Biology

Vivo में वास्तविक समय Arabidopsis कैल्शियम संकेतों की रिकॉर्डिंग कीट एक फ्लोरोसेंट के साथ उपयोग कर खिलाने के दौरान

Published: August 15, 2017 doi: 10.3791/56142

Thomas R. Vincent¹, James Canham¹, Masatsugu Toyota^2,3,4, Marieta Avramova¹, Sam T. Mugford⁵, Simon Gilroy², Anthony J. Miller¹, Saskia Hogenhout⁵, Dale Sanders¹

¹Department of Metabolic Biology, John Innes Centre, Norwich Research Park, ²Department of Botany, University of Wisconsin, Madison, ³Department of Biochemistry and Molecular Biology, Saitama University, ⁴Precursory Research for Embryonic Science and Technology (PRESTO), Japan Science and Technology Agency (JST), ⁵Department of Cell and Developmental Biology, John Innes Centre, Norwich Research Park

Summary

यह प्रोटोकॉल ऐसे एफ़िड्स के रूप में hemipteran कीड़ों खिला द्वारा उत्पंन पौधों में कैल्शियम संकेतों का विश्लेषण करने के लिए एक सरल विधि की रूपरेखा । Arabidopsis थालियाना एक उच्च लौकिक और स्थानिक संकल्प के साथ कैल्शियम गतिशीलता के vivo इमेजिंग में वास्तविक समय के लिए GFP कैल्शियम GCaMP3 के साथ बदल दिया है ।

Abstract

कैल्शियम आयनों बायोटिक बातचीत के दौरान प्रमुख संकेत संस्थाओं होने की भविष्यवाणी कर रहे हैं, कैल्शियम के साथ माइक्रोबियल और चबाने वाले कीड़ों की वजह से घाव भरने के लिए संयंत्र रक्षा प्रतिक्रिया का एक हिस्सा स्थापित करने संकेत, प्रणालीगत कैल्शियम पौधों में संकेत । हालांकि, बायोटिक तनाव के दौरान वीवो में कैल्शियम की भूमिका अभी भी अस्पष्ट है । यह प्रोटोकॉल एक hemipteran कीट द्वारा खिलाने के दौरान पौधों में कैल्शियम संकेतों का पता लगाने के लिए एक आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग कैल्शियम सेंसर के उपयोग का वर्णन करता है । Hemipterans जैसे एफ़िड्स पियर्स विशेष के साथ कोशिकाओं की एक छोटी संख्या, लंबी चूसने मुँह, उंहें आदर्श उपकरण बनाने के लिए कैल्शियम गतिशीलता का अध्ययन जब एक संयंत्र एक बायोटिक तनाव है, जो एक घायल प्रतिक्रिया से अलग है के साथ सामना करना पड़ा है । इसके अलावा, फ्लोरोसेंट सेंसर दोनों जानवरों और पौधों में vivo में संकेत अणुओं की माप में क्रांतिकारी बदलाव कर रहे हैं । एक उच्च स्थानिक और लौकिक संकल्प के साथ, कीट खिलाने के दौरान संयंत्र कैल्शियम गतिशीलता के वास्तविक समय इमेजिंग के लिए अनुमति देता है, मॉडल संयंत्र Arabidopsis थालियाना में एक GFP आधारित कैल्शियम, GCaMP3, व्यक्त । एक दोहराने और मजबूत परख अलग GCaMP3 पत्तियों की प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर विकसित किया गया है, cytosolic कैल्शियम गतिशीलता के सतत माप के लिए अनुमति देने से पहले, दौरान, और कीट खिलाने के बाद । यह एक उच्च स्थानीयकृत एफ़िड खिला साइट है कि कुछ ही मिनटों के भीतर होता है चारों ओर तेजी से कैल्शियम उंनयन पता चलता है । प्रोटोकॉल इस तरह के अतिरिक्त कीट प्रजातियों के रूप में अंय बायोटिक तनाव, के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, जबकि Arabidopsis थालियाना का उपयोग म्यूटेंट की तेजी से पीढ़ी के लिए अनुमति देता है के लिए घटना के आणविक विश्लेषण की सुविधा ।

Introduction

कैल्शियम (सीए^{2 +}) पौधों में सबसे सर्वव्यापी संकेत तत्वों में से एक है । cytosolic ca में एक परिवर्तनीय वृद्धि^{2 +} एकाग्रता ([ca^{2 +}]_cyt) बहाव घटकों के एक जटिल नेटवर्क द्वारा डीकोड है और दोनों अजैव और बायोटिक तनाव के जवाब में शामिल है¹^,². [Ca^{2 +}] में वृद्धि_cytएक माइक्रोबियल संरक्षा के लिए पहली प्रतिक्रियाओं में से एक है, संयंत्र सुरक्षा प्रतिक्रिया³^,⁴^,⁵का एक आम हिस्सा बनाने । [Ca^{2 +}] में उगता है_cyt भी चबाने कीड़े, जैसे lepidopterans⁶^,⁷की वजह से घायल करने के लिए प्रतिक्रिया में मनाया गया है । हालांकि, संयंत्र Ca के संभावित भूमिका^{2 +} बायोटिक खतरों है कि केवल कुछ कोशिकाओं को नुकसान का कारण नहीं पता लगाया गया है जीने के लिए प्रतिक्रिया में संकेत । ग्रीन पीच एफ़िड Myzus persicae एक hemipteran कीट है जो विश्व कृषि के लिए एक महत्वपूर्ण खतरा है⁸^,⁹, और Ca^{2 +} समाप्ति अंतरिक्ष से extracellular पत्तियों में मनाया गया है एम. persicae¹⁰के साथ पीड़ित । इस प्रोटोकॉल संयंत्र सीए^{2 +} संकेतों को मापने के लिए एक मजबूत और दोहराने की विधि रूपरेखा जबकि एम. persicae एक फ्लोरोसेंट सीए^{2 +} का उपयोग कर पत्तियों से अधिक सेंसर, दोनों एफ़िड्स और GCaMP3 की पेशकश के साथ उपंयास उपकरण है जिसके साथ बायोटिक इंटरैक्शन के दौरान Ca^{2 +} की भूमिका टुकड़े ।

ca^{2 +}-चयनात्मक microelectrodes पूर्व में मापने के लिए इस्तेमाल किया गया [ca^{2 +}] पौधों में¹¹^,¹²। हाल ही में, bioluminescent और फ्लोरोसेंट दृष्टिकोण मानकीकृत हो गए हैं । इन उपसेंसरों सीए^{2 +} बाइंड और प्रकाश का उत्सर्जन, संयुक्त राष्ट्र के समानांतर के लिए अनुमति देता है दोनों कोशिकाओं और पूरे ऊतकों में सीए^{2 +}गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए अवसरों । सीए^{2 +} के रूप में परिवर्तन (यानी, आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग है) के माध्यम से जीव के जीनोम में विसेंसर कोडिंग अनुक्रम की शुरूआत पर उत्पादित रंग या छुरा के रूप में इंजेक्ट किया जा सकता है । उत्तरार्द्ध आसानी से जीवित ऊतक में व्यक्त किया जा रहा है और उपसेलुलर स्थानीयकरण¹³में सक्षम होने का प्रमुख लाभ प्रदान करता है । aequorin प्रोटीन, Aequorea विक्टोरिया (जेलिफ़िश) से पृथक पहले आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग सीए^{2 +} ¹⁴संयंत्रों में तैनात संवेदक था । एक bioluminescent प्रोटीन के रूप में, aequorin बाहरी प्रकाश द्वारा उत्तेजना की आवश्यकता नहीं है, जो chromophore ब्लीचिंग और autofluorescence¹⁵से परहेज । Aequorin सफलतापूर्वक मापने के लिए इस्तेमाल किया गया है [Ca^{2 +}] तापमान सहित विभिंन उत्तेजनाओं के जवाब में प्रवाह¹⁶, रोगजनकों¹⁷^,¹⁸^,¹⁹, नमक²⁰ तनाव^,²¹, और⁷घायल । हालांकि, यह अपेक्षाकृत कम संकेत तीव्रता से वंचित है, [Ca^{2 +}का पता लगाने के बना] व्यक्तिगत कोशिकाओं में प्रवाह और खराब सेंसर अभिव्यक्ति मुश्किल¹³के साथ ऊतकों से ।

ca के विकास के^{2 +} fluoresce कर सकते हैं कि विस्तृत उपसेलुलर और ऊतक के स्तर के विश्लेषण के लिए अनुमति देकर aequorin पूरित किया गया है^{2 +} गतिशीलता. सबसे आम फ्लोरोसेंट में से एक संवेदी प्रतिदीप्ति अनुनाद ऊर्जा अंतरण (झल्लाहट)-आधारित Cameleons हैं । झल्लाहट Cameleons दो प्रोटीन से बना रहे हैं, आमतौर पर और YFP, जो निकट संपर्क में Ca^{2 +} के बंधन से प्रेरित परिवर्तन द्वारा लाया जाता है-YFP linker क्षेत्र में एक calmodulin डोमेन । यह संपर्क YFP से ऊर्जा के हस्तांतरण की अनुमति देता है, और इन fluorophores के प्रतिदीप्ति में परिणामी परिवर्तन [Ca^{2 +}] के प्रतिदीप्ति संकेतों के अनुपात की गणना के माध्यम से दो से सटीक ठहराव के लिए अनुमति देता है fluorophores^२२. झल्लाहट Cameleons aequorin और गैर ratiometric फ्लोरोसेंट रंजक से बेहतर हैं, क्योंकि वे कम प्रोटीन की अभिव्यक्ति के स्तर²³ से प्रभावित होते है और अक्सर एक अधिक फ्लोरोसेंट उपज है, सेलुलर और सेलुलर इमेजिंग के लिए अनुमति²³। उदाहरण के लिए, झल्लाहट Cameleons हाल ही में पौधों में लंबी दूरी के सीए^{2 +} संकेतों की पहचान करने के लिए और सेलुलर स्तर²⁴^,²⁵^,²⁶के लिए इन को हल करने के लिए इस्तेमाल किया गया है ।

फ्लोरोसेंट GFP के साथ हाल ही में एक सफलता-Ca के आधार पर^{2 +} अति संवेदनशील एकल fluorophore (एकल एफ पी) के विकास किया गया है संवेदी । एकल-FP एक परिपत्र permutated GFP एक calmodulin और M13 पेप्टाइड से जुड़ा हुआ है, एक एकल-एफ पी सेंसर से मिलकर बनता है, Ca के साथ^{2 +} calmodulin के लिए बाध्यकारी, calmodulin और GFP के बीच एक पानी की मध्यस्थता प्रतिक्रिया में जिसके परिणामस्वरूप ताकि protonate GFP और बढ़ाने के लिए फ्लोरोसेंट उपज²⁷^,²⁸^,²⁹। एकल-FP सेंसर सरल प्रयोगात्मक डिजाइन और इमेजिंग³⁰के एक संभावित उच्च लौकिक संकल्प सहित झल्लाहट Cameleons, पर कई लाभ प्रदान करते हैं । हालांकि एकल-FP सेंसर निरपेक्ष नहीं कर सकते [Ca^{2 +}] के रूप में बस की झल्लाहट सेंसर, वे के विश्लेषण के लिए बेहतर है अस्थाई और स्थानिक गतिशीलता के ca^{2 +} सिग्नल⁵^,²³। GCaMPs सबसे स्थापित एकल-FP सेंसर²⁸ में से एक है और उनके फ्लोरोसेंट उपज बढ़ाने के लिए कई संशोधन आया है, गतिशील रेंज, Ca^{2 +} संबध, और सिग्नल-शोर अनुपात³¹^,^३२ ^, ^३३ ^, ^३४. GCaMPs सफलतापूर्वक पशु प्रणालियों में इस्तेमाल किया गया है, जैसे zebrafish मोटर न्यूरॉन्स^३५ और फल फ्लाई neuromuscular जंक्शनों^३४. GCaMP3 के यादृच्छिक mutagenesis ultrasensitive GCaMP6^३६ और GECOs²⁹सहित एकल-FP सेंसरों की अतिरिक्त कक्षाओं में हुई है । GECOs हाल ही में Arabidopsis थालियाना में इस्तेमाल किया गया (इसके बाद Arabidopsis के रूप में जाना जाता है) को मापने के लिए सीए^{2 +} एटीपी, काइटिन के जवाब में प्रवाह, और बैक्टीरियल flg22 । इस अध्ययन में यह भी दिखा है कि आर GECO-अधिक संकेत परिवर्तन और संकेत करने के लिए शोर अनुपात के संदर्भ में Cameleon yc 3.6 से अधिक प्रदर्शन किया सेंसर⁵।

क्योंकि उपयोग की आसानी, उच्च फ्लोरोसेंट उपज, और उच्च लौकिक संकल्प है कि GCaMP के साथ प्राप्त किया जा सकता है, GCaMP3 आनुवंशिक रूप से फूलगोभी मोज़ेक वायरस 35S प्रमोटर के तहत Arabidopsis में इनकोडिंग था । आनुवंशिक Arabidopsis अनुसंधान के लिए उपलब्ध उपकरण Ca के विस्तृत आणविक विश्लेषण के लिए अनुमति^{2 +} GCaMP3 द्वारा मापा संकेत । इसके अलावा, GCaMP3 एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत बजाय एक महंगा फोकल प्रणाली की कल्पना की जा सकती है । इस प्रोटोकॉल पूरे ऊतक इमेजिंग के लिए अनुमति देता है, जब जीना बायोटिक तनाव के साथ प्रयोग का आयोजन आवश्यक है । प्रयोग इस तरह बनाया गया है कि 35S से अलग पत्तियों :: GCaMP3 पौधों पानी में तैरता है, कीट बचने को रोकने के लिए और एक विशिष्ट ऊतक के लिए खिला को प्रतिबंधित करने के लिए कर रहे हैं । इस पत्र में उल्लिखित विधि इसलिए एम. persicae द्वारा खिलाने के दौरान पत्ती Ca^{2 +} गतिशीलता के विश्लेषण के लिए अनुमति देता है, एक उपंयास संकेत प्रतिक्रिया संयंत्र के लक्षण वर्णन में जिसके परिणामस्वरूप । इस विधि भी अन्य बायोटिक तनावों के साथ काम करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता, जैसे अतिरिक्त कीट प्रजातियों और माइक्रोबियल रोगजनकों, और अन्य पौधों के ऊतकों, जैसे जड़ों के साथ.

Protocol

1. संयंत्र की तैयारी (दिन 1-4)

दिन 1, निष्फल 35S:: GCaMP बीज का उपयोग ३ ७५% इथेनॉल बहाकर, प्रति धो 1 मिनट, और उंहें १०० mm पर प्लेट ² स्क्वायर प्लास्टिक प्लेट्स & #188 के साथ;-शक्ति Murashige और Skoog (MS) मध् यम (रेसिपी: १.१ g of Murashige and Skoog मीडियम, ७.५ g of सुक्रोज, 10 g of Formedium आगार, and 1 L of de-के जल) < सुप class = "xref" > 37 .
Stratify तीन दिनों तक अंधेरे में अंकुरित होने पर 8 & #176; सिंक्रोनस अंकुरण प्राप्त करने के लिए C.
, GCaMP अंकुरों को एक नियंत्रित वातावरण कक्ष (CER) में ले जाएं 23 & #176; ग, क 16 ज हल् व 8 ज डार्क photoperiod के साथ.

2. कीट पालन (दिन 11-12)

पर प्रयोग के दिन 11, जोड़ 15 वयस्क M. persicae को 5 सप् ताह पुराने मिट्टी के उगाए Arabidopsis पौधों का प्रयोग कर नम कलाकार & #39; एस पेंट ब्रश (आकार 2 या 4) (एक CER में उगाया 22 & #176; ग 10 ज लाइट और 14 ज डार्क photoperio के साथ घ).
पिंजरे संयंत्र और एक प्लास्टिक के ढक्कन के साथ टोपी के आसपास स्पष्ट प्लास्टिक टयूबिंग (10 सेमी x 15 सेमी) रखकर संयंत्र पर एफ़िड्स ।
छोड़ एफ़िड-संक्रमित पौधों को एक CER में 24 ज के लिए 22 & #176; ग के साथ एक 16 ज प्रकाश और 8 ज अंधेरे photoperiod.
, सभी वयस्क M. persicae एक तूलिका का प्रयोग कर.
नोट: कीड़े के पौधे पर आँख से देखा जा सकता है । यह एक समान विकासात्मक युग के साथ अप्सराओं की आबादी देता है । वयस्क प्रति लगभग 1 अप्सरा इस अवधि के दौरान उत्पादित किया जाएगा ।
कम तापमान वाले पौधों को छोड़ दें तो CER में 16 & #176; सी, 8 एच लाइट और 16 एच डार्क photoperiod के साथ, अप्सराओं को आकार में भी तेजी से बढ़ने से रोकें ।

3. पत्ती टुकड़ी (दिन 19)

दिन 19 प्रयोग के पर, 35S:: GCaMP3 से अंकुरों को हटाने और तेज कैंची की एक जोड़ी का उपयोग कर प्रत्येक संयंत्र से सबसे बड़ी पत्ती अलग । CER चिमटी की एक जोड़ी का उपयोग कर
, एक ९६-अच्छी तरह की थाली ३०० & #181 युक्त की अच्छी तरह से अलग पत्ती जगह है, आसुत जल के एल, abaxial सतह का सामना करना पड़ । अतिरिक्त पत्तियों के लिए दोहराएं (< सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा १ ).

< img alt = "चित्रा 1" class = "xfigimg" src = "//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56142/56142fig1.jpg"/>
चित्रा 1: 35S:: GCaMP3 पत्ता परख. प्रत्येक 16 दिवसीय 35S से सबसे बड़ा पत्ता:: GCaMP3 Arabidopsis अंकुर न्यारा है और ३०० & #181 पर तैरता है; एक ९६-खैर प्लेट में आसुत जल के एल । दिन टुकड़ी के बाद लिया फोटो । < a href = "//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56142/56142fig1large.jpg" target = "blank" > इस फिगर का बड़ा वर्जन देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

< राजभाषा प्रारंभ = "3" >

स्पष्ट प्लास्टिक लपेटो और एल्यूमीनियम पंनी में थाली को कवर और कमरे के तापमान पर रात भर छोड़ने के लिए उपस्थिती के लिए टुकड़ी के तनाव की अनुमति है ।

4. प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (Days 20-22)

का दिन 20 पर प्रयोग, एल्यूमीनियम पंनी से ९६ अच्छी तरह से थाली निकालें और यह एक प्रतिदीप्ति stereomicroscope के लिए स्थानांतरण । एक 450-490 एनएम प्रकाश के साथ GFP उत्तेजित करने के लिए और ५०० और ५५० एनएम के बीच फ्लोरोसेंट उत्सर्जन को पकड़ने के लिए स्टीरियो प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप विन्यस्त करें.
दिन ११ बजे स्थापित कॉलोनी से मिट्टी से पौधे निकालकर और उसे ढक्कन वाले पारदर्शी डब्बे में रखकर वृद्ध एफ़िड्स एकत्र करें. प्रयोग करते समय बक्से में मौजूद कीड़ों को रखें ।
प्लेस ९६-अच्छी तरह से माइक्रोस्कोप के तहत थाली । GCaMP3 प्रतिदीप्ति स्पष्ट रूप से अलग पत्तियों की नसों में visualized किया जा सकता है जब तक प्रकाश जोखिम में परिवर्तन । सभी प्रयोगों के लिए जोखिम निरंतर रखें; वर्तमान प्रोटोकॉल के लिए, 1-s एक्सपोज़र ३.५ (< सशक्त वर्ग = "xfig" > आरेख 2 ) के लाभ के साथ उपयोग किया गया था.
आवर्धन और माइक्रोस्कोप की ज़ूम इस तरह समायोजित करें कि 4 कुओं एक फ्रेम में मनाया जा सकता है; वर्तमान प्रोटोकॉल के लिए, एक 7.8 x आवर्धन और फोकस-१२७.८३३ mm का उपयोग किया गया था ।
एक नम रंग ब्रश का उपयोग माइक्रोस्कोप के तहत एक अलग पत्ती के लिए एक एफ़िड हस्तांतरण । एक आसन्न पत्ती एक नियंत्रण के रूप में अनुपचारित छोड़ दो, लेकिन हल्के से एफ़िड हस्तांतरण के दौरान होता है कि छू नकल करने के लिए तूलिका के साथ इसे छूने. प्लास्टिक की चादर को ९६ के शीर्ष पर वापस जगह माइक्रोस्कोपी के दौरान अच्छी तरह से थाली को बचने से कीट को रोकने के लिए याद रखें ।
जोड़ों में पत्तियों की प्रतिदीप्ति रिकॉर्डिंग शुरू (1 एफ़िड-इलाज और 1 अनुपचारित) क्लिक करके & #34; प्रारंभ प्रयोग & #34; में निर्मित माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 2 ). ५० min.
के लिए रिकॉर्ड माप नोट: वर्तमान प्रोटोकॉल के लिए, माप के बीच 5 s का समय अंतराल उपयोग किया गया था.
५० मिनट के बाद, पर क्लिक करके रिकॉर्डिंग बंद करो & #34; stop प्रयोग & #34; और एफ़िड को पत्ती से हटा दें । छवि फ़ाइलों के रूप में प्रतिदीप्ति माप सहेजें ( उदाहरण के लिए, टैग छवि फ़ाइल स्वरूप, TIFF).
पत्तियों के आगे जोड़े के साथ प्रयोग को दोहराने; इमेजिंग एक बार में छवि 2 पत्तियों के जोड़े को बढ़ाया जा सकता है, 2 पादी के एक साथ इमेजिंग के लिए अनुमति देता है ।

5. डेटा संग्रह

छवि फ़ाइलों को फिजी (image J) में आयात करें और उन्हें & #34 पर क्लिक करके ३२ बिट्स में कन्वर्ट करें; image & #34; & #62; & #34; टाइप & #34; & #62; & #34; ३२-bit; & #34; यह heatmap वीडियो में छवियों के रूपांतरण के लिए अनुमति देता है (7 कदम देखें) ।
नमूने में एफ़िड्स माइक्रोस्कोप के तहत कीट आंदोलन को देखने के द्वारा 5 से अधिक मिनट के लिए एक स्थान में व्यवस्थित नहीं करते ।
नोट: यह अक्सर नमूनों के बहुमत है, और १०० उपचार करने के लिए 30 सफल बसने का प्रदर्शन नमूने खोजने के लिए आवश्यक हो सकता है ।
पिक्सेल के लिए माप स्केल सेट करें (या mm में कनवर्ट करें, यदि ज्ञात हो) और समय सीमा को एक ही समय अंतराल पर क्लिक करके माइक्रोस्कोपी के दौरान इस्तेमाल के रूप में & #34; Image & #34; & #62; & #34;P roperties. & #34;
कर्सर का उपयोग कर, GFP विश्लेषण के लिए ऊतक के क्षेत्र के आसपास ब्याज की एक क्षेत्र (रॉय) जगह है ।
नोट: वर्तमान प्रोटोकॉल में, व्यास में एक परिपत्र रॉय ५० पिक्सल (०.६५ मिमी) ब्याज के 3 स्थानों पर इस्तेमाल किया गया था: एफ़िड खिला साइट (एफएस), पत्ती के मध्यशिरा पर एक प्रणालीगत क्षेत्र (एस), और मध्यशिरा के निकटवर्ती एक प्रणालीगत क्षेत्र (& #34; पार्श्व ऊतक , & #34; Sl) (< सुदृढ वर्ग = "xfig" > चित्रा 2 ).
1. एक अंडाकार ड्राइंग द्वारा रॉय बनाने के लिए (& #34 का उपयोग करें; शाली उपकरण & #34;), और का उपयोग कर आकार संपादित & #34; edit & #34; & #62; & #34; चयन & #34; & #62; & #34; निर्धार. & #34; See < सुदृढ वर्ग = "xfig" > चित्र २ .
, ROIs का चयन करने के लिए पत्ती के तुलनीय क्षेत्रों में उन पर चयनित उपचारित पत्ती ( अर्थात, पत्ती का एक ही क्षेत्र के रूप में जहां इलाज पत्ती पर एफ़िड खिलाया) (< सुदृढ वर्ग = "xfig" > चित्रा २ ).

< img alt = "चित्रा 2" class = "xfigimg" src = "//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56142/56142fig2.jpg"/>
चित्रा 2: माइक्रोस्कोप के तहत GCaMP3 प्रतिदीप्ति का विश्लेषण. वाम: अनुपचारित नियंत्रण पत्ती । सही: एफ़िड-इलाज पत्ती । एफ़िड खिला साइट एक ऐरोहेड के साथ संकेत दिया है । स्केल बार = 1 mm. ( A ) ब्राइट फील्ड इमेज. आवर्धन: 7.8 x, फोकस:-१२७.८३३ mm, एक्सपोज़र: 1 s. ( B ) GFP image showiएनजी प्रतिदीप्ति के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया ROIs । Fs = खिला साइट, Sm = प्रणालीगत मध्यशिरा, Sl = प्रणालीगत पार्श्व ऊतक । आवर्धन: 7.8 x, फोकस:-१२७.८३३ mm, एक्सपोज़र: 1 s । GFP एक ४५० से ४९० एनएम धातु halide लैंप का उपयोग कर उत्साहित था, और फ्लोरोसेंट उत्सर्जन ५०० और ५५० एनएम के बीच कब्जा कर लिया था । < a href = "//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56142/56142fig2large.jpg" target = "blank" > इस फिगर का बड़ा वर्जन देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

< राजभाषा प्रारंभ = "6" >

क्लिक करके समय श्रृंखला विश्लेषक प्लगइन का उपयोग करें & #34;P lugins & #34; & #62; & #34; समय श्रृंखला विश्लेषक & #34; समय के साथ रॉय में कच्चे प्रतिदीप्ति मूल्यों (F) का विश्लेषण करने के लिए. ब्याज का ROI जोड़ें (& #34; add [t] & #34;). यह सुनिश्चित करना कि roi चयनित है, & #34 चुनें; औसत प्राप्त करें; & #34; यह उस ROI में प्रत्येक फ़्रेम के लिए F मानों की तालिका प्रदर्शित करेगा.

एक स्प्रेडशीट में इस डेटा की प्रतिलिपि बनाएं ।

& #34 का उपयोग करके पहले क्षेत्र का चयन करके फीडिंग साइट सिग्नल के क्षेत्र की गणना करें; मुक्तहस्त चयन उपकरण. & #34; अधिक से अधिक GFP सिग्नल को बाह्यरेखांकित करें और फिर इस आकृति के क्षेत्र को क्लिक कर इस आकार की गणना & #34; श्लेष & #34; & #62; & #34; नाप. & #34;

पर क्लिक करके MTrackJ प्लगइन का उपयोग कर खिला साइट सिग्नल की गति की गणना & #34;P lugins & #34; & #62; & #34; ट्रैकिंग & #34; & #62; & #34; MTrackJ. & #34;

पर क्लिक करें & #34; Add & #34; बटन और उसके बाद के केंद्र पर कर्सर क्लिक करें संकेत जब यह पहली बार दिखाई दे रहा है । दूर प्रसार के अपने बिंदु पर संकेत के किनारे पर फिर से क्लिक करें । संकेत की गति की गणना करने के लिए & #34; उपाय & #34;

6. डेटा विश्लेषण

फिजी में माइक्रोस्कोप से छवि फ्रेम के माध्यम से खेलने के द्वारा बसने एफ़िड के मुद्दे को परिभाषित ।
नोट: बसने का समय जो एफ़िड के दौरान 5 मिनट या अधिक के लिए एक ही स्थान में रहता है फ्रेम है । घटनाओं को निपटाने की अवधि भी फिजी में छवियों से गणना की जा सकती है ।
मानकर (& #916; f/f) समीकरण के अनुसार & #916; f/f = (f-f ₀)/₀, जहां f ₀ प्रतिदीप्ति से पहले रिकॉर्डिंग के पहले ६० फ़्रेम पर f के औसत से परिकलित औसत आधारभूत एफ़िड है बसे. अनुपचारित नियंत्रण के लिए दोहराएं ।
प्लाट का सामान्यीकृत GFP प्रतिदीप्ति (& #916; f/समय पर कि रॉय के लिए इलाज और अनुपचारित पत्ती में । नमूने छोड़ें (दोनों पत्तियों) यदि अनुपचारित नियंत्रण बड़े Ca दिखाता है ^{2 +} यात्रियों ( यानी, & #916; f/०.२ ऊपर उगता है) ।
दोहराने जब तक कम से 20-30 व्यवहार्य नमूनों जीनोटाइप प्रति विश्लेषण किया गया है ।

7. समय-पाठ्यक्रम वीडियो निर्माण

३२-bit छवि फ़ाइलों heatmaps में NucMed_Image लुट्यो प्लगइन का उपयोग करके कंवर्ट & #34;P lugins & #34; & #62; & #34; NucMed & #34; & #62; & #34; लुकअप तालिकाएँ. & #34; लुकअप तालिकाएं मेनू में, & #34 का चयन करें; नीला हरा लाल & #34; छवियों को हीट मैप्स में परिवर्तित करने के लिए.
बढ़ाने के लिए एफ़िड-बटोरी GFP संकेतों का प्रयोग & #34;P rocess & #34; & #62; & #34; वृि कंट्रास्ट & #34; & #62; & #34; संतृप्त पिक्सेल% समायोजित करें. & #34;
समय स्टांपर प्लगइन का उपयोग कर समय जानकारी जोड़ें पर क्लिक करके & #34;P lugins & #34; & #62; & #34; समय स्टाम्पर & #34;. सेट द & #34; प्रारंभ समय & #34; पर & #34; 0 & #34; व द & #34; अंतराल & #34; माइक्रोस्कोपी ( eg, 5 एस) के लिए प्रयुक्त समय अंतराल के आधार पर.
एक ऑडियो वीडियो (AVI) फ़ाइल के रूप में इस वीडियो निर्यात करें ।
नोट: इस वीडियो फिर अंय सॉफ्टवेयर संकुल में संपादित किया जा सकता है ( उदा, माइक्रोसॉफ्ट मूवी मेकर) ।

Representative Results

चित्रा 3 और चित्रा 4 एक अनुपचारित नियंत्रण के साथ एक एफ़िड-इलाज पत्ती की तुलना एक प्रयोग से प्रतिनिधि परिणाम हैं । GFP प्रतिदीप्ति में एक उच्च स्थानीयकृत वृद्धि नमूनों के बहुमत में कुछ ही मिनटों के भीतर खिला साइट के आसपास देखा जा सकता है, whilst सीए^{2 +} अनुपचारित नियंत्रण पत्ती में गतिशीलता अपेक्षाकृत स्थिर रहने (चित्रा 3 और बी1) । यह भी कुछ प्रयोगों में प्रारंभिक चोटी के बाद GFP प्रतिदीप्ति में माध्यमिक वृद्धि का पालन करने के लिए संभव है (चित्र बी). अप में इलाज के पत्तों की ५०%, एफ़िड्स व्यवस्थित नहीं है और नमूनों को छोड़ दिया जाना चाहिए । नमूनों में बसने की, 27% नमूनों की खिला साइट के आसपास GFP प्रतिदीप्ति में स्पष्ट वृद्धि प्रदर्शित नहीं करते हैं (चित्रा 3 सी और तालिका 1); इसलिए, 25-30 प्रतिकृति नमूने मात्रात्मक विश्लेषण के लिए औसत होना चाहिए । क्षेत्र और खिला साइट की गति के दृश्य [सीए^{2 +}]_cyt उन्नयन के आसपास ११० µm यात्रा के एक संकेत प्रकट करना चाहिए 6 µm/s (तालिका 1). इसके अलावा, नहीं [Ca^{2 +}]_cyt उंनयन एफ़िड उपचार पर पत्ती के भीतर प्रणालीबद्ध का पता लगाया जाना चाहिए, या तो प्रणालीगत मध्यशिरा (चित्रा 4a) या प्रणालीगत पार्श्व ऊतक क्षेत्रों (चित्रा 4B) में । समय के साथ [Ca^{2 +}]_cyt गतिशीलता का एक प्रतिनिधि नमूना वीडियो 1में दिखाया गया है । यह भी संख्या और खुर्दबीन के नीचे व्यक्तिगत घटनाओं को निपटाने की अवधि पर नज़र रखने के द्वारा व्यवहार बसने एफ़िड विश्लेषण संभव है । इन व्यवहार के लिए प्रतिनिधि परिणाम तालिका 1में दिखाया गया है, दिखा रहा है कि एफ़िड्स बसने से पहले 10 मिनट के आसपास ले, और जब वे सफलतापूर्वक बसा है, यह औसत पर 20 मिनट के लिए रहता है । इसलिए, कीड़ों [Ca^{2 +}]_cytउंनयन की संपूर्णता के लिए एक ही स्थान में बसे हैं ।

चित्रा 3: GCaMP3 अलग पत्तियों में खिला साइट पर एफ़िड-ले लिया सीए^{2 +} संकेतों का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । Left: प्रतिनिधि अंश (n = 30) की सामान्यीकृत GFP प्रतिदीप्ति (ΔF/F) के खिला साइट के आसपास एक 35S:: GCaMP3 पत्ती। निशान 25 मिनट के बाद निपटाने तक बसने से पहले 5 मिनट प्रदर्शन । नियंत्रण = एक अनुपचारित 35S पर समकक्ष स्थान :: GCaMP3 पत्ती । ठीक है: प्रतिनिधि stereomicroscope छवि के [Ca^{2 +}]_cyt पदोंनति एक 35S पर एक एफ़िड खिला साइट के आसपास देखा: GCaMP3 पत्ती । इनसेट स्केल के अनुसार GFP प्रतिदीप्ति रंग-कूटता है । एफ़िड आईडी सफेद और खिला साइट में उल्लिखित एक ऐरोहेड के साथ संकेत दिया । आवर्धन: 7.8 x, फोकस:-१२७.८३३ mm, एक्सपोज़र: 1 s । GFP एक ४५० से ४९० एनएम धातु halide लैंप का उपयोग कर उत्साहित था, और फ्लोरोसेंट उत्सर्जन ५०० और ५५० एनएम के बीच कब्जा कर लिया गया था । (क) एक बड़े एफ़िड-प्रेरित [सीए^{2 +}]_cytउंनयन का एक उदाहरण । (ख) एक औसत एफ़िड-प्रेरित [Ca^{2 +}]_cytउंनयन का एक उदाहरण । (ग) कोई एफ़िड-प्रेरित [Ca^{2 +}]_cytउंनयन का एक उदाहरण । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

पैरामीटर	औसत (± SEM)
[Ca^{2 +}] _cyt उन्नयन
[Ca^{2 +}] प्रदर्शित नमूनों का प्रतिशत_cyt उंनयन	७३%
वेव फ्रंट ^ए की रफ्तार	५.९ µm/एस (± ०.६)
प्रसार का अधिकतम क्षेत्र	११० µm² (± 18)
एफ़िड व्यवहार
बसने वालों की संख्या (& #62; 5 min)	2 (± ०.१)
बसने की कुल संख्या (सभी अवधियों)	३.८ (± ०.४)
इमेजिंग ^b के लिए समय तय	20 मिनट (± 2)
समय तक पहले बसा ^ग	11 मिनट (± १.४)
कुल बिताए समय का प्रतिशत बसे	६२% (± 3)

तालिका 1: [Ca^{2 +}]_cytऊंचाई और एफ़िड व्यवहार पैरामीटर्स के दौरान 35S:: GCaMP3 इमेजिंग । पैरामीटर जिनमें व्यवहार्य नमूनों से गणना की गई & #62 के निपटान; 5 मिनट हुई । ( क) दीक्षा की दृष्टि से दिखाई देने वाले संकेत की गति दूर से फैल गई. (ख) प्रतिदीप्ति के विश्लेषण के लिए प्रयुक्त प्रारंभिक निपटान की घटनाओं की अवधि । (C) इमेजिंग की शुरुआत और पहले एफ़िड सेटल होने के बीच की समयावधि । [Ca^{2 +}] _cytउंनयन डेटा पहले संयंत्र सेल (वर्तमान स्थिति: प्रारंभिक QC) को प्रस्तुत किया ।

चित्रा 4: GCaMP3 का पता लगाने नहीं कर सकते एफ़िड-संपाती सीए^{2 +} खिला साइट के लिए प्रणालीगत संकेत । प्रतिनिधि अंश (n = 30) में सामान्यीकृत GFP प्रतिदीप्ति (ΔF/F) के स्थानों में एफ़िड खिला साइट के लिए प्रणालीगत 35S में:: GCaMP3 पत्ते । निशान 25 मिनट के बाद निपटाने तक बसने से पहले 5 मिनट प्रदर्शन । नियंत्रण = एक अनुपचारित 35S पर समकक्ष स्थान :: GCaMP3 पत्ती । (क) प्रणालीगत मध्यशिरा क्षेत्र में ΔF/ (ख) प्रणालीगत पार्श्व ऊतक क्षेत्र में ΔF/ कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Screenshot
वीडियो 1: GCaMP3 Florescence समय के साथ एक एफ़िड फ़ीड के रूप में । इनसेट स्केल के अनुसार GFP प्रतिदीप्ति रंग-कूटता है । एफ़िड खिला साइट का स्थान एक ऐरोहेड के साथ संकेत दिया है । वाम: 35S:: GCaMP3 पत्ता एक एम. persicae वयस्क को उजागर । अधिकार: अ 35S:: GCaMP3 नो-एफ़िड कंट्रोल लीफ. इस वीडियो को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)

Discussion

इस पत्र में वर्णित विधि संयंत्र के वास्तविक समय विश्लेषण के लिए अनुमति देता है Ca के^{2 +} इस तरह के कीट खिलाने के रूप में एक बायोटिक तनाव के दौरान संकेत । यह दर्शाता है कि इस तरह के खतरों के लिए पहले संयंत्र प्रतिक्रियाओं में से एक एक स्थानीयकृत है [Ca^{2 +}] कीट के खिला साइट के आसपास_cyt उन्नयन । म्यूटेंट के उपयोग के माध्यम से, इस विधि इस तरह के संकेतों के आणविक और शारीरिक लक्षण वर्णन है, जो पहले से संभव नहीं था के लिए अनुमति देगा । इस प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम यह सुनिश्चित करना है कि अलग पत्ते अधिक टुकड़ी प्रक्रिया (३.२ कदम) के दौरान परेशान नहीं कर रहे है या जब पत्तियों को कीड़ों स्थानांतरित (४.५ कदम) । यह देखते हुए कि वर्तमान प्रोटोकॉल [Ca^{2 +}]_cytके बजाय एक निरपेक्ष एकाग्रता की एक रिश्तेदार माप प्रदान करता है, यह महत्वपूर्ण है कि माइक्रोस्कोप सेटिंग्स प्रयोग भर में लगातार रखा जाता है । वहां भी है ROIs के चयन और डेटा के विश्लेषण के दौरान मानव पूर्वाग्रह के लिए संभावित है, और जैसे, यह सिफारिश की है कि प्रयोग डबल अंधा आयोजित कर रहे हैं ।

इस प्रोटोकॉल के साथ बायोटिक तनाव के दौरान [Ca^{2 +}]_cytको मापने के कई महत्वपूर्ण लाभ कर रहे हैं । सबसे पहले, एक उच्च फ्लोरोसेंट उपज के साथ एक एकल fluorophore का उपयोग इमेजिंग एक stereomicroscope है, जो एक फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करने से भी कम महंगा है पर आयोजित किया जा करने के लिए अनुमति देता है । एक एकल fluorophore का उपयोग भी डेटा संग्रह और विश्लेषण सरल बनाता है, के रूप में वहाँ सिर्फ एक माप रिकॉर्ड करने के लिए है । इसके अलावा, एक stereomicroscope का उपयोग पूरी पत्तियों के इमेजिंग के लिए अनुमति देता है, जो यह आवश्यक है कि कई बायोटिक इंटरैक्शन, जिनमें प्लांट-एफ़िड इंटरैक्शन शामिल हैं, एक बड़े स्थानिक पैमाने पर होते हैं. छवि पर कब्जा संभव GCaMP3 के साथ उच्च लौकिक संकल्प, Ca के तेजी से संबंध के आधार पर^{2 +} ²³^,³⁰ और उच्च फ्लोरोसेंट उपज बाध्यकारी के बाद सेंसर से, माप के लिए अनुमति देता है करने के लिए ले जाया जाएगा हर 5 एस. इसके अलावा, पत्ती परख कीट के भागने को रोकता है, पूरे पौधों पर इस तरह के प्रयोगों के संचालन के लिए एक महत्वपूर्ण कदम सीमित^{(तैयारी में)}। अलग पत्तियों यह भी सुनिश्चित करता है कि कीट एक पूर्व निर्धारित स्थान से खिलाती है, Ca के विश्लेषण के लिए अनुमति देता है^{2 +} गतिशीलता से पहले, दौरान, और खिलाने के बाद. इस प्रोटोकॉल भी सुनिश्चित करता है कि इसी तरह के विकास के चरणों के पत्ते विश्लेषण के लिए उपयोग किया जाता है ।

इस प्रोटोकॉल के मुख्य नुकसान एक गैर ratiometric के उपयोग से उत्पंन होता है । एकल एफ पी सी संवेदी, GFP उत्सर्जन में भिंनता के साथ प्रायोगिक चर से परिणाम हो सकता है [Ca^{2 +}]_cyt, जैसे सेलुलर पीएच, गति, या में परिवर्तन के रूप में की अभिव्यक्ति का स्तर । इन मुद्दों झल्लाहट के दौरान झल्लाहट Cameleons के साथ सामना नहीं कर रहे हैं, के रूप में YFP से ऊर्जा के हस्तांतरण के रूप में केवल Ca पर होता है^{2 +} बाइंडिंग । अंय शर्तों है कि व्यक्तिगत fluorophores के फ्लोरोसेंट गुणों को बदलने की संभावना नहीं है की तीव्रता में विरोध परिवर्तन की नकल करने के लिए और YFP, और ratiometric गणना है कि स्वाभाविक रूप से प्रयोग किया जाता है इनमें से कई के लिए माप को सामान्य अन्य ऑप्टिकल कलाकृतियों²³^,³⁰. यह पूर्ण का आकलन करता है [Ca^{2 +}]_cytअधिक झल्लाहट Cameleons के साथ विश्वसनीय । नतीजतन, GCaMP3 सबसे अच्छा एक जैव सेंसर के रूप में प्रयोग किया जाता है रिश्तेदार [Ca^{2 +}]_cytउपाय है, हालांकि यह अभी भी पता लगाने और पौधों में जैविक घटना⁵^{, (तैयारी में)}की विशेषता के लिए पर्याप्त है । इसलिए, यह दिखाने के लिए नियंत्रण का उपयोग करने के लिए आवश्यक है कि मनाया प्रभाव सीए^{2 +}, सीए सहित^{2 +}-संबंधित आनुवंशिक म्यूटेंट^{(तैयारी में)} या औषधीय सीए^{2 +} चैनल अवरोधकों जैसे ला^{3 +}. महत्वपूर्ण बात, एकल एफ पी संवेदी आम तौर पर एक अधिक फ्लोरोसेंट उपज और अधिक से अधिक गतिशील रेंज (यानी, 2 Ca पर florescence में वृद्धि⁺ बाध्यकारी) Cameleons²³, जो बनाता है GCaMP अधिक से अधिक प्रदर्शन के लिए अनुकूल ऊतक स्तर इमेजिंग, जबकि झल्लाहट Cameleons सेलुलर इमेजिंग के लिए एक फोकल माइक्रोस्कोप⁵^,²⁵के साथ एक उपयोगी उपकरण हैं ।

इस प्रोटोकॉल के निष्पादन के दौरान, यह संभव है कि कुछ समस्याएं उत्पंन होगी कि समस्या निवारण की आवश्यकता है । उदाहरण के लिए, यह अनुशंसित है कि नमूनों में नियंत्रण (अनुपचारित) पत्ती बड़ी प्रदर्शित करता है [Ca^{2 +}]_cytऊंचाईयां छोड़ दी जाती है (चरण ६.३) । ऐसे यात्रियों सबसे अधिक संभावना माइक्रोस्कोप द्वारा प्रेरित तनाव का परिणाम है । दरअसल, नीली बत्ती को सीए^{2 +} सिग्नल^३८^,^३९^,^४०^,^४१, और उच्च तीव्रता प्रकाश में भी तापमान और परासरणी तनाव में परिणाम हो सकता है, जो दोनों के लिए जाना जाता है भी बटोरना [Ca^{2 +}]_cyt ऊंचाई²¹^,²⁵^,^४२। नतीजतन, इस तरह के तनाव को कम करने के लिए, यह एक अच्छी तरह हवादार और तापमान नियंत्रित कमरे में प्रयोग का संचालन और अनावश्यक रूप से लंबे समय जोखिम से बचने के लिए महत्वपूर्ण है । यह भी अलगाव के दौरान अधिक से अधिक पत्तियों को बाधित नहीं करने के लिए महत्वपूर्ण है या माइक्रोस्कोपी के दौरान स्पर्श को रोकने के लिए [Ca^{2 +}]_cyt ऊंचाई^४३^,^४४^,^४५। समस्याएं भी कीट बसने के साथ सामना किया जा सकता है । एम. persicaeके साथ, कीड़े कई नमूनों में पत्तियों पर बसा नहीं है । यह^४६^,^४७या नीले प्रकाश द्वारा कीड़ों की अशांति-अलग पत्तियों में घाव प्रकाश में आया रक्षा का परिणाम हो सकता है । दरअसल, एम. persicae में विजन ४९० एनएम^४८के एक चोटी संवेदनशीलता के साथ एक सहित तीन photoreceptors, द्वारा नियंत्रित किया जाता है । सूक्ष्म जोखिम को कम करने और देखभाल के साथ एफ़िड्स हैंडलिंग संकट को कम करने और बसने को प्रोत्साहित हो सकता है ।

वर्तमान समाचार पत्र में उल्लिखित प्रोटोकॉल संयंत्र की आणविक समझ-कीट बातचीत और बायोटिक तनाव को संयंत्र प्रतिक्रिया पर नए अंतर्दृष्टि देता है । यह कीट खिलाने के लिए पहले संयंत्र प्रतिक्रियाओं में से एक के दृश्य के लिए अनुमति देता है और काफी Arabidopsis आनुवंशिक उपलब्ध संसाधनों के उपयोग के माध्यम से आगे की जांच की सुविधा । इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल जीवित जीवों के उपयोग के लिए अनुमति देता है, के रूप में अर्क^४९ या^५०विवर्धनों का विरोध किया । भविष्य में, इस तकनीक को अंय बायोटिक तनावों के लिए लागू किया जा सकता है, जैसे अतिरिक्त कीट प्रजातियों, सूत्रकृमि, या माइक्रोबियल रोगजनकों, साथ ही साथ अजैव तनाव के लिए । GCaMP3 माइक्रोस्कोपी भी छवि अन्य संयंत्र के ऊतकों को संशोधित किया जा सकता है, पत्ती पर वैकल्पिक ROIs, या यहां तक कि पूरे पौधों. इसके अलावा, वहां के लिए क्षमता है के लिए आनुवंशिक होने के लिए सेंसरअतिरिक्त संयंत्र प्रजातियों में इनकोडिंग । नतीजतन, इस पत्र में उल्लिखित प्रोटोकॉल क्षमता के लिए Ca के आणविक आधार^{2 +} उपंयास की एक श्रेणी में संकेत बायोटिक पौधों और अंय प्रजातियों के बीच बातचीत ।

Disclosures

लेखकों के हित की घोषणा करने का कोई टकराव नहीं है.

Acknowledgments

हम अनुदान Calder (जॉन Innes केंद्र, ब्रिटेन) माइक्रोस्कोप के विषय में सलाह के लिए शुक्रिया अदा करना चाहूंगा । लेखक भी उनकी सहायता के लिए जॉन Innes सेंटर बागवानी और कीट विभागों को धन्यवाद देने की इच्छा रखते हैं । यह काम जॉन Innes फाउंडेशन (टीवी) से एक पीएचडी छात्र द्वारा समर्थित किया गया था, JJ004561/1 से BBSRC और जॉन Innes फाउंडेशन (टीवी, एमए, J.C., एम, S.H., T.M., और एस), जॉन Innes सेंटर (एमए) से उद्योग प्लेसमेंट में एक साल , ब्रिटेन के जैव रसायन सोसायटी (J.C.), JST सफ़ाई (M.T.), और अनुदान म्क्ब १३२९७२३ और IOS-१५५७८९९ से राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (M.T. और S.G.) से एक ग्रीष्मकालीन छात्र ।

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
35S::GCaMP3 Arabidopsis	John Innes Centre/Universty of Wisconsin	-	Step 1.1
100 mm² square plastic plates	R & L Slaughter Ltd, Upminster, UK		For growing GCaMP plants (Step 1.1)
¼ strength Murashige and Skoog (MS) medium	homemade: 1.1 g Murashige and Skoog medium, 7.5 g sucrose, 10 g Formedium agar, 1 L de-ionised water	-	For growing GCaMP plants (Step 1.1)
Col-0 Arabidopsis	-	-	For growing aged aphid colony (Step 2.1)
Myzus persicae(Sulzer)	clone US1L, Mark Stevens, Brooms Barn	-	Orginally from Rothamsted Research, UK (Step 2.1)
Artist's paintbrush size 2	Hobbycraft	610101	To tranfer aphids (Steps 2.1, 2.4 and 4.6)
96-well MicrotitreTM plate	ThermoFisher Scientific	2101	To contain the detached GCaMP3 leaves (Step 3.2)
Aluminium foil	Wrap Film Systems, Telford, UK	26B06	To cover plates with floating leaves overnight (Step 3.3)
Clear plastic wrap	SC Johnson & Son, Racine, WI, USA		To cover plates with floating leaves overnight, and to cover leaves during microscopy (Steps 3.3 and 4.7)
M205FA stereo microscope	Leica Microsystems	-	For GFP imaging (Step 4.1)
Leica Application Suite v3.2.0	Leica Microsystems		Microscope software (Step 4.1)
Fiji (Image J) v1.48a	National Institutes of Health, USA)	-	For image analysis (Step 6.1)