

Reconstrucción tridimensional de la arquitectura Vascular del ovario de ratón pasivo claridad-despejado

Published: December 10, 2017 doi: 10.3791/56141
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1
1Department of Integrative Medicine and Neurobiology, School of Basic Medical Sciences; Institutes of Brain Science, Brain Science Collaborative Innovation Center, State Key Laboratory of Medical Neurobiology, Institute of Acupuncture and Moxibustion, Fudan Institutes of Integrative Medicine, Fudan University, 2Program of Reproductive and Stem Cell Biology, Department of Obstetrics and Gynecology, Stanford University School of Medicine, Stanford University
* These authors contributed equally

Summary

Aquí presentamos una adaptación de la pasivo claridad y método de la reconstrucción 3D para la visualización de la vasculatura ovárica y foliculares capilares en ovarios de ratón intacto.

Abstract

El ovario es el órgano principal del sistema reproductivo femenino y es esencial para la producción de gametos femeninos y para el control del sistema endocrino, pero las complejas relaciones estructurales y las arquitecturas de la vasculatura (3D) tridimensional de la ovario no están bien descritas. Para poder visualizar las conexiones de 3D y arquitectura de los vasos sanguíneos en el ovario intacto, el primer paso importante es hacer que el ovario ópticamente claro. Para evitar la contracción del tejido, se utilizó el hidrogel pasiva basada en la fijación de la claridad (intercambian lípidos claro cruzado por hibridación acrilamida rígido imágenes / Immunostaining/In situ hibridación-compatible con tejido Hydrogel) protocolo método para borrar un ovario intacto . Immunostaining, microscopía confocal multifotón avanzada y reconstrucciones 3D de imagen entonces fueron utilizadas para la visualización de los vasos ováricos y tubos capilares foliculares. Usando este acercamiento, hemos demostrado una correlación positiva significativa (P < 0,01) entre la duración de la foliculares capilares y el volumen de la pared folicular.

Introduction

El folículo es la unidad fundamental estructural y funcional del ovario, y su desarrollo está muy relacionado con la vasculatura dentro del ovario. Los vasos sanguíneos suministrar nutrición y hormonas a los folículos y así desempeñar un papel importante en el crecimiento y maduración de los folículos1.

Una combinación de tecnologías, incluyendo marcadores selectivos vasculares, modelos de ratón transgénico y desarrollo farmacéutico, han aumentado nuestro conocimiento sobre redes vasculares ováricas, angiogénesis y la función de los vasos sanguíneos folliculogenesis. El ovario se conoce como un órgano activo porque remodela varias redes vasculares y tejidos durante la Foliculogénesis y la ovulación. Dicha remodelación activa en el tamaño y la estructura de los vasos es necesaria para la función biológica de desarrollo y reclutamiento de los folículos.

Los métodos histológicos e histomorfométricos tradicionales usando secciones ováricas y la inmunomarcación de los vasos sanguíneos se limitan a imágenes bidimensionales (2D)2. Con el desarrollo de las tecnologías de reconstrucción tridimensional (3D), se pueden superponer imágenes 2D de rebanadas de tejido para hacer una estructura 3D, pero esta modalidad todavía tiene algunas limitaciones, seccionamiento del tejido puede destruir las microestructuras, algunas partes de la tejido faltan a menudo, y trabajo importante está involucrado en hacer reconstrucciones 3D de imágenes de rebanadas. Conjunto tisular 3D con microscopia confocal puede superar muchas de estas limitaciones, pero estos métodos se limitan a la evaluación de la angiogénesis en el ovario embrionario3. Utilizando tejido entero claro métodos tales como la claridad4 puede aumentar el volumen visualizado con el fin de resolver estos problemas en los ovarios postnatales y adulto, y tales métodos proporcionan separación óptica del ovario sin deformaciones estructurales. La proyección de imagen de la arquitectura 3D de ovario intacto proporciona una base de datos de imagen precisa para software de análisis de imagen, como el paquete de software Imaris utilizado en este trabajo.

Remodelación del ovario a lo largo de la edad adulta es parte de un sistema dinámico de fisiológico, y esto hace que el ovario un excelente modelo para investigaciones sobre la regulación de la angiogénesis. Además, evaluar el papel de los vasos ováricos en condiciones patológicas del sistema reproductor femenino como el síndrome de ovario poliquístico o cáncer de ovario puede ser estudiada a través de la proyección de imagen de tejido ovárico todo. El desarrollo del método pasivo de claridad y el uso de software de análisis avanzado de imágenes han proporcionado información espacial detallada sobre las relaciones entre los vasos sanguíneos y estructuras ováricas tales como folículos.

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Protocol

Todos los procedimientos con animales sujetos siguieron las directrices del Comité de ética Animal en Universidad médica de Shanghai, la Universidad de Fudan (número de autorización 20160225-013).

1. preparación del ovario de ratón transparente

  1. Preparación de las soluciones
    1. Preparar la solución de tampón fosfato salino (PBS) (1 M, pH 7,6) con 0,1% Tritón X-100 (SAFT). Para hacer 1 L de solución stock de 10 x PBS, mezcla de 87 g de NaCl, 3,1 g de NaH2PO4 · 2H2O y 28,7 g de Na2HPO4 ·12H2O. Añadir dH2O a 1 L y mezclar ~ 2 h. ajuste a pH 7,4 con 1 N NaOH y almacenan a temperatura ambiente. Diluir esta solución stock 10 x 1/10 con dH2O y luego realizar 0,1% Tritón X-100 en PBS.
    2. Preparar la solución de hidrogel (pH 7,5) por solución de paraformaldehido (PFA) de 4% (peso/vol) de mezclas, 4% (peso/vol) acrilamida, bisacrilamida 0.05% (peso/vol) y 0.25% (peso/vol) VA-044 iniciador en doble y agua destilada en el hielo.
    3. Preparar la solución de limpieza (pH 8.5) mezclando 200 mM de tampón de borato de sodio que contiene 4% (peso/vol) sodio dodecil sulfato (SDS) en agua destilada doble.
  2. Preparación de la perfusión y el ovario Transcardial
    1. Mantenga todas las soluciones en hielo durante todos los procedimientos.
    2. Anestesiar el tipo salvaje hembra adulto del ratón C57BL/6 con una inyección intraperitoneal de pentobarbital (0,35 mg/kg) de solución. Una vez que no muestre ninguna respuesta del pellizco del dedo del pie, el ratón correctamente está anestesiado.
    3. Uso de cinta adhesiva para fijar el ratón con extremidades estiró hacia fuera en un tablero de espuma plana.
    4. Exponer el corazón por una incisión en el proceso xifoide con el pecho, piel y huesos con las tijeras.
    5. Hacer una incisión en la aurícula derecha del animal y luego inundar el ventrículo izquierdo con 20 mL de helado de 1 x PBS a 10 mL/min.
    6. Inundar el animal con menos de 20 mL de solución de hidrogel en 10 mL/min.
    7. Haga una incisión en la piel sobre el abdomen a lo largo de la línea medioventral con tijeras, que expone la enterocoelia toda, y quitar los intestinos. Recoger tanto los ovarios como el útero para mantener la integridad de la morfología ovárica.
    8. Eliminar el tejido graso alrededor del ovario bajo un microscopio.
  3. Desgasificación
    1. Coloque los ovarios en 10 mL de solución de hidrogel a 4 ° C para la fijación por 3 días.
    2. Transfiera el ovario en un tubo de 5 mL y llenar el tubo con solución de hidrogel. Parafilm se extienden sobre la parte superior del tubo y luego envolver parafilm alrededor del cuello del tubo.
      PRECAUCIÓN: Asegúrese de que no hay ningunas burbujas entre el parafilm y la solución de hidrogel.
    3. Coloque el tubo en un agitador en la incubadora a 37 ° C por un máximo de 3 h para permitir que el hidrogel polimerizar.
    4. Quitar el ovario del gel con una espátula y cuidadosamente retirar el gel sobrante de alrededor del ovario por papel de seda. Lave el ovario cuatro veces con PBS 1 x.
  4. Claro pasivo
    1. Sumerja el ovario en 10 mL de la solución de limpieza. Sacuda suavemente a 80 rpm a 37 ° C para iniciar el proceso de compensación.
    2. En la primera semana, cambie la solución cada 3 días. Después de una semana, actualizar la solución de limpieza una vez a la semana hasta el ovario se convierte en claro. Este proceso toma generalmente cerca de 2-3 semanas.
      Nota: El ovario puede ser directamente immunostained o puede guardarse en azida de sodio (0,02%) en PBS a 4 ° C durante varias semanas antes de la inmunotinción.

2. inmunotinción

  1. Lave el ovario dos veces en SAFT el día 1 a 37 ° C en un agitador.
  2. Incubar el ovario en un agitador en la solución de anticuerpos primarios/SAFT (tabla 1) el día 2-3 a 37 ° C. En el trabajo presentado aquí, los anticuerpos primarios fueron la molécula de adhesión celular plaquetaria endotelial 1 (CD31) y tirosina hidroxilasa diluido al 1:10 y 1:50 en SAFT, respectivamente.
    PRECAUCIÓN: Si se usan dos o más tipos de anticuerpo primario, asegúrese de que hay diferentes fuentes animales.
  3. Lave los anticuerpos primarios con tampón de SAFT a 37 ° C en el día 4 en una coctelera Boston.
  4. Incubar el ovario con los anticuerpos secundarios deseados en SAFT el día 5-6 a 37 ° C en un agitador. En el trabajo presentado aquí, los anticuerpos secundarios fueron harina de Alexa 488 para tirosina hidroxilasa y Alexa harina 594 para CD31 diluido al 1:50 en SAFT.
  5. Lave los anticuerpos secundarios con tampón de SAFT a 37 ° C en el día 7 en una coctelera Boston.
  6. Transferir el tejido a la solución de correspondencia para índice de refracción de homogeneización de índice de refracción el día 8. Poner el tejido en un papel con las líneas de división para verificar su claridad visual comprobando si se observan las líneas de cuadrícula. Una vez que el tejido ha sido completamente aclarado, puede ser reflejada.
  7. Hacer un cilindro de masilla que podría simplemente rodea el tejido, moldear en forma de herradura y presiona el canto exterior firmemente sobre un portaobjetos de vidrio para hacer un espacio sellado. La altura de la masilla debe ser un poco más alta que el ovario.
  8. Coloque cuidadosamente el ovario clarificado en el centro de la masilla y añadir el índice de refracción que solución. Poner un plato de fondo de cristal sobre la masilla bien y usar masilla para fijar el plato.

3. confocal microscopio

  1. Para la proyección de imagen con un microscopio confocal, en el panel de "Ni-E" Elija la lente (en este caso agua inmersión 25 X objetivo, 1.1-NA, 2 mm-WD) con la distancia de trabajo adecuada (en este caso 2,0 mm).
  2. En el panel de "Adquisición", seleccione el número de canales. Aquí, utiliza tres canales.
    1. En primer lugar, utilice la ficha de "Puerto de ojo" y la palanca de mando del regulador XY para mover el tejido hacia el centro del campo comprobando a través de los oculares del microscopio.
    2. Después de apagar la luz de la persiana, haga clic en la pestaña "en vivo" para ajustar la "energía del laser", "HV (ganancia)", y "offset" para cada canal por separado. Mayor potencia del láser y HV pueden conducir a mayores señales y offset mayor puede reducir el ruido de fondo.
    3. Seleccione el tamaño adecuado de exploración del"" y "Count". Utilice un análisis de tamaño de 1024 x 1024 μm2 y una cuenta de 4 a 8.
  3. Después de ajustar la calidad de imagen para definir la profundidad del tejido en el panel de "corrección de la intensidad de la Z del y después de localizar la lente de la capa de la parte superior del ovario (en el centro del tejido) y ajustar la adquisición para la capa superior, haga clic en el"plus" botón para definir la capa superior.
    1. Mover la lente hacia abajo y establecer el alto voltaje apropiado y energía del laser para la parte inferior del tejido y añadir la información de capa más bajo en la tabla de corrección de la intensidad de la Z. Haga clic en la"a" para sincronizar la configuración con el panel de "Adquisición de ND".
  4. Panel en la "adquisición de ND", primera serie, el número de análisis de los pasos. Luego, marcar las pestañas de "Z" y "Gran imagen".
    1. Vaya a la ventana de "Ampliación de análisis de imagen" para definir el tamaño del campo según la frontera del tejido con la ayuda de la visualización de tejido a través de los oculares. Volver al panel de "Adquisición de ND" para el tamaño de la zona de exploración ("campos") de entrada y elija el traslapo entre el 10% y 15%.
    2. Haga clic en "Run Z corrección", no "ejecutar ahora", automáticamente establece el HV adecuada, energía del laser y el desplazamiento de cada capa, y esperar a que la imagen a procesar.

4. 3D reconstrucción de folículos individuales y sus Vasculatures

  1. En primer lugar, utilizar ImageJ5 para abrir el archivo original de NIS. Haga clic en el botón "Imagen" y elegir el "Color" y los "canales de Split". A continuación, haga clic en "Archivo" y guardar por separado los canales como serie de archivo tiff utilizando la opción "Secuencias de imágenes" en "Guardar como".
  2. Utilice Imaris para abrir una de las series de archivo tiff. Haga clic en el botón "Editar" y seleccione "Añadir canales" para añadir el resto de los canales. Pueden cambiarse el nombre y el color del canal en las pestañas de "Ajuste". El espesor del tejido deba corregirse en el panel de "Propiedades de imagen" en la lista desplegable "Edición".
  3. Para el cultivo de 3D de las imágenes finales y retiro de piezas de exceso, haga clic en el botón "Editar" y seleccione "Cultivo 3D". El tamaño del campo puede ajustarse arrastrando la frontera.
  4. Para reconstruir las señales de la embarcación con el algoritmo de filamentos en el panel de Surpass, haga clic en el botón de "Filamentos" para crear un filamento nuevo y haga clic en siguiente.
    1. Para definir el mayor y el diámetro más fino, vaya al panel de "Slice" y encontrar el barco de seguimiento. La distancia automáticamente aparecerá en el panel de "Medida" seleccionando dos puntos en la anchura máxima del buque.
    2. Volver al panel de "Surpass" y el ancho medido de entrada y haga clic en siguiente.
  5. Ajustar el umbral de punto de partida y semilla. En el panel de "Cámara", elija "Seleccionar". Si algunas de las esferas automáticamente producidas necesitan ser quitado, presione Mayús y haga clic sobre el punto. "Navegar" y moviendo el ratón, se puede girar la estructura para asegurar que todos los puntos correctos han sido retenidos y haga clic en siguiente.
  6. Elegir el umbral más alto para el contraste local y haga clic en siguiente. No seleccione "Detectar espinas" y continuar finalizar la reconstrucción del cilindro vascular. El color se puede editar haciendo clic en la ficha "Color". Los datos estadísticos se pueden extraer en el panel de "Estadística" del filamento reconstruido. Piezas de exceso se pueden quitar en el panel de "Editar".
    Nota: Otros algoritmos pueden utilizarse para medir el volumen de los folículos total o paredes foliculares. En el trabajo presentado aquí, los ovocitos fueron marcados por el autofluorescence de ambos anticuerpos secundarios. Debido a la gran cantidad de datos, un servidor de sitio de trabajo se utilizó para el análisis de datos.

5. estadístico análisis

Nota: Datos de análisis de imagen se presentan como medios ± error de estándar.

  1. Realizar comparaciones entre los folículos mediante la prueba t de muestras independientes y utilizar la prueba de correlación de Pearson para comparar los coeficientes de correlación de la pared folicular y la longitud del tubo capilar. Establecer un valor de P < 0,05 como límite de significación estadística.

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Representative Results

Adaptamos el método pasivo de claridad en un método rápido y simple de ovario pasivo claro preservando la arquitectura folicular y vascular y obtener la mayor señal fluorescente de los marcadores etiquetados de los vasos y folículos. La arquitectura 3D de la vascularización folicular fue determinada por inmunotinción para CD31, un marcador para las células endoteliales6. CD31 tinción en los ovarios de ratones adultos se trazó mediante el algoritmo de filamento y demostró la interrelación entre los capilares foliculares y folículos primarios y secundarios (figura 1).

La transformación de lugar y algoritmos de superficie fueron utilizados para detectar la tirosina hidroxilasa immunostained ovocitos y granulosa y capas tecal y para calcular el volumen total de folículos7,8. Debido a la compactación de los folículos, algunas partes de folículos recortados se identificaron semi-manualmente. Después de la transformación del punto del volumen folicular individual y ovocitos y filamento reconstrucción de los vasos y reconstrucción de la superficie de las capas de la pared folicular, claro las relaciones entre los vasculatures foliculares individuales índices medidos, especialmente granulosa y la capa tecal volúmenes, se observan (figura 2).

Figure 1
Figura 1 : Proyección de imagen de alta resolución de un ovario de ratón adulto intacto después de la tala con el protocolo adaptado de claridad pasivo. (A-B) Secciones XYZ gran-exploración y adquisición. Tres dimensiones (3D) recortada secundaria (C) y los folículos primarios (D) (fila superior) y 3D reconstruido capilares, ovocitos y granulosa/tecal se muestran células del folículo del mismo (fila inferior) identificado por el filamento, superficie, y Ver algoritmos de transformación. Barras de escala = 200 μm (A-B), 50 μm (C), (D) de 30 μm.  Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2 : Índices comparativos de las relaciones entre los folículos ováricos primarios y secundarios y sus vasculatures. El volumen de ovocitos (A) fue extraído después de reconstrucciones 3D del volumen folicular y ovocitos en los folículos individuales según lo determinado por el algoritmo de transformación de lugar, y el volumen de la pared folicular (B) se determinó por la superficie algoritmo y los tubos capilares fueron remontados por el algoritmo de filamento. El volumen folicular (C) la proporción de longitud de volumen/capilar de ovocitos (D), la relación de la longitud de pared folicular capilar/volumen (E), la relación de la longitud del volumen folicular/capilar (F), la longitud del tubo capilar (H) y la correlación de la longitud del tubo capilar y el volumen de la pared folicular (G) se calcularon usando las herramientas apropiadas en el paquete de software. Barras de error representan el error estándar de los medios. n = 6; * P < 0.05; ** P < 0.01. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: La reconstrucción tridimensional de los capilares de los folículos secundarios del ovario de ratón. Esto revela un hueco sobre el lado de ovocitos de los folículos (casillas blancas muestran las fronteras del espacio). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

En el presente estudio, presentamos proyección de imagen para evaluar las relaciones entre los capilares y los folículos en crecimiento individuales 3D. En nuestro trabajo anterior utilizando el mismo protocolo 9, estudiamos las funciones de la vasculatura grandes, las interacciones entre los folículos y la ubicación de los folículos en ovarios de ratón intacto. El enfoque pasivo de la claridad nos permitió estudiar micro y macro vasculatures, folliculogenesis y las interrelaciones entre los cuerpos lúteos y folículos, así como a reconstruir la arquitectura Ovarica en diferentes etapas de desarrollo.

Para obtener datos de imagen en 3D de tejidos intactos, el proceso de limpieza es el primer paso importante. Hay dos estrategias principales: métodos de deshidratación e hidrofílicos métodos basados en el reactivo, como pasivo claridad10. Debido a métodos de deshidratación a menudo conducen a una disminución de las señales fluorescentes y a menudo producen residuos tóxicos solución orgánica, nos hemos centrado nuestra atención en simplificar algunos pasos del método pasivo de claridad para su uso con varios tipos de tejido.

El primer procedimiento fundamental en el proceso de compensación es la perfusión de transcardial. Durante la perfusión, corazón bombeando desempeña un papel importante en la circulación de todo el cuerpo de solución de PBS e hidrogel, lo que puede eliminar la sangre con el fin de disminuir la fluorescencia de fondo. Así, la cirugía de la perfusión debe realizarse con precisión y rápidamente evitar la muerte prematura de los animales antes del hidrogel se distribuye completamente en todo el animal. Todos los agentes deben mantenerse en hielo durante todo el experimento, como se ha mencionado por Liang et al. 11, o se empieza a polimerizar antes de completar la perfusión. El siguiente paso importante es quitar el hidrogel, y es necesario quitar en todo el exceso de gel posible porque conservará los anticuerpos. Una vez que el tejido está desactivado, debe extraído de la solución claro y almacenado en PBS a 4 ° C, porque demasiado tiempo en la solución de limpieza causará demasiada proteína para perderse. En la proyección de imagen de microscopía confocal, siempre debe establecerse la configuración de Z antes de la gama X-Y. Si se establece el rango X-Y hacia abajo, los valores de Z no puede sincronizarse en todo el campo X-Y.

Pasivo claridad fue introducido por Yang et al. 12 en su Protocolo, que no realizó el paso de la perfusión y desgasificado con nitrógeno en lugar de otro. Además, su solución claro no incluyó bisacrilamida en la solución de hidrogel, utilizaron 8% SDS en la solución de limpieza, y utilizan llantas para índice de refracción que los medios de comunicación. Este método fue posteriormente mejorado aumentando la concentración de SDS13, agregando el paso de la perfusión y el procedimiento desgasificación libre de nitrógeno14, y combinar el método con otros métodos de compensación como PARS mPACT15. Aquí, además hemos desarrollado el protocolo combinando transcardial perfusión y nitrógeno-libre desgasificación, disminuyendo la SDS en la solución de compensación 4%, y usando FocusClear como el índice de refracción que los medios de comunicación, que proporciona mejor calidad imágenes de microscopía.

Después claridad pasiva, confocal multifotón análisis de microscopía e imagen puede realizarse para obtener la intacta arquitectura 3D de la vasculatura ovárica folicular. Este protocolo transforma un ovario intacto luz permeable en forma ópticamente transparente nanoporosos de hidrogel-cruzado por hibridación que es apropiada para la penetración por macromoléculas como anticuerpos16. A diferencia de los análisis histológicos transversales 2D clásicos, claridad pasiva y la coloración con marcadores específicos permite el mapeo 3D de las relaciones entre los capilares y los folículos en crecimiento individuales.

En tejidos adultos, activo remodelado vascular y la angiogénesis ocurre principalmente durante procesos patológicos como la cicatrización de heridas, reparación de la fractura, formaciones de tumor y la metástasis, retinopatías, fibroses y artritis reumatoide17. Sin embargo, cambios cíclicos durante la Foliculogénesis representan una capacidad única para la remodelación de la vasculatura. Después de la formación del antrum en folículos secundarios, líquido folicular llena y rodea el oocito, que proporciona un microambiente adecuado para la maduración de ovocitos y desarrollo folicular18. Estudios de imágenes en 2D anterior mostró que los folículos ováricos están rodeados por una red de capilares de la teca interna de los19. La capa granulosa es no vascular, y cada folículo está rodeado por sus capilares. De acuerdo con el papel esencial de CD31 en vasculogénesis6, encontramos un aumento en longitud del tubo capilar durante la Foliculogénesis en la transición de primaria a folículos secundarios (figuras 2 y 2 H). En lugar de una distribución aleatoria de los capilares alrededor de los folículos primarios o secundarios individuales, reconstrucción 3D de capilares demostró que capilar sucursales distribuidas en los folículos eran perceptibles en los folículos más grandes y en la mayoría de los casos estos ramas capilares forman un hueco (figura 3).

Una de las principales preocupaciones es que el método adaptado toma un tiempo relativamente largo para limpiar los ovarios, pero el tiempo es necesario para el mejor efecto de limpieza. Para ahorrar tiempo, le recomendamos que recoge todas las muestras necesarias a la vez y les claro juntos ya que los tejidos hayan borrado pueden almacenarse en PBS y 0,02% de azida sódica a 4 ° C durante varios meses. Otra limitación es la distancia de funcionamiento del microscopio confocal. Lentes de objetivo de mayor aumento tienen distancias más cortas del trabajo, que podrían ser un obstáculo para la proyección de imagen de muestras gruesas.

Varios protocolos han sido introducidos para la proyección de imagen de tejidos transparentes e intactos, incluyendo BABB20, escala21, 3DISCO22, Clear23, SeeDB24, claridad16, claridad pasiva (con4 o sin hidrogel25), pacto12, cúbico26,27, FASTClear28y29de hecho, pero sólo tres de ellos se han utilizado para el tejido ovárico toda compensación y evaluación9, 30,31. SeeDB30 y31 de ScaleA2 se han introducido para la proyección de imagen de tejidos todo ovarios, pero estos protocolos sólo permiten un paso único immunostaining. Pasivo claridad, permite múltiples reacciones proteína-etiquetado, sin embargo, como se muestra en el presente estudio y en nuestro anterior estudio9.

En conclusión, nuestro protocolo adaptado para la determinación de la relación estructural 3D entre capas foliculares y los vasos sanguíneos utilizando tejido ovárico todo aclarado proporciona un nuevo enfoque para el estudio de angiogénesis en diferentes enfermedades ováricas tales como síndrome de ovario poliquístico y ovario.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este estudio fue apoyado por subvenciones del fondo especial de China para posdoctorados (Nº 2014T70392 a YF), la Fundación Nacional de Ciencias naturales de China (no. 81673766 a YF), el nuevo profesor cebado de fondo, la Fundación Zuoxue de la Universidad Fudan y el desarrollo Proyecto de medicina integradora de disciplinas Shanghai pico (20150407).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acrylamide Vetec v900845 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/vetec/v900845
Alexa Flour 488 (Dilution 1:50)  Life Technologies A11039 https://www.thermofisher.com/antibody/product/Goat-anti-Chicken-IgY-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11039
Alexa Flour 594 (Dilution 1:50) Life Technologies A11012 https://www.thermofisher.com/antibody/product/Goat-anti-Rabbit-IgG-H-L-Cross-Adsorbed-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11012
Bisacrylamide Amresco 172 http://www.amresco-inc.com/BIS-ACRYLAMIDE-0172.cmsx
Black wall glass bottom dish (Willco-Dish) Ted Pella 14032 http://www.tedpella.com/section_html/706dish.htm#black_wall
Boric acid Sinopharm Chemical Reagent 10004818 http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10004818
Disodium hydrogen phosphate dodecahydrate (Na2HPO4 12H2O) Sinopharm Chemical Reagent 10020318 http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10020318
FocusClear Celexplorer FC-102 http://www.celexplorer.com/product_list.asp?MainType=107&BRDarea=1
Parafilm Bemis PM996 http://www.parafilm.com/products
Paraformaldehyde Sinopharm Chemical Reagent 80096618 http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=80096618
PECAM1/CD31, platelet-endothelial cell adhesion molecule 1 (Dilution 1:10) Abcam ab28364 http://www.abcam.com/cd31-antibody-ab28364.html
Photoinitiator VA044 Wako va-044/225-02111 http://www.wako-chem.co.jp/specialty/waterazo/VA-044.htm
Sodium azide Sigma S2002 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/s2002?lang=en&region=US
Sodium chloride (NaCl) Sinopharm Chemical Reagent 10019318 http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10019318
Sodium dihydrogen phosphate dihydrate (NaH2PO4 2H2O) Sinopharm Chemical Reagent 20040718 http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=20040718
Sodium dodecyl sulfate Sinopharm Chemical Reagent 30166428 http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=30166428
Sodium hydroxide (NaOH) Sinopharm Chemical Reagent 10019718 http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10019718
Triton X-100 Sinopharm Chemical Reagent 30188928 http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=30188928
Tyrosine hydroxylase (TH, Dilution 1:50) Abcam ab76442 http://www.abcam.com/tyrosine-hydroxylase-phospho-s40-antibody-ab51206.html

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Reconstrucción tridimensional de la arquitectura Vascular del ovario de ratón pasivo claridad-despejado
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Hu, W., Tamadon, A., Hsueh, A. J. W., Feng, Y. Three-dimensional Reconstruction of the Vascular Architecture of the Passive CLARITY-cleared Mouse Ovary. J. Vis. Exp. (130), e56141, doi:10.3791/56141 (2017).

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