JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Biology

3-dimensjonal modell av vaskulær arkitekturen av passiv KLARHET klarert musen eggstokkene

Published: December 10, 2017
doi:
10.3791/56141
, , ,
1Department of Integrative Medicine and Neurobiology, School of Basic Medical Sciences; Institutes of Brain Science, Brain Science Collaborative Innovation Center, State Key Laboratory of Medical Neurobiology, Institute of Acupuncture and Moxibustion, Fudan Institutes of Integrative Medicine,Fudan University, 2Program of Reproductive and Stem Cell Biology, Department of Obstetrics and Gynecology, Stanford University School of Medicine,Stanford University

Summary

Her presenterer vi en tilpasning av passiv KLARHET og 3D rekonstruksjon metoden for visualisering av eggstokkene blodkar og follikulær kapillærene i intakt musen eggstokkene.

Abstract

Eggstokken er den største orgelet av kvinnelige reproduktive system og er avgjørende for produksjonen av kvinnelige gameter og kontrollere det endokrine systemet, men komplekse strukturelle relasjoner og tredimensjonale (3D) blodkar arkitekturer av den eggstokken er ikke godt beskrevet. For å visualisere 3D tilkoblinger og arkitektur av blodkar i intakt eggstokken, er den første viktige skrittet å gjøre eggstokken optisk klart. For å unngå vev krymping, vi brukte hydrogel fiksering-baserte passiv KLARHET (Fjern Lipid-byttet akrylamid-hybridiserte Rigid tenkelig / Immunostaining/In situ-hybridisering-kompatible vev Hydrogel) protokollen metoden å fjerne en intakt eggstokk . Immunostai-avansert multiphoton AC confocal mikroskopi og 3D image-rekonstruksjoner ble deretter brukt for visualisering av eggstokkene fartøy og follikulær kapillærer. Bruker denne tilnærmingen, vi viste en signifikant positiv sammenheng (P < 0,01) mellom follikulær kapillærene og volumet av follikulær veggen.

Introduction

Hårsekken er eggstokken grunnleggende strukturelle og funksjonelle enheten, og utviklingen er svært knyttet til blodkar i eggstokken. Blodkar ernæring og hormoner til hårsekkene og dermed spille en viktig rolle i vekst og modning av hårsekkene1.

En kombinasjon av teknologier, inkludert selektiv blodkar markører, transgene musen modeller og farmasøytisk utvikling, har økt vår kunnskap om eggstokkene vaskulære nettverk, angiogenese og funksjonen av blodkarene i folliculogenesis. Eggstokken er kjent som en aktiv organ fordi det remodels ulike vev og vaskulære nettverk under folliculogenesis og eggløsning. Slik aktive remodeling i størrelse og struktur av fartøy kreves for funksjonen biologisk utvikling og rekruttere follikler.

Tradisjonelle histologiske og histomorphometric metoder ovarian delene og immunolabeling av blod fartøy er begrenset til todimensjonal (2D) bilder2. Med utviklingen av tredimensjonale (3D) rekonstruksjon teknologier, 2D-bilder av vev skiver kan overlappe hverandre for å lage en 3D-struktur, men denne metoden har fortsatt noen begrensninger-skjæring av vev kan ødelegge microstructures, deler av den vev er ofte mangler, og betydelig arbeid er involvert i å gjøre 3D rekonstruksjoner fra profilen oppnådd fra skiver. Hele-vev 3D-bildebehandling med AC confocal mikroskopi kan overvinne mange av disse begrensningene, men disse metodene er begrenset til evalueringen av angiogenese i embryonale eggstokk3. Ved hjelp av hele vev fjerne metoder som KLARHET4 kan øke visualisert volumet for å løse disse problemene i postnatal og voksen eggstokkene, og slike metoder gir optisk klarering av eggstokken uten noen strukturelle deformasjoner. Avbildning av 3D arkitektur intakt eggstokken gir en nøyaktig bildedatabase for analyseprogramvare, for eksempel Imaris programvarepakken brukt i dette arbeidet.

Ombygging av eggstokk gjennom hele voksenlivet er en del av en dynamisk fysiologiske systemet, og dette gjør eggstokken en utmerket modell for etterforskning regulering av angiogenese. Videre kan vurdere rollen ovarian blodkar i patologisk forhold til kvinnelige reproduktive system som polycystisk ovariesyndrom eller ovarian kreft studeres gjennom hele ovarian vev avbildning. Utviklingen av metoden for passiv KLARHET og bruk av avansert analyseprogramvare har gitt detaljert romlig informasjon om forholdet mellom blodkar og eggstokkene strukturer som follikler.

Protocol

Alle prosedyrer som involverer dyr fag fulgt retningslinjene i dyr etiske komiteen ved Shanghai Medical College, Fudan University (godkjenningsnummer 20160225-013). 1. forberedelse av gjennomsiktig musen eggstokkene Forberedelse av løsninger Forberede fosfat-bufret (PBS) saltløsning (1 M, pH 7.6) med 0,1% Triton X-100 (PBST). For å gjøre 1 L 10 x PBS lagerløsning, bland 87 g NaCl, 3.1 g NaH2PO4 · 2H2O og 28.7 g av Na<…

Representative Results

Vi tilpasset metoden for passiv KLARHET i en rask og enkel metode for passiv eggstokk fjerne samtidig bevare den follikulære og vaskulær arkitekturen og få høyest fluorescerende signalet fra merket markører av fartøy og follikler. 3D arkitektur er follikulær blodkar ble bestemt av immunostaining for CD31, en markør for endotelceller6. CD31 flekker i eggstokkene voksen mus ble sporet ved hjelp av Filament algoritmen og viste innbyrdes forbindelser mellom fol…

Discussion

I denne studien presenterer vi 3D bildeprodukter for å vurdere relasjonene mellom kapillærene og personlige voksende follikler. I vår tidligere arbeid bruker den samme protokollen 9, studerte vi rollene til store blodkar, interaksjoner mellom follicles og plasseringen av hårsekkene i intakt musen eggstokkene. Passiv KLARHET tilnærming tillot oss å studere mikro – og makro-vasculatures, folliculogenesis og sammenhengen mellom corpora lutea og follikler samt å rekonstruere ovarian arkitekture…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Denne studien ble støttet av tilskudd fra den kinesiske spesielt fond for postdoc (nr. 2014T70392 til YF), den nasjonale Natural Science Foundation i Kina (nr. 81673766 til YF), nye læreren grunning fondet, Zuoxue grunnvoll Fudan University og utvikling Prosjekt av Shanghai Peak disipliner-Integrative Medicine (20150407).

Materials

Acrylamide Vetec v900845 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/vetec/v900845
Alexa Flour 488 (Dilution 1:50)  Life Technologies A11039 https://www.thermofisher.com/antibody/product/Goat-anti-Chicken-IgY-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11039
Alexa Flour 594 (Dilution 1:50) Life Technologies A11012 https://www.thermofisher.com/antibody/product/Goat-anti-Rabbit-IgG-H-L-Cross-Adsorbed-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11012
Bisacrylamide Amresco 172 http://www.amresco-inc.com/BIS-ACRYLAMIDE-0172.cmsx
Black wall glass bottom dish (Willco-Dish) Ted Pella 14032 http://www.tedpella.com/section_html/706dish.htm#black_wall
Boric acid Sinopharm Chemical Reagent 10004818 http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10004818
Disodium hydrogen phosphate dodecahydrate (Na2HPO4 12H2O) Sinopharm Chemical Reagent 10020318 http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10020318
FocusClear Celexplorer FC-102 http://www.celexplorer.com/product_list.asp?MainType=107&BRDarea=1
Parafilm Bemis PM996 http://www.parafilm.com/products
Paraformaldehyde Sinopharm Chemical Reagent 80096618 http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=80096618
PECAM1/CD31, platelet-endothelial cell adhesion molecule 1 (Dilution 1:10) Abcam ab28364 http://www.abcam.com/cd31-antibody-ab28364.html
Photoinitiator VA044 Wako va-044/225-02111 http://www.wako-chem.co.jp/specialty/waterazo/VA-044.htm
Sodium azide Sigma S2002 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/s2002?lang=en&region=US
Sodium chloride (NaCl) Sinopharm Chemical Reagent 10019318 http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10019318
Sodium dihydrogen phosphate dihydrate (NaH2PO4 2H2O) Sinopharm Chemical Reagent 20040718 http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=20040718
Sodium dodecyl sulfate Sinopharm Chemical Reagent 30166428 http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=30166428
Sodium hydroxide (NaOH) Sinopharm Chemical Reagent 10019718 http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10019718
Triton X-100 Sinopharm Chemical Reagent 30188928 http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=30188928
Tyrosine hydroxylase (TH, Dilution 1:50) Abcam ab76442 http://www.abcam.com/tyrosine-hydroxylase-phospho-s40-antibody-ab51206.html
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brown, H. M., Russell, D. L. Blood and lymphatic vasculature in the ovary: development, function and disease. Hum Reprod Update. 20 (1), 29-39 (2014).
  2. McFee, R. M., et al. Inhibition of vascular endothelial growth factor receptor signal transduction blocks follicle progression but does not necessarily disrupt vascular development in perinatal rat ovaries. Biol Reprod. 81 (5), 966-977 (2009).
  3. Coveney, D., Cool, J., Oliver, T., Capel, B. Four-dimensional analysis of vascularization during primary development of an organ, the gonad. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (20), 7212-7217 (2008).
  4. Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nat Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).
  5. Schindelin, J., et al. Fiji: an Open Source platform for biological image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  6. Cao, G., Fehrenbach, M. L., Williams, J. T., Finklestein, J. M., Zhu, J. X., Delisser, H. M. Angiogenesis in platelet endothelial cell adhesion molecule-1-null mice. Am J Pathol. 175 (2), 903-915 (2009).
  7. Manni, L., Holmäng, A., Lundeberg, T., Aloe, L., Stener-Victorin, E. Ovarian expression of alpha (1)- and beta (2)-adrenoceptors and p75 neurotrophin receptors in rats with steroid-induced polycystic ovaries. Auton Neurosci. 118 (1 – 2), 79-87 (2005).
  8. Chourasia, T. K., Chaube, R., Singh, V., Joy, K. P. Annual and periovulatory changes in tyrosine hydroxylase activity in the ovary of the catfish Heteropneustes fossilis. Gen Comp Endocrinol. 166 (1), 111-116 (2010).
  9. Feng, Y., et al. CLARITY reveals dynamics of ovarian follicular architecture and vasculature in three-dimensions. Sci Rep. 7, 44810 (2017).
  10. Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. Chemical principles in tissue clearing and staining protocols for whole-body cell profiling. Annu Rev Cell Dev Biol. 32, 713-741 (2016).
  11. Liang, H., Schofield, E., Paxinos, G. Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique. J Vis Exp. (108), e53673 (2016).
  12. Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
  13. Phillips, J., Laude, A., Lightowlers, R., Morris, C. M., Turnbull, D. M., Lax, N. Z. Development of passive CLARITY and immunofluorescent labelling of multiple proteins in human cerebellum: understanding mechanisms of neurodegeneration in mitochondrial disease. Sci Rep. 6, 26013 (2016).
  14. Roberts, D. G., Johnsonbaugh, H. B., Spence, R. D., MacKenzie-Graham, A. Optical clearing of the mouse central nervous system using passive CLARITY. J Vis Exp. (112), (2016).
  15. Woo, J., Lee, M., Seo, J. M., Park, H. S., Cho, Y. E. Optimization of the optical transparency of rodent tissues by modified PACT-based passive clearing. Exp Mol Med. 48 (12), e274 (2016).
  16. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
  17. Chung, A. S., Ferrara, N. Developmental and pathological angiogenesis. Annu Rev Cell Dev Biol. 27, 563-584 (2011).
  18. Rodgers, R. J., Irving-Rodgers, H. F. Formation of the ovarian follicular antrum and follicular fluid. Biol Reprod. 82 (6), 1021-1029 (2010).
  19. Siu, M. K. Y., Cheng, C. Y. The blood-follicle barrier (BFB) in disease and in ovarian function. Adv Exp Med Biol. 763, 186-192 (2014).
  20. Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nat Methods. 4, 331-336 (2007).
  21. Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).
  22. Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat Protoc. 7, 1983-1995 (2012).
  23. Kuwajima, T., et al. Clear(T): a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140, 1364-1368 (2013).
  24. Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat Neurosci. 16, 1154-1161 (2013).
  25. Lai, H. M., et al. Rationalisation and validation of an acrylamide-free procedure in three-dimensional histological imaging. PLOS ONE. 11, e0158628 (2016).
  26. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157, 726-739 (2014).
  27. Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159, 911-924 (2014).
  28. Liu, A. K. L., Lai, H. M., Chang, R. C. C., Gentleman, S. M. Free-of-acrylamide SDS-based tissue clearing (FASTClear): A novel protocol of tissue clearing for three-dimensional visualisation of human brain tissues. Neuropathol Appl Neurobiol. 43, 346-351 (2016).
  29. Xu, N., et al. Fast free-of-acrylamide clearing tissue (FACT)-an optimized new protocol for rapid, high-resolution imaging of three-dimensional brain tissue. Sci Rep. 7, 9895 (2017).
  30. Migone, F. F., Cowan, R. G., Williams, R. M., Gorse, K. J., Zipfel, W. R., Quirk, S. M. In vivo imaging reveals an essential role of vasoconstriction in rupture of the ovarian follicle at ovulation. Proc Natl Acad Sci U S A. 113, 2294-2299 (2016).
  31. Malki, S., Tharp, M. E., Bortvin, A. A whole-mount approach for accurate quantitative and spatial assessment of fetal oocyte dynamics in mice. Biol Reprod. 93 (113), (2015).

Tags

3D ReconstructionVascular ArchitectureCLARITY-clearedMouse OvaryFollicle DevelopmentSomatic CellsVascular SystemNervous SystemPassive CLARITYImage AnalysisImarisPerfusionHydrogelOvarian Bursa

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Hu, W., Tamadon, A., Hsueh, A. J., Feng, Y. Three-dimensional Reconstruction of the Vascular Architecture of the Passive CLARITY-cleared Mouse Ovary. J. Vis. Exp. (130), e56141, doi:10.3791/56141 (2017).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image