Summary
Здесь мы представляем адаптация пассивной ЯСНОСТИ и 3D реконструкции метод для визуализации яичников сосудистую и фолликулярной капилляров в яичниках нетронутыми мыши.
Abstract
Яичник является главным органом женской репродуктивной системы и имеет важное значение для производства женских гамет и эндокринной системы, но сложных структурных отношений и трехмерные (3D) сосудистую архитектуры управления яичник не хорошо описаны. Для того, чтобы визуализировать 3D соединения и архитектуры кровеносных сосудов в яичнике нетронутыми, первый важный шаг, чтобы оптически ясно яичника. Для того, чтобы избежать усадки ткани, мы использовали гидрогеля на основе фиксации пассивной ЯСНОСТИ (очистить липидный обмен гибридизированных акриламида грузовик изображений / иммуноокрашивания/в situ гибридизация совместимых тканей гидрогеля) протокола метод для очистки нетронутыми яичника . Иммуноокрашивания, расширенный multiphoton confocal микроскопии и 3D изображение реконструкций затем были использованы для визуализации яичников сосудов и фолликулярной капилляров. Используя этот подход, мы показали значительное положительная корреляция (P < 0.01) между длиной фолликулярной капилляров и объем фолликулярной стены.
Introduction
Фолликул является блок основных структурных и функциональных яичников, и ее развития весьма связано с сосудистую внутри яичника. Кровеносные сосуды поставки питания и гормоны фолликулов и таким образом играют важную роль в обеспечении роста и созревания фолликулов1.
Сочетание технологий, в том числе селективного кровеносный сосуд маркеров, трансгенные мыши модели и фармацевтических разработок, увеличили наши знания о яичников сосудистой сети, ангиогенез и функции кровеносных сосудов фолликулогенез. Завязь известен как активный орган, потому что она моделирует различные ткани и сосудистой сети во время фолликулогенез и овуляции. Такие активные реконструкции в размер и структура судов требуется для биологической функции разработки и набором фолликулов.
Традиционные гистологические и histomorphometric методы, с помощью яичников секций и immunolabeling кровеносных сосудов, ограничиваются двухмерные (2D) изображения2. С развитием технологий трехмерного (3D) реконструкции, 2D изображения срезов ткани могут перекрываться сделать 3D структура, но этот метод все еще имеет некоторые ограничения — секционирование ткани может уничтожить микроструктур, некоторые части ткани часто отсутствуют, и значительный труд участвует в принятии 3D реконструкций из изображений, полученных из кусочков. Целом ткани 3D визуализации с помощью конфокальной микроскопии можно преодолеть многие из этих ограничений, но эти методы ограничены к оценке ангиогенеза в эмбриональных яичников3. Использование цельной ткани, очистка методы, такие как ясность4 может увеличить визуализированных объем с тем, чтобы решить эти проблемы в послеродовой период и взрослых яичников, и такие методы предоставляют оптических Распродажа завязи без каких-либо структурных деформаций. Визуализация 3D архитектуры нетронутыми завязи обеспечивает точный образ базы данных для программного обеспечения для анализа изображений, такие как пакет программного обеспечения Imaris, используемый в этой работе.
Ремоделирование завязи всей взрослой жизни является частью динамической физиологические системы, и это делает завязи отличную модель для расследования положения по ангиогенез. Кроме того оценки роли яичников кровеносных сосудов в патологических условиях женской репродуктивной системы, такие как синдром поликистозных яичников или яичников могут быть изучены через весь яичников ткани изображений. Развитие метода пассивной ЯСНОСТИ и использование программного обеспечения для анализа современных изображений предоставили подробной пространственной информации на отношения между кровеносных сосудов и яичников структур, таких как фолликулов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры с участием животных темы следовали руководящим принципам Комитета по этике животное в Шанхае медицинский колледж, Университет Фудань (номер 20160225-013 утверждения).
1. Подготовка прозрачной мыши яичника
-
Подготовка решений
- Приготовляют раствор (1 M, рН 7,6) фосфат амортизированное saline (PBS) с 0.1% тритон X-100 (PBST). Чтобы сделать 1 Л 10 x PBS Стоковый раствор, смесь 87 г NaCl, 3.1 g NaH2PO4 · 2H2O, 28,7 г Na2HPO4 ·12H2O. Добавить dH2O 1 Л и перемешать ~ 2 ч. Отрегулируйте к пэ-ашу 7.4 с 1 N NaOH и хранить при комнатной температуре. Разбавляют этот раствор 10 x на 1/10 с использованием dH2O, а затем сделать 0,1% тритон X-100 в PBS.
- Приготовьте Гидрогель раствор (pH 7.5) путем смешивания 4% (wt/vol) параформальдегида (PFA) раствор, 4% (wt/vol) акриламида, 0,05% (wt/vol) bisacrylamide и 0,25% (wt/vol) VA-044 инициатора в двойной дистиллированной воды на льду.
- Подготовьте очистки раствора (рН 8,5), смешивая 200 мм Борат натрия буфер, содержащий 4% (wt/vol) лаурилсульфат натрия (SDS) в двойной дистиллированной воды.
-
Подготовка Transcardial перфузии и яичников
- Держите все решения на льду во время всех процедур.
- Анестезировать мыши C57BL/6 взрослых женщин дикого типа внутрибрюшинной инъекции раствора Пентобарбитал (0,35 мг/кг). После того, как он показывает ответа мыс щепотка, мышь должным образом под наркозом.
- Использование клейкой ленты исправить мышь с конечностей растянулся на доске Плоская пена.
- Предоставить сердце, разрез на мечевидный процесса через грудь, кожи и костей с ножницами.
- Сделать надрез в правое предсердие животного и затем perfuse левого желудочка с 20 мл ледяной ПБС в 10 мл/мин.
- Perfuse животное с по крайней мере 20 мл гидрогеля раствора в 10 мл/мин.
- Надрезать кожу на животе вдоль линии medioventral ножницами, которая предоставляет весь enterocoelia, и удалить кишечник. Соберите яичников, а также матки для поддержания целостности яичников морфологии.
- Удаление жировых тканей вокруг яичника под микроскопом.
-
Дегазация
- Место яичников в растворе 10 мл гидрогеля на 4 ° C для фиксации на 3 дня.
- Передача яичника в 5-мл пробирку и заполнить трубу с гидрогеля решения. Растягивать парафина в верхней части трубки, а затем обернуть парафина на шее трубки.
Предупреждение: Убедитесь, что существует никаких пузырей между парафина и решение гидрогеля. - Поместите трубку на шейкер в инкубаторе при 37 ° C для максимум 3 h разрешить Гидрогель для полимеризации.
- Удаление яичника из геля, с помощью шпателя и тщательно удалить избыток геля от вокруг яичника, оберточной бумаги. Вымойте завязи четыре раза с ПБС.
-
Пассивной очистки
- Опускайте яичника в 10 мл раствора очистки. Осторожно встряхните в 80 об/мин при 37 ° C, чтобы начать процесс очистки.
- В первую неделю измените решение каждые 3 дня. После одной недели Обновите решение очистки после недели до яичника становится ясно. Обычно этот процесс занимает около 2-3 недели.
Примечание: Яичника может быть непосредственно immunostained или могут храниться в азид натрия (0,02%) в PBS на 4 ° C за несколько недель до иммуноокрашивания.
2. иммуноокрашивания
- Вымойте завязи дважды в PBST на 1 день при 37 ° C в шейкере.
- Инкубировать завязи на шейкер в растворе (Таблица 1) первичного антитела/PBST на 2-3 день при 37 ° C. В работе представлены здесь, первичного антитела были молекулы адгезии тромбоцитов эндотелиальные клетки 1 (CD31) и тирозина гидроксилазы, разводят в 1:10 до 1:50 в PBST, соответственно.
Предупреждение: Если два или более видов первичного антитела используются, убедитесь, что существуют различные животные источники. - Смыть первичного антитела с PBST буфера при 37 ° C на день 4 в шейкере.
- Инкубируйте яичника с желаемой вторичные антитела в PBST на 5-6 день при 37 ° C в шейкере. В работе представлены здесь вторичные антитела были Alexa муки 488 гидроксилазы тирозин и 594 муки Alexa для CD31 разводят в 1:50 в PBST.
- Смыть вторичные антитела с PBST буфера при 37 ° C на день 7 в шейкере.
- Перенесите ткани в преломления соответствующие решения для гомогенизации преломления на 8 день. Положите ткань на бумаге с сетки для проверки его четкость, проверяя, можно ли увидеть линии сетки. После того, как полностью выяснены ткани, это может быть imaged.
- Сделать шпаклевки цилиндр, который может просто окружает ткани, формировать его в форме подковы и нажмите хребте внешних плотно на стеклянное скольжение для того чтобы сделать запечатанных пространства. Высота замазка должна быть немного выше, чем завязь.
- Тщательно место осветленный яичника в центр замазкой и добавить преломления соответствующие решения. Плотно стекло дно блюдо над замазкой и использовать замазку исправить блюдо.
3. конфокальная микроскопия
- Для изображений с помощью конфокального микроскопа, в панели «Ni-Е» выбор объектива (в данном случае погружения в воду 25 X объектив, 1.1-NA, 2 мм WD) с правильное рабочее расстояние (в данном случае 2.0 мм).
-
В панели «Приобретение» выберите количество каналов. Здесь используйте три каналы.
- Во-первых используйте вкладку «глаз» и XY контроллер джойстик для перемещения ткани в центре поля, установив через окуляры микроскопа.
- После выключения света затвора, нажмите вкладку «живой», чтобы отрегулировать «мощность лазера», «HV (прибыль)», и «смещение» для каждого канала отдельно. Высокой мощности лазерного и HV может привести к более сигналов, и высокое смещение может уменьшить фоновый шум.
- Выберите правильное «сканирования размер» и «Количество». Использование сканирования размер 1024 x 1024 мкм2 и число от 4 до 8.
-
После настройки качества изображения для определения глубины ткани в панели «Коррекция интенсивность Z» и после нахождения объектив на самый верхний слой яичников (в центре ткани) и корректировки на приобретение для верхнего слоя нажмите кнопку «плюс» кнопку, чтобы определить верхний слой.
- Перемещения объектива вниз и установите соответствующие HV и мощность лазера для нижней части ткани и добавьте низкие слой информацию в таблицу коррекции Z-интенсивности. Нажмите на «Для ND» для синхронизации настройки с помощью панели «ND приобретения».
-
В «приобретение ND» панель, первый набор шагов количество сканирования. Затем поставьте галочку на вкладках «Z» и «Большие изображения».
- Перейдите к окну «Сканирования большого изображения» для определения размера поля согласно границе ткани с помощью визуализации тканей через окуляры. Вернуться к панели «ND приобретение» для ввода размер области сканирования («поля») и выбрать перекрытие между 10% и 15%.
- Нажмите кнопку «Run Z коррекция», не «запустить», чтобы автоматически задать правильное HV, мощность лазера и смещение для каждого слоя и ждать изображения для обработки.
4. 3D-реконструкции отдельных фолликулов и их Vasculatures
- Во-первых используйте ImageJ5 для открытия исходного файла NIS. Нажмите кнопку «Изображение» и выберите «Цвет» и «Разделить каналы». Затем нажмите «Файл» и отдельно сохранить каналы как tiff файл серии с помощью параметра «Последовательности изображений» в «Сохранить как».
- Используйте Imaris чтобы открыть одну из серии файл tiff. Нажмите кнопку «Изменить» и выберите «Добавить каналы» для добавления остальных каналов. На вкладках «Настройки отображения» можно изменить имя и цвет канала. Толщина ткани может потребоваться исправить на панели «Свойства изображения» в раскрывающемся списке в разделе «Edit».
- Для 3D обрезка окончательного изображения и удаление избыточной части, нажмите кнопку «Изменить» и выберите «Обрезать 3D». Размер поля может быть скорректирована путем перетаскивания границы.
-
Реконструировать судна сигналы с алгоритмом нитей в панели Surpass, нажмите кнопку «Нитей» для создания новой нити и нажмите кнопку Далее.
- Чтобы определить самый большой и самый тонкий диаметр, перейдите к панели «Срез» и найти судно трассировки. Расстояние будет автоматически отображается на панели «Мера», выбрав две точки на максимальную ширину судна.
- Вернитесь к панели «Surpass» и ввод измеренная ширина и нажмите кнопку Далее.
- Отрегулируйте порог точки начала и семян. В панели «Камера» выберите «Выбрать». Если некоторые из автоматически производится сферах необходимо удалить, нажмите клавишу shift и нажмите на точку. Выбрав «Навигатор» и перемещая мышь, структура может поворачиваться обеспечить правильный пунктов были сохранены и затем нажмите кнопку Далее.
- Выберите высокий порог для локальный контраст и нажмите кнопку Далее. Не выберите «Обнаруживать колючки» и продолжают завершить реконструкцию цилиндра кровеносного сосуда. Цвет можно изменить, нажав на вкладку «Цвет». Статистические данные могут быть извлечены в панели «Статистика» реконструирован нити накала. Запчасти могут быть удалены в панели «Правка».
Примечание: Другие алгоритмы могут использоваться для измерения объема всего фолликулов или фолликулярные стены. В работе представлены здесь ооциты были отмечены аутофлюоресценция обеих вторичных антител. Из-за большого количества данных рабочих станций сервер использовался для анализа данных.
5. Статистический анализ
Примечание: Данные анализа изображения представлены как средства ± стандартных ошибок.
- Сравнения между фолликулов с помощью независимых образца t теста и использовать тест корреляции Пирсона для сравнения коэффициентов корреляции фолликулярной стены и длина капилляра. Задайте значение P < 0,05 как предел для статистической значимости.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мы адаптировали метод пассивного ЯСНОСТИ в простой и быстрый метод для пассивного яичника, очистка при сохранении фолликулярной и сосудистой архитектуры и получения высоких флуоресцентного сигнала от помечены маркерами судов и фолликулов. 3D архитектура фолликулярной сосудистую определяется иммуноокрашивания для CD31, маркер для6эндотелиальных клеток. CD31 окрашивание в яичниках взрослых мышей была прослежена с использованием алгоритма накаливания и показал взаимосвязь между фолликулярной капилляров и первичных и вторичных фолликулов (рис. 1).
Пятно трансформации и поверхности алгоритмы были использованы для определения тирозин гидроксилазы immunostained ооцитов и гранулезы и гнойный слои и вычислить общий объем фолликулов7,8. Из-за уплотнения фолликулов некоторых частях обрезанное фолликулы были определены полу вручную. После пятно трансформации отдельных фолликулярных объем и ооциты и поверхности реконструкции слои фолликулярной стены и накаливания реконструкции судов снимите отношения между отдельными фолликулярного vasculatures и другие измеренные индексы, особенно гранулезы и гнойный слой томов, были замечены (рис. 2).
Рисунок 1 : С высоким разрешением изображения нетронутыми взрослых мыши яичника после очистки с адаптированы протокол passive ясность. (A-B) Разделы и XYZ большой сканирования приобретения. Три трехмерные (3D) обрезанное среднего (C) и первичных фолликулов (D) (верхняя строка) и 3D реконструкции капилляров, ооциты и гранулезы/гнойный клетки же фолликула (нижний ряд), отображаются как идентифицируется накаливания, поверхность, и Пятно алгоритмы преобразования. Масштаб баров = 200 мкм (A-B), 50 мкм (C), 30 мкм (D). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Сравнительные показатели отношения между первичной и вторичной фолликулы и их vasculatures. Объем яйцеклетки (A) было извлечено после 3D реконструкций фолликулярной объем и яйцеклеток в отдельных фолликулов как определяется алгоритм преобразования пятно, и объем фолликулярной стены (B) был определен на поверхности алгоритм и капилляры были прослежены алгоритмом накаливания. Объем фолликулярной (C), соотношение длины тома/капиллярные ооцитов (D), соотношение длина тома/капиллярные фолликулярной стены (E), соотношение длины фолликулярной тома/капиллярные (F), длина капилляра (H) и Соотношение длины капиллярных и объем фолликулярной стены (G) были рассчитаны с использованием соответствующих средств в пакет программного обеспечения. Планки погрешностей представляют собой стандартные ошибки средств. n = 6; * P < 0,05; ** P < 0.01. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: Трехмерная реконструкция капилляров в вторичных фолликулов яичника мыши. Это показывает полые пространства выше стороне ооцитов фолликулов (белые квадраты показывают границы пространства). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В текущем исследовании мы представляем 3D визуализации для оценки взаимосвязи между капилляров и отдельных растущих фолликулов. В нашей предыдущей работы, используя же протокол 9мы изучили роль крупных сосудистую, взаимодействия между фолликулов и расположение фолликулов в яичниках нетронутыми мыши. Пассивный ЯСНОСТИ подход позволил нам изучать микро - и макро vasculatures, фолликулогенез и взаимосвязи между lutea кавернозных и фолликулов также, чтобы реконструировать яичников архитектуры на разных этапах своего развития.
Для получения данных 3D изображения нетронутыми тканей, процесс очистки является первым важным шагом. Существуют две основные стратегии — методы обезвоживания и гидрофильные реагент на основе методов, таких как пассивный ЯСНОСТИ10. Потому что обезвоживание методы часто приводят к снижению флуоресцентные сигналов и часто производят токсичные органические решение отходов, мы сосредоточили наше внимание на упрощении некоторые шаги метода пассивной ЯСНОСТИ для использования с различными типами ткани.
Первый критический процедура в процессе очистки является transcardial перфузии. Во время перфузии сердце накачки играет важную роль в циркуляции всего тела PBS и гидрогелевые решения, которое может вымывать крови с целью уменьшить фон флуоресценции. Таким образом перфузии операции должны быть выполнены точно и быстро избежать преждевременной смерти животного перед гидрогеля полностью распределены во всем животным. Все агенты должны храниться на льду в течение всего эксперимента, как упомянуто Лян и др. 11, или они начнут полимеризоваться до завершения перфузии. Следующим важным шагом является удаление гидрогеля, и это необходимо удалить как много избыток геля как можно скорее, потому, что он сохранит антител. После очистки ткани, следует удалить из решения очистки и сохраняются в PBS на 4 ° C, потому что слишком много времени в решение очистки вызовет слишком много белка, чтобы быть потеряны. В конфокальной микроскопии изображений, Z-параметры всегда должен иметь значение перед диапазоном X-Y. Если вниз первый диапазон X-Y, Z-параметры не удается синхронизировать все поле X-Y.
Пассивный ЯСНОСТИ был впервые введен Ян и др. 12 в их протокол, они перфузии шаг не выполнить и вместо дегазации с азотом. Кроме того их очистки решения не включать bisacrylamide в растворе гидрогеля, они использовали 8% SDS в решении очистки, и они использовали колеса для преломления соответствие средств массовой информации. Этот метод, впоследствии была улучшена путем повышения концентрации SDS13, добавив шаг перфузии и дегазации азота бесплатная процедура14и объединения метода с другими методами очистки, например ПАРС ударным15. Здесь мы получили дальнейшее развитие протокола путем объединения transcardial перфузии и свободный азот дегазации, уменьшения SDS в решении расчистки до 4% и использование FocusClear в качестве преломления соответствие средств массовой информации, который обеспечивает лучшее качество микроскопии изображений.
После пассивной ЯСНОСТИ конфокальная multiphoton микроскопии и изображения анализ может выполняться для получения неповрежденной 3D архитектура яичников фолликулярной сосудистую. Этот протокол преобразует свет проницаемой нетронутыми завязи в оптически прозрачные гибридизированных гидрогеля нанопористого форму, которая подходит для проникновения макромолекулы как антитела16. В отличие от классического 2D секционные гистологические анализы пассивные ЯСНОСТИ и окрашивание с конкретными маркеры позволяет 3D отображение связей между капилляров и отдельных растущих фолликулов.
Во взрослых тканях активные сосудистого ремоделирования и ангиогенез главным образом происходит при патологических процессах, таких как заживление ран, ремонт трещин, опухоль и метастазы образований, ретинопатии, fibroses и ревматоидный артрит17. Однако циклические изменения в ходе фолликулогенез представляют уникальный потенциал для сосудистую ремоделирования. После формирования антрального в вторичных фолликулов фолликулярная жидкость заполняет его и окружает яйцеклетки, которая обеспечивает подходящую микроокружение для созревания ооцитов и фолликулярной развития18. Предыдущие 2D изображений исследования показали, что фолликулы окружены сетью капилляров в теки interna19. Гранулезы слой nonvascular, и каждый фолликул окружен собственной капилляров. В соответствии с важную роль CD31 в vasculogenesis6, мы обнаружили увеличение капиллярного длиной во время фолликулогенез в процессе перехода от начального к вторичных фолликулов (цифры 2 g и 2 H). Вместо случайное распределение капилляров вокруг отдельных первичных или вторичных фолликулов показал, что капиллярные ветви, распределенных в фолликулах были обнаруживаемыми в крупных фолликулов 3D реконструкции капилляров и в большинстве случаев эти капиллярные ветви сформировали полые пространства (рис. 3).
Одна из основных проблем является что адаптированный метод занимает относительно много времени, чтобы очистить яичника, но долгое время требуется для лучшего эффекта очистки. Чтобы сэкономить время, мы рекомендуем, сбор всех необходимых образцов в одно время и очистки их вместе, потому что очищается тканей может храниться в PBS и 0,02% азид натрия при температуре 4 ° C на несколько месяцев. Еще одним ограничением является рабочее расстояние конфокального микроскопа. Увеличение цель линзы имеют короткие расстояния в рабочих, которые могут быть препятствием для визуализации толщиной образцов.
Для визуализации прозрачной и нетронутыми тканей, включая БАББ20, масштаб21, 3DISCO22, ClearT23, SeeDB24, ЯСНОСТИ16, пассивные ЯСНОСТИ были введены несколько протоколов (с4 или без25Гидрогель) Пакт12,27КУБИЧЕСКИХ26,, FASTClear28и факт29, но только три из них были использованы для всей яичников ткани очистка и оценки9, 30,31. Для отображения всей яичников тканей были введены SeeDB30 и ScaleA231 , но эти протоколы разрешить только один иммуноокрашивания шаг. Пассивные ЯСНОСТИ, однако, позволяет несколько реакций белков маркировки, как показано в настоящем исследовании и в наших предыдущих исследований9.
В заключение наша адаптированы протокол для определения 3D структурных отношений между фолликулярной слои и кровеносных сосудов с использованием всего уточнить тканей яичника обеспечивает новый подход для изучения ангиогенез при различных заболеваниях яичников, такие как синдром поликистозных яичников и рака яичников.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано грантов из китайского Специального фонда для постдокторантов (№ 2014T70392 до YF), Фонд национального естественных наук Китая (№ 81673766 до YF), новый учитель грунтовка фонд, Zuoxue фонд университета Фудань и развитие Проект пик Шанхай дисциплин интегративной медицины (20150407).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acrylamide | Vetec | v900845 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/vetec/v900845 |
| Alexa Flour 488 (Dilution 1:50) | Life Technologies | A11039 | https://www.thermofisher.com/antibody/product/Goat-anti-Chicken-IgY-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11039 |
| Alexa Flour 594 (Dilution 1:50) | Life Technologies | A11012 | https://www.thermofisher.com/antibody/product/Goat-anti-Rabbit-IgG-H-L-Cross-Adsorbed-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11012 |
| Bisacrylamide | Amresco | 172 | http://www.amresco-inc.com/BIS-ACRYLAMIDE-0172.cmsx |
| Black wall glass bottom dish (Willco-Dish) | Ted Pella | 14032 | http://www.tedpella.com/section_html/706dish.htm#black_wall |
| Boric acid | Sinopharm Chemical Reagent | 10004818 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10004818 |
| Disodium hydrogen phosphate dodecahydrate (Na2HPO4 12H2O) | Sinopharm Chemical Reagent | 10020318 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10020318 |
| FocusClear | Celexplorer | FC-102 | http://www.celexplorer.com/product_list.asp?MainType=107&BRDarea=1 |
| Parafilm | Bemis | PM996 | http://www.parafilm.com/products |
| Paraformaldehyde | Sinopharm Chemical Reagent | 80096618 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=80096618 |
| PECAM1/CD31, platelet-endothelial cell adhesion molecule 1 (Dilution 1:10) | Abcam | ab28364 | http://www.abcam.com/cd31-antibody-ab28364.html |
| Photoinitiator VA044 | Wako | va-044/225-02111 | http://www.wako-chem.co.jp/specialty/waterazo/VA-044.htm |
| Sodium azide | Sigma | S2002 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/s2002?lang=en®ion=US |
| Sodium chloride (NaCl) | Sinopharm Chemical Reagent | 10019318 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10019318 |
| Sodium dihydrogen phosphate dihydrate (NaH2PO4 2H2O) | Sinopharm Chemical Reagent | 20040718 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=20040718 |
| Sodium dodecyl sulfate | Sinopharm Chemical Reagent | 30166428 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=30166428 |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sinopharm Chemical Reagent | 10019718 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10019718 |
| Triton X-100 | Sinopharm Chemical Reagent | 30188928 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=30188928 |
| Tyrosine hydroxylase (TH, Dilution 1:50) | Abcam | ab76442 | http://www.abcam.com/tyrosine-hydroxylase-phospho-s40-antibody-ab51206.html |
References
- Brown, H. M., Russell, D. L. Blood and lymphatic vasculature in the ovary: development, function and disease. Hum Reprod Update. 20 (1), 29-39 (2014).
- McFee, R. M., et al. Inhibition of vascular endothelial growth factor receptor signal transduction blocks follicle progression but does not necessarily disrupt vascular development in perinatal rat ovaries. Biol Reprod. 81 (5), 966-977 (2009).
- Coveney, D., Cool, J., Oliver, T., Capel, B. Four-dimensional analysis of vascularization during primary development of an organ, the gonad. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (20), 7212-7217 (2008).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nat Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an Open Source platform for biological image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Cao, G., Fehrenbach, M. L., Williams, J. T., Finklestein, J. M., Zhu, J. X., Delisser, H. M. Angiogenesis in platelet endothelial cell adhesion molecule-1-null mice. Am J Pathol. 175 (2), 903-915 (2009).
- Manni, L., Holmäng, A., Lundeberg, T., Aloe, L., Stener-Victorin, E. Ovarian expression of alpha (1)- and beta (2)-adrenoceptors and p75 neurotrophin receptors in rats with steroid-induced polycystic ovaries. Auton Neurosci. 118 (1 - 2), 79-87 (2005).
- Chourasia, T. K., Chaube, R., Singh, V., Joy, K. P. Annual and periovulatory changes in tyrosine hydroxylase activity in the ovary of the catfish Heteropneustes fossilis. Gen Comp Endocrinol. 166 (1), 111-116 (2010).
- Feng, Y., et al. CLARITY reveals dynamics of ovarian follicular architecture and vasculature in three-dimensions. Sci Rep. 7, 44810 (2017).
- Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. Chemical principles in tissue clearing and staining protocols for whole-body cell profiling. Annu Rev Cell Dev Biol. 32, 713-741 (2016).
- Liang, H., Schofield, E., Paxinos, G. Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique. J Vis Exp. (108), e53673 (2016).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
- Phillips, J., Laude, A., Lightowlers, R., Morris, C. M., Turnbull, D. M., Lax, N. Z. Development of passive CLARITY and immunofluorescent labelling of multiple proteins in human cerebellum: understanding mechanisms of neurodegeneration in mitochondrial disease. Sci Rep. 6, 26013 (2016).
- Roberts, D. G., Johnsonbaugh, H. B., Spence, R. D., MacKenzie-Graham, A. Optical clearing of the mouse central nervous system using passive CLARITY. J Vis Exp. (112), (2016).
- Woo, J., Lee, M., Seo, J. M., Park, H. S., Cho, Y. E. Optimization of the optical transparency of rodent tissues by modified PACT-based passive clearing. Exp Mol Med. 48 (12), e274 (2016).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Chung, A. S., Ferrara, N.
- Rodgers, R. J., Irving-Rodgers, H. F. Formation of the ovarian follicular antrum and follicular fluid. Biol Reprod. 82 (6), 1021-1029 (2010).
- Siu, M. K. Y., Cheng, C. Y. The blood-follicle barrier (BFB) in disease and in ovarian function. Adv Exp Med Biol. 763, 186-192 (2014).
- Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nat Methods. 4, 331-336 (2007).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat Protoc. 7, 1983-1995 (2012).
- Kuwajima, T., et al. Clear(T): a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140, 1364-1368 (2013).
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat Neurosci. 16, 1154-1161 (2013).
- Lai, H. M., et al. Rationalisation and validation of an acrylamide-free procedure in three-dimensional histological imaging. PLOS ONE. 11, e0158628 (2016).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157, 726-739 (2014).
- Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159, 911-924 (2014).
- Liu, A. K. L., Lai, H. M., Chang, R. C. C., Gentleman, S. M. Free-of-acrylamide SDS-based tissue clearing (FASTClear): A novel protocol of tissue clearing for three-dimensional visualisation of human brain tissues. Neuropathol Appl Neurobiol. 43, 346-351 (2016).
- Xu, N., et al. Fast free-of-acrylamide clearing tissue (FACT)-an optimized new protocol for rapid, high-resolution imaging of three-dimensional brain tissue. Sci Rep. 7, 9895 (2017).
- Migone, F. F., Cowan, R. G., Williams, R. M., Gorse, K. J., Zipfel, W. R., Quirk, S. M. In vivo imaging reveals an essential role of vasoconstriction in rupture of the ovarian follicle at ovulation. Proc Natl Acad Sci U S A. 113, 2294-2299 (2016).
- Malki, S., Tharp, M. E., Bortvin, A. A whole-mount approach for accurate quantitative and spatial assessment of fetal oocyte dynamics in mice. Biol Reprod. 93 (113), (2015).
