Summary
Detta protokoll beskriver en enkel metod för att analysera kalcium signaler i växter som genereras av utfodring Ditropis insekter, såsom bladlöss. Arabidopsis thaliana omvandlas med den GFP kalcium biosensor GCaMP3 möjliggör av realtid i vivo imaging av kalcium dynamics med en hög temporal och spatial upplösning.
Abstract
Kalciumjoner förutspås vara viktiga signalering enheter under biotiska interaktioner, med Kalciumsignalering bildar en etablerad del av den växt försvar Svaren mikrobiella elicitors och såra orsakas av tugga insekter, framkalla systemisk kalcium signaler i växter. Rollen av kalcium i vivo under biotic spänning är dock fortfarande oklart. Det här protokollet beskriver användningen av en genetiskt-kodade kalcium sensor att upptäcka kalcium signaler i växter vid utfodring av en Ditropis pest. Hemipterans såsom bladlöss pierce ett litet antal celler med specialiserade, långsträckt sugande mouthparts, vilket gör dem till det perfekta verktyget att studera kalcium dynamics när en växt är inför en biotic spänning, som skiljer sig från en skadade svar. Dessutom är fluorescerande biosensorer revolutionera mätning av signalering molekyler i vivo i både djur och växter. Uttrycker en GFP-baserade kalcium biosensor, GCaMP3, i modell växten Arabidopsis thaliana möjliggör realtid bildtagning av växten kalcium dynamik under insekt utfodring, med en hög rumsliga och temporal upplösning. En repeterbar och robust analys har utvecklats med hjälp av fluorescensmikroskopi av fristående GCaMP3 blad, vilket möjliggör kontinuerlig mätning av cytosoliska kalcium dynamics före, under och efter Insekt utfodring. Detta avslöjar en mycket-lokaliserad snabba kalcium höjd runt den Bladlöss utfodring webbplats som uppstår inom några minuter. Protokollet kan anpassas till andra biotiska påfrestningar, som ytterligare insektsarter, medan användningen av Arabidopsis thaliana möjliggör snabb generering av mutanter att underlätta molekylär analys av fenomenet.
Introduction
Kalcium (Ca2 +) är en av de mest allestädes närvarande signalering element i växter. En övergående ökning av cytosoliska Ca2 + koncentration ([Ca2 +]cyt) avkodas av ett komplext nätverk av nedströms komponenter och är involverad i att bemöta både abiotiska och biotiska betonar1,2. En ökning av [Ca2 +]cyt är en av de första Svaren till mikrobiell elicitors, bildar en gemensam del av anläggningen försvar svar3,4,5. Stiger i [Ca2 +]cyt har också observerats hos på sårbildning orsakas av tugga insekter, som lepidopterans6,7. Dock potentiella roll växt Ca2 + signaler svar att leva biotiska hot att skadar endast några celler inte har undersökts. Den gröna persika bladlöss Myzus persicae är en Ditropis insekt som utgör ett betydande hot mot världens jordbruk8,9, och Ca2 + utflödet från extracellulära har observerats i lämnar angripen av M. persicae10. Denna protokollet beskrivs en robust och upprepningsbar metod för att mäta växt Ca2 + signaler medan M. persicae foder från bladen med en fluorescerande Ca2 + biosensor, med både bladlöss och GCaMP3 erbjuder nya verktyg för att dissekera roll Ca2 + under biotiska interaktioner.
Ca2 +-selektiv mikroelektroder användes tidigare för att mäta [Ca2 +] i växter11,12. Mer nyligen, självlysande och fluorescerande metoder har blivit standardiserade. Dessa biosensorer binda Ca2 + och avger ljus, vilket möjliggör un-paralleled möjligheter att studera Ca2 + dynamik i både celler och hela vävnader. Ca2 + biosensorer kan injiceras som färgämnen eller stabilt produceras av införandet av den biosensor kodande sekvens i genomet hos organismen via omvandling (dvs genetiskt kodade biosensorer). Den senare erbjuder de stora fördelarna med vara enkelt uttryckt i levande vävnad och kunna subcellulär lokalisering13. Proteinet aequorin, isolerade från Aequorea victoria (maneter) var den första genetiskt kodade Ca2 + biosensor distribueras i växter14. Som en självlysande protein kräver aequorin inte excitation av yttre ljus, vilket undviker kromofor blekning och autofluorescens15. Aequorin har framgångsrikt använts för att mäta flöden [Ca2 +] som svar på olika stimuli, inklusive temperatur16, patogener17,18,19, salt stress20 ,21, och skadade7. Dock är det missgynnade av relativt låg signal intensiteten, att göra detektion av [Ca2 +] flussmedel i enskilda celler och vävnader med dålig sensor uttryck svårt13.
Utveckling av Ca2 + biosensorer som kan fluorescera har kompletterat aequorin av möjliggör detaljerad subcellulär och vävnad-nivå analys av Ca2 + dynamics. En av de vanligaste fluorescerande biosensorer är fluorescens resonans energiöverföringen (bandet)-baserat Cameleons. FRET Cameleons består av två proteiner, vanligtvis GFP och YFP, som förs in i Närkontakt av den conformationaländring som induceras av bindningen av Ca2 + till en calmodulin domän i regionen GFP-YFP länkaren. Denna kontakt kan överföringen av energi från GFP till YFP och resulterande förändringar i fluorescensen av dessa fluorophores gör för exakt kvantifiering av [Ca2 +] genom beräkning av förhållandet mellan fluorescens signalerna från två fluorophores22. FRET Cameleons är överlägsna aequorin och icke-proportionerlig fluorescerande färger, eftersom de är mindre påverkad av uttrycket nivån av protein23 och har ofta en större fluorescerande avkastning, vilket möjliggör cellulär och subcellulär imaging23. FRET Cameleons har till exempel använts nyligen att identifiera långdistans Ca2 + signaler i växter och lösa dessa till cellulär nivå24,25,26.
En senaste genombrott med fluorescerande GFP-baserade Ca2 + biosensorer har varit utvecklingen av mycket känsliga singel-fluorophore (singel-FP) biosensorer. Singel-FP biosensorer består av en enda cirkulärt permutated GFP kopplat till calmodulin och M13 peptid, med Ca2 + bindning till calmodulin, vilket resulterar i en vatten-medierad reaktion mellan calmodulin och god Jordbrukarsed så protonate god Jordbrukarsed och öka fluorescerande avkastning27,28,29. Singel-FP sensorer erbjuder flera fördelar över bandet Cameleons, inklusive enklare experimentell design och en potentiellt högre temporal upplösning Imaging30. Även om single-FP sensorer inte kvantifiera absoluta [Ca2 +] så enkelt som bandet sensorer, de är överlägsen för analysen av temporal och spatial dynamik Ca2 + signaler5,23. GCaMPs är en av de översättningsföretag singel-FP sensorer28 och har genomgått flera revideringar för att förbättra deras fluorescerande avkastning, dynamiskt omfång, Ca2 + affinitet och signal-brus-förhållanden31,32 , 33 , 34. the GCaMPs har använts framgångsrikt i djurens system, såsom zebrafisk motoriska nervceller35 och frukt flyger neuromuskulära korsningar34. Slumpmässig mutagenes av GCaMP3 har resulterat i ytterligare klasser av singel-FP sensorer, inklusive den ultrasensitive GCaMP636 och GECOs29. GECOs användes nyligen i Arabidopsis thaliana (hädanefter benämnd Arabidopsis) att mäta Ca2 + flussmedel svar till ATP, kitin och den bakteriella anstränga flg22. Denna studie visade också att den R-GECO biosensor överträffade de FRET Cameleon YC3.6 när det gäller maximal signal förändring och signal-brus-baserat5.
På grund av lätthet av användning, fluorescerande med hög kapacitet och hög temporal upplösning som kan uppnås med GCaMP biosensorer, var GCaMP3 genetiskt kodade i Arabidopsis under blomkålsmosaikviruset 35S arrangören. De genetiska verktyg som finns för Arabidopsis forskning möjliggör detaljerade molekylära analysen av Ca2 + signalerna mätt med GCaMP3. Dessutom kan den GCaMP3 biosensor visualiseras under fluorescens Mikroskop i stället för en dyrare confocal system. Detta protokoll möjliggör hela-vävnad imaging, väsentliga när genomföra experiment med levande biotiska betonar. Experimentet är utformad så att fristående blad från 35S::GCaMP3 växter svävas i vatten, att förhindra insekt fly och begränsa utfodring av en specifik vävnad. Den metod som anges i detta dokument kan därför analysen av blad Ca2 + dynamics under utfodring av M. persicae, vilket resulterar i en karakterisering av en roman växt signalering svar. Denna metod kan också anpassas för att arbeta med andra biotiska påfrestningar, som ytterligare insektsarter och mikrobiella patogener, och med andra växt vävnader, såsom rötter.
Protocol
1. växt förberedelse (dag 1 - 4)
- dag 1, sterilisera 35S::GCaMP frön med tre 75% etanol tvättar, 1 min per tvätt, och plattan dem på 100 mm 2 Fyrkantiga plastplattor med ¼-styrka Murashige och Skoog (MS) medium (recept: 1,1 g av Murashige och Skoog medium, 7,5 g sackaros, 10 g Formedium agar och 1 L avjoniserat vatten) 37.
- Stratifiera plantorna i mörkret i tre dagar vid 8 ° C att få synkron grobarhet.
- Dag 4 av experimentet, flytta GCaMP plantor till en kontrollerad miljö rum (CER) vid 23 ° C, med en 16 h ljus och 8 h mörka fotoperiod.
2. Insekt uppfödning (dagar 11 - 12)
- på dag 11 av experimentet, lägga till 15 vuxna M. persicae i 5 veckor gamla jord-odlade Arabidopsis växter med hjälp av en fuktig konstnär ' s pensel (storlek 2 eller 4) (odlas i en CER vid 22 ° C med 10 h ljus och 14 h mörk photoperio (d).
- Cage bladlöss på anläggningen genom att placera klart plaströr (10 x 15 cm) runt anläggningen och cap med plastförslutning.
- Lämna bladlöss-angripna växter för 24 h i en CER vid 22 ° C med en 16-h ljus och 8-h mörka fotoperiod.
- Ta bort alla vuxen M. persicae använder en pensel på dag 12 av experimentet,.
Obs: Insekter kan ses av ögat på anläggningen. Detta ger en befolkning på nymfer med en liknande utvecklande år. Ungefär 1 nymf per vuxen kommer att produceras under denna period. - Lämna de angripna växterna i en lägre temperatur CER vid 16 ° C, med en 8 h ljus och 16 h mörka fotoperiod, att förhindra att nymferna ökar i storlek för snabbt.
3. Leaf avlossning (dag 19)
- på dag 19 av experimentet, ta bort 35S::GCaMP3 plantor från CER och lossa den största bladen från varje planta med ett par vass sax.
- Använder ett par pincett, placera den fristående bladen i brunnen av en plattan med 96 brunnar innehållande 300 µL destillerat vatten, abaxial ytan vänd uppåt. Upprepa för extra blad ( figur 1).
figur 1: 35S::GCaMP3 Leaf Assay. Den största bladen från varje 16 dagar gamla 35S::GCaMP3 Arabidopsis fröplanta är fristående och flöt på 300 µL destillerat vatten i en plattan med 96 brunnar. Bilden är tagen dagen efter lösgörande. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
- täcka plattan i klar plastfolie och aluminiumfolie och lämna i rumstemperatur över natten för att tillåta stress av avskildheten avta.
4. fluorescensmikroskopi (dagar 20 - 22)
- dag 20 av experimentet, ta bort plattan med 96 brunnar från aluminiumfolie och överföra det till ett fluorescens-stereomikroskop. Konfigurera stereo fluorescens Mikroskop att excitera GFP med en 450-490 nm ljus och att fånga fluorescerande utsläpp mellan 500 och 550 nm.
- Samla år bladlöss från kolonin etablerade på dag 11 genom att ta bort anläggningen från marken och placera den i en genomskinlig låda med lock. Hålla insekter som finns i rutan samtidigt genomför experimentet.
- Plats i plattan med 96 brunnar under mikroskopet. Ändra ljus exponeringen tills GCaMP3 fluorescensen kan visualiseras tydligt i venerna i fristående bladen. Hålla exponeringen konstant för alla experiment; för det nuvarande protokollet, användes en 1-s exponering med en vinst på 3,5 ( figur 2).
- Justera förstoringen och zoomning av mikroskopet så att 4 brunnar kan observeras i en ram, för det nuvarande protokollet, användes en 7,8 X förstoring och ett fokus på-127.833 mm.
- Överför en bladlus till ett fristående löv under luppen med en fuktig pensel. Lämna en angränsande blad obehandlade som en kontroll, men nudda den med pensel att efterlikna den röra som uppstår under bladlöss överföring. Kom ihåg att placera plast wrap tillbaka ovanpå plattan med 96 brunnar under mikroskopi som hindrar att insekten flyr.
- Börja fluorescens inspelningen av bladen parvis (1 bladlöss-behandlade och 1 obehandlad) genom att klicka " Starta experimentet " i inbyggda Mikroskop mjukvaran ( figur 2). Spela in mätningar för 50 min.
Obs: för det nuvarande protokollet, ett tidsintervall på 5 s mellan mätningar användes. - Efter 50 min, stoppa inspelningen genom att klicka på " stoppa experimentet " och ta bort bladlöss från leaf. Spara fluorescens mätningar som bildfiler (t.ex. Taggad bildfilformat, TIFF).
- Upprepa experimentet med ytterligare par blad; imaging kan utvidgas till att bild 2 par blad på en gång, vilket möjliggör samtidig bildtagning av 2 genotyper.
5. Insamling av data
- Importera bildfiler till Fiji (bild J) och konvertera dem till 32 bitar genom att klicka på " bild " > " typ " > " 32-bitars; " Detta tillåter för omvandling av bilder till heatmap videor (se steg 7).
- Kasta de prover där bladlöss inte nöja sig på en plats för mer än 5 min genom att Visa insekt rörelsen under lupp.
Obs: Det är ofta flesta av prover, och upp till 100 behandlingar kan krävas att hitta 30 prover uppvisar framgångsrika lösa. - Ange måttskalan pixlar (eller konvertera till mm, om känt) och tidsramen till samma tidsintervall som används under microscopyen genom att klicka på " bild " > " boenden. "
- Med markören, placera en region av intresse (ROI) runt området av vävnad för god Jordbrukarsed analys.
Obs: I det nuvarande protokollet, användes en cirkulär ROI 50 pixlar (0,65 mm) i diameter på 3 platser av intresse: de Bladlöss utfodring webbplats (Fs), en systemisk region på HUVUDNERV av bladet (Sm) och en systemisk region som gränsar till HUVUDNERV (" laterala vävnad " Sl) ( figur 2).- Skapa ROI genom att rita en oval (Använd den " ovalverktyget "), och redigera den storlek med " redigera " > " Val " > " ange. " Se figur 2.
- För den obehandlade kontrollen Välj ROIs i jämförbara områden i bladet som valts på den behandlade bladen (dvs. samma region av bladet som där bladlöss matas på den behandlade bladen) ( figur 2).
figur 2: analysera GCaMP3 fluorescens Under lupp. Vänster: kontrollgrupp blad. Höger: bladlöss-behandlade blad. Webbplatsen Bladlöss utfodring indikeras med en pilspets. Skalstapeln = 1 mm. (A) ljusa fältet bild. Förstoring: 7,8 X, fokusera:-127.833 mm, exponering: 1 s. (B) GFP bild kvadraternang de ROIs används för kvantitativ analys av fluorescens. FS = utfodring webbplats, Sm = systemisk HUVUDNERV, Sl = systemisk laterala vävnad. Förstoring: 7,8 X, fokusera:-127.833 mm, exponering: 1 s. GFP var upphetsad med en 450 – 490 nm metallhalogen lampa och fluorescerande utsläpp fångades mellan 500 och 550 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
- använda insticksmodulen tid serien Analyzer genom att klicka " Plugins " > " tid serien Analyzer " att analysera raw fluorescens värdena (F) i ROI över tid. Lägg till ROI av intresse (" Lägg till [t] "). Att se till att ROI är markerat, Välj " få genomsnittliga; " detta kommer att visa en tabell över F värden för varje bildruta i att ROI.
- Kopiera dessa data till ett kalkylblad.
- Beräkna området av utfodring webbplats signalen genom att först markera den region med den " frihand urval verktyg. " beskriver den maximal GFP-signalen och sedan beräkna området i denna form genom att klicka " analysera " > " mäter. "
- Beräkna hastigheten på utfodring webbplats signalen använder MTrackJ plugin genom att klicka " Plugins " > " spårning " > " MTrackJ. "
- Klicka på den " Lägg till "-knappen och klicka sedan på markören i mitten av signalen när det syns först. Klicka igen på kanten av signalen på dess pekar av mest borterst sprids. Klicka på " åtgärd " att beräkna hastigheten på signalen.
6. Dataanalys
- definiera peka av bladlöss lösa genom att spela igenom de bild ramarna från mikroskopet i Fiji.
Obs: Är dags att lösa ramen under vilken bladlöss stannar i en enda plats för 5 minuter eller mer. Varaktigheten av avgörande händelser kan också beräknas från bilderna i Fiji. - Normalisera F data (ΔF/F) enligt ekvation ΔF/F = (F - F 0) f 0, där F 0 är den genomsnittliga baslinje fluorescensen beräknas utifrån genomsnittet av F under de första 60 ramarna av inspelningen innan bladlöss fast. Upprepa för den obehandlade kontrollen.
- Rita den normaliserade GFP fluorescensen (ΔF/F) över tid för att ROI i behandlade och obehandlade bladet. Kassera prover (båda blad) om den obehandlade kontrollen visar stora Ca 2 + transienter (dvs. ΔF/F stiger över 0.2).
- Upprepa tills minst 20-30 livskraftiga prover har analyserats per genotyp.
7. Tid-kurs Video skapande
- konvertera den 32-bitars bilden arkivera in i heatmaps använder NucMed_Image LUTs plugin genom att klicka " Plugins " > " NucMed " > " Lookup tabeller. " i lookup tabeller menyn, Välj " blå grön röd " att konvertera bilderna till värmekartor.
- Förbättra kontrasten av heatmap att belysa den bladlöss-framkallade GFP signaler med hjälp av " Process " > " förbättra kontrast " > " justera mättade pixlar %. "
- Lägg tidsinformation använder tid Stamper plugin genom att klicka på " Plugins " > " tid Stamper ". Ange den " starttid " på " 0 " och den " intervall " baserat på det tidsintervall som används för microscopyen (t.ex. 5 s).
- Exportera denna video som en audio video interleaved (AVI) filen.
Obs: Denna video kan sedan redigeras ytterligare i andra programvarupaket (t.ex. Microsoft Movie Maker).
Representative Results
Figur 3 och figur 4 är representant resultat från experiment jämföra en bladlus-behandlade blad med en obehandlad kontrollodling. En starkt lokaliserad ökning av GFP fluorescens kan ses runt den utfodring webbplatsen inom några minuter i flesta prover, medan Ca2 + dynamiken i kontrollgrupp leaf vistelse relativt stabila (figur 3A och 3B). Det är också möjligt att observera sekundära ökningar i GFP fluorescens efter den första toppen i vissa experiment (figur 3B). I upp till 50% av behandlade bladen, bladlöss nöja sig inte och proverna ska kasseras. Av proverna som bilägga uppstår, uppvisar 27% av proverna inte tydliga ökningar i GFP fluorescens runt utfodring platsen (figur 3 c och tabell 1); 25-30 identiska prover bör därför vara i genomsnitt för kvantitativ analys. Visualisering av området och hastighet av utfodring webbplats [Ca2 +]cyt höjd bör avslöja en signal av ca 110 µm reser 6 µm/s (tabell 1). Dessutom bör inga [Ca2 +]cyt förhöjningar upptäckas systemiskt inom bladet vid bladlöss behandling, antingen i den systemiska HUVUDNERV (figur 4A) eller Regionkommittén systemisk laterala vävnad (figur 4B). Ett representativt urval avcyt dynamics [Ca2 +] över tid visas i Video 1. Det är också möjligt att analysera bladlöss lösa beteende genom att spåra antalet och varaktigheten av enskilda lösa händelser under mikroskopet. Representativa resultat för dessa beteenden visas i tabell 1, visar att bladlöss tar cirka 10 min innan han gick, och när de ska bosätta sig framgångsrikt detta varar i 20 min i genomsnitt. Därför avgörs insekter på en enda plats för helheten av [Ca2 +]cyt höjden.
Figur 3: GCaMP3 kan användas för att upptäcka bladlöss-framkallade Ca2 + signaler på webbplatsen utfodring i fristående lämnar. Vänster: representativa spår (n = 30) av normaliserade GFP fluorescens (ΔF/F) kring utfodring av 35S::GCaMP3 blad. Spåren visar 5 min innan de flyttade till 25 min efter avgörandet. Kontroll = motsvarande plats på en obehandlad 35S::GCaMP3 blad. Höger: representativa stereomikroskopet bild [Ca2 +]cyt höjd ses runt en Bladlöss utfodring webbplats på ett 35S::GCaMP3 blad. GFP fluorescensen är färgkodade enligt infälld skala. Bladlöss id beskrivs i vitt och utfodring platsen anges med en pilspets. Förstoring: 7,8 X, fokusera:-127.833 mm, exponering: 1 s. GFP var upphetsad med en 450 – 490 nm metallhalogen lampa och fluorescerande utsläpp fångades mellan 500 och 550 nm. (A) ett exempel på en stor bladlöss-inducerad [Ca2 +]cyt höjd. (B) ett exempel på en genomsnittlig bladlöss-inducerad [Ca2 +]cyt höjd. (C) ett exempel på inga bladlöss-inducerad [Ca2 +]cyt höjd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Parametern | Medelvärdet (± SEM) |
| [Ca2 +] CYT höjd | |
| Procent av proverna visar encyt höjd [Ca2 +] | 73% |
| Hastigheten på wave front en | 5,9 µm/s (± 0,6) |
| Maximala arean av spridning | 110 µm2 (± 18) |
| Bladlöss beteende | |
| Antal träsoffa (> 5 min) | 2 (± 0,1) |
| Totalt antal träsoffa (alla varaktigheter) | 3.8 (± 0,4) |
| Tid bosatte sig för imaging b | 20 min (± 2) |
| Tid tills första kvitta c | 11 min (± 1,4) |
| Andelen av totala tiden bosatte sig | 62% (± 3) |
Tabell 1: [Ca2 +]cyt höjd och bladlöss beteendeparametrar under 35S::GCaMP3 Imaging. Parametrar beräknade från livskraftiga prover i vilka reglerandet av > 5 min inträffade. (A) hastighet synliga signalen från peka av initiering till den mest bortersta punkten sprids. (B) varaktighet för de ursprungliga lösa händelser som används för analys av fluorescens. (C) längden av tid mellan början av imaging och den första bladlöss kvitta. [Ca2 +] CYT höjddata tidigare lämnats till The Plant Cell (nuvarande status: inledande QC).
Figur 4: GCaMP3 kan inte upptäcka bladlöss-framkallade Ca2 + signaler systemisk till webbplatsen utfodring. Representativa spår (n = 30) av normaliserade GFP fluorescens (ΔF/F) på platser systemisk till den Bladlöss utfodring plats i 35S::GCaMP3 lämnar. Spåren visar 5 min innan de flyttade till 25 min efter avgörandet. Kontroll = motsvarande plats på en obehandlad 35S::GCaMP3 blad. (A) ΔF/F i regionen systemisk HUVUDNERV. (B) ΔF/F i regionen systemisk laterala vävnad. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Video 1: GCaMP3 flourescens över tid som en bladlus Feeds. GFP fluorescensen är färgkodade enligt infälld skala. Platsen för webbplatsen Bladlöss utfodring indikeras med en pilspets. Vänster: 35S::GCaMP3 leaf utsätts för en M. persicae vuxen. Höger: Ett 35S::GCaMP3 nr-bladlöss kontroll löv. Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)
Discussion
Den metod som beskrivs i detta dokument möjliggör realtidsanalys av växt Ca2 + signalering under en biotiska stress såsom Insekt utfodring. Det visar att en av de första växt Svaren till sådana hot är en lokaliserad [Ca2 +]cyt höjd runt webbplatsen utfodring av insekten. Med hjälp av mutanter, denna metod möjliggör den molekylära och fysiologiska karakterisering av sådana signaler, som inte tidigare var möjligt. Ett avgörande steg i detta protokoll är att säkerställa att fristående bladen inte är alltför störd under processen avlossning (steg 3,2) eller när du överför insekter på bladen (steg 4,5). Med tanke på att det nuvarande protokollet ger en relativ mätning [Ca2 +]cyt snarare än ett absolut koncentration, är det viktigt att mikroskopet inställningarna hålls konstant under hela försöket. Det finns också potential för mänsklig partiskhet under valet av ROIs och analys av data, och som sådan, det rekommenderas att experimenten utförs dubbelblind.
I området i närheten finns det flera betydande fördelar av att mäta [Ca2 +]cyt under biotic spänning med detta protokoll. Första tillåter användning av en enda fluorophore med en hög fluorescerande avkastning av imaging ska genomföras på ett stereomikroskop, vilket är billigare än att använda en confocal mikroskopet. Användning av en enda fluorophore gör också datainsamling och analys enkel, eftersom det finns bara en mätning att spela in. Dessutom möjliggör användning av ett stereomikroskop bildtagning av hela blad, som är nödvändigt med tanke på att många biotiska interaktioner, inklusive växt-bladlöss interaktioner, förekomma i stor rumslig skala. Temporal högupplöst bild fånga möjligt med GCaMP3, baserat på den snabba disassociation av Ca2 + från sensorn efter bindande23,30 och hög fluorescerande avkastningen, möjliggör mätningar tas upp till varje 5 s. Dessutom förhindrar leaf analysen flykten av insekten, en nyckel som begränsar steg att genomföra sådana experiment på hela växter (i förberedelse). Fristående bladen också säkerställa att insekten feeds från en fördefinierad plats, vilket möjliggör analys av Ca2 + dynamics före, under och efter utfodring. Detta protokoll garanterar också att bladen av liknande utvecklingsstadier som används för analys.
Den största nackdelen med detta protokoll härrör från användningen av en icke-proportionerlig biosensor. Med singel-FP biosensorer, kan variation i GFP utsläpp resultera från experimentell variabler än [Ca2 +]cyt, såsom förändringar i cellulära pH, motion eller uttryck nivån på biosensor. Dessa frågor är inte stött med bandet Cameleons under bandet, som överföringen av energi från GFP till YFP uppstår endast vid Ca2 + bindning. Andra villkor som ändrar de fluorescerande egenskaperna hos de enskilda fluorophores är osannolikt att efterlikna de motsättande förändringarna i intensitet av GFP och YFP och proportionerlig beräkning som används till sin natur normaliserar måtten för många av dessa andra optiska artefakter23,30. Detta gör uppskattningar av absoluta [Ca2 +]cyt pålitligare med bandet Cameleons. Följaktligen används GCaMP3 bäst som en biosensor för att mäta relativ [Ca2 +]cyt, även om det är fortfarande tillräckligt för att identifiera och karakterisera biologiska fenomen i växter5,(in preparation). Därför är det viktigt att använda kontroller för att visa att den observerade effekten beror på Ca2 +, inklusive Ca2 +-relaterade genetiska mutanter(under utarbetande) eller farmakologiska Ca2 + kanal-hämmare såsom La3 + . Ännu viktigare, visas singel-FP biosensorer normalt en större fluorescerande avkastning och större dynamiskt omfång (dvs. en ökning av Blomningstid vid Ca2 + bindning) än bandet Cameleons23, vilket gör GCaMP mer lämpade för vävnad-nivå imaging, medan bandet Cameleons är ett användbart verktyg för cellulär avbildning med en confocal Mikroskop5,25.
Under genomförandet av detta protokoll är det möjligt att vissa problem kommer att uppstå som kräver felsökning. Exempelvis är det rekommenderat att prover där de kontroll (obehandlad) blad visar stor [Ca2 +]cyt höjder är kasseras (steg 6.3). Sådan transienter är troligen resultatet av stress induceras av microscopyen. Faktiskt, blått ljus är känt för att framkalla Ca2 + signaler38,39,40,41, och högintensiva ljuset kan också resultera i temperatur och osmotisk betonar, som båda också framkalla [Ca2 +]cyt förhöjningar21,25,publiceringsrättigheter för42. Följaktligen, för att minska sådana påfrestningar, det är viktigt att genomföra experimentet i ett välventilerat och temperaturreglerade rum och undvika onödigt långa exponeringstider. Det är också viktigt att inte störa bladen överdrivet under avlossning eller microscopyen att förhindra touch-framkallade [Ca2 +]cyt höjder43,44,45. Problem kan också uppträda med insekt lösa. Med M. persicae, insekter inte nöja sig på bladen i flera prover. Detta kan vara ett resultat av sår-framkallade försvar i den fristående blad46,47, eller störning av insekter av det blå ljuset. Faktiskt, vision i M. persicae styrs av tre fotoreceptorer, däribland en med en peak känslighet på 490 nm48. Minska mikroskopi exponering och hantering av bladlöss med vård kan minska lidande och uppmuntra lösa.
Protokollet beskrivs i aktuella uppsatsen ger nya insikter på molekylär förståelse av växt-insekt interaktioner och växt svar på biotic spänning. Det möjliggör visualisering av en av de första växt Svaren till Insekt utfodring och underlättar ytterligare undersökningar med hjälp av de avsevärda Arabidopsis genetiska resurserna tillgängliga. Dessutom detta protokoll möjliggör användning av levande organismer, i motsats till extrakt49 eller elicitors50. I framtiden, kunde denna teknik tillämpas andra biotiska påfrestningar, såsom ytterligare insektsarter, nematoder eller mikrobiella patogener, liksom abiotisk stress. GCaMP3 microscopyen kan också ändras så för att bilden andra växt vävnader, alternativa ROIs på blad, eller ens hela växter. Dessutom finns det potential för biosensor vara genetiskaly kodade i ytterligare växtarter. Protokollet beskrivs i denna uppsats har därför potential att undercover den molekylära basen för Ca2 + signalering i en rad nya biotiska interaktioner mellan växter och andra arter.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att deklarera.
Acknowledgments
Vi vill tacka Grant Calder (John Innes Centre, U.K.) för de råd om mikroskopi. Författarna vill även tacka John Innes Centre trädgårdsodling och entomologi avdelningar för deras hjälp. Detta arbete stöds av doktorand från den John Innes Foundation (T.V.), bevilja B/JJ004561/1 från BBSRC och stiftelsen John Innes (T.V., M.A., J.C., S.M., S.H., T.M. och D.S.), ett år i branschen placering från John Innes Centre (M.A.) , en sommar STUDENTTILLVARO från biokemiska Society UK (JC), JST PRESTO (MT) och bidrag MCB 1329723 och IOS-1557899 från National Science Foundation (MT och S.G.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35S::GCaMP3 Arabidopsis | John Innes Centre/Universty of Wisconsin | - | Step 1.1 |
| 100 mm2 square plastic plates | R & L Slaughter Ltd, Upminster, UK | For growing GCaMP plants (Step 1.1) | |
| ¼ strength Murashige and Skoog (MS) medium | homemade: 1.1 g Murashige and Skoog medium, 7.5 g sucrose, 10 g Formedium agar, 1 L de-ionised water | - | For growing GCaMP plants (Step 1.1) |
| Col-0 Arabidopsis | - | - | For growing aged aphid colony (Step 2.1) |
| Myzus persicae(Sulzer) | clone US1L, Mark Stevens, Brooms Barn | - | Orginally from Rothamsted Research, UK (Step 2.1) |
| Artist's paintbrush size 2 | Hobbycraft | 610101 | To tranfer aphids (Steps 2.1, 2.4 and 4.6) |
| 96-well MicrotitreTM plate | ThermoFisher Scientific | 2101 | To contain the detached GCaMP3 leaves (Step 3.2) |
| Aluminium foil | Wrap Film Systems, Telford, UK | 26B06 | To cover plates with floating leaves overnight (Step 3.3) |
| Clear plastic wrap | SC Johnson & Son, Racine, WI, USA | To cover plates with floating leaves overnight, and to cover leaves during microscopy (Steps 3.3 and 4.7) | |
| M205FA stereo microscope | Leica Microsystems | - | For GFP imaging (Step 4.1) |
| Leica Application Suite v3.2.0 | Leica Microsystems | Microscope software (Step 4.1) | |
| Fiji (Image J) v1.48a | National Institutes of Health, USA) | - | For image analysis (Step 6.1) |
References
- Sanders, D., Pelloux, J., Brownlee, C., Harper, J. F. Calcium at the crossroads of signaling. Plant Cell. 14, S401-S417 (2002).
- Dodd, A. N., Kudla, J., Sanders, D. The language of calcium signaling. Annu Rev Plant Biol. 61, 593-620 (2010).
- Blume, B., Nurnberger, T., Nass, N., Scheel, D. Receptor-mediated increase in cytoplasmic free calcium required for activation of pathogen defense in parsley. Plant Cell. 12 (8), 1425-1440 (2000).
- Lecourieux, D. Proteinaceous and oligosaccharidic elicitors induce different calcium signatures in the nucleus of tobacco cells. Cell Calcium. 38 (6), 527-538 (2005).
- Keinath, N. F., et al. Live cell imaging with R-GECO1 sheds light on flg22- and chitin-induced transient [Ca2+]cyt patterns in Arabidopsis. Mol Plant. 8 (8), 1188-1200 (2015).
- Verrillo, F., Occhipinti, A., Kanchiswamy, C. N., Maffei, M. E. Quantitative analysis of herbivore-induced cytosolic calcium by using a cameleon (YC 3.6) calcium sensor in Arabidopsis thaliana. J Plant Physiol. 171 (2), 136-139 (2014).
- Kiep, V. Systemic cytosolic Ca(2+) elevation is activated upon wounding and herbivory in Arabidopsis. New Phytol. 207 (4), 996-1004 (2015).
- Blackman, R. L., Eastop, V. F. Aphids on the world's crops: an identification and information guide. , John Wiley & Sons, Ltd. (2000).
- Ng, J. C. K., Perry, K. L. Transmission of plant viruses by aphid vectors. Mol Plant Pathol. 5 (5), 505-511 (2004).
- Ren, G. W., Wang, X. F., Chen, D., Wang, X. W., Liu, X. D. Effects of aphids Myzus persicae on the changes of Ca2+ and H2O2 flux and enzyme activities in tobacco. J Plant Interact. 9 (1), 883-888 (2014).
- Brownlee, C., Wood, J. W. A gradient of cytoplasmic free calcium in growing rhizoid cells of fucus-serratus. Nature. 320 (6063), 624-626 (1986).
- Miller, A. J., Sanders, D. Depletion of cytosolic free calcium induced by photosynthesis. Nature. 326 (6111), 397-400 (1987).
- Kanchiswamy, C. N., Malnoy, M., Occhipinti, A., Maffei, M. E. Calcium imaging perspectives in plants. Int J Mol Sci. 15 (3), 3842-3859 (2014).
- Ridgway, E. B., Ashley, C. C. Calcium transients in single muscle fibers. Biochem Biophys Res Commun. 29 (2), 229 (1967).
- Plieth, C. Plant calcium signaling and monitoring: pros and cons and recent experimental approaches. Protoplasma. 218 (1-2), 1-23 (2001).
- Campbell, A. K., Trewavas, A. J., Knight, M. R. Calcium imaging shows differential sensitivity to cooling and communication in luminous transgenic plants. Cell Calcium. 19 (3), 211-218 (1996).
- Mithofer, A., Mazars, C. Aequorin-based measurements of intracellular Ca2+-signatures in plant cells. Biol Proced Online. 4 (1), 105-118 (2002).
- Kwaaitaal, M., Huisman, R., Maintz, J., Reinstadler, A., Panstruga, R. Ionotropic glutamate receptor (iGluR)-like channels mediate MAMP-induced calcium influx in Arabidopsis thaliana. Biochem J. 440 (3), 355-365 (2011).
- Ranf, S., Eschen-Lippold, L., Pecher, P., Lee, J., Scheel, D. Interplay between calcium signalling and early signalling elements during defence responses to microbe- or damage-associated molecular patterns. Plant J. 68 (1), 100-113 (2011).
- Zhu, X. H., Feng, Y., Liang, G. M., Liu, N., Zhu, J. K. Aequorin-based luminescence imaging reveals stimulus- and tissue-specific Ca2+ dynamics in Arabidopsis plants. Mol Plant. 6 (2), 444-455 (2013).
- Kiegle, E., Moore, C. A., Haseloff, J., Tester, M. A., Knight, M. R. Cell-type-specific calcium responses to drought, salt and cold in the Arabidopsis root. Plant J. 23 (2), 267-278 (2000).
- Miyawaki, A., et al. Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. Nature. 388 (6645), 882-887 (1997).
- Koldenkova, V. P., Nagai, T. Genetically encoded Ca2+ indicators: properties and evaluation. BBA Mol Cell Res. 1833 (7), 1787-1797 (2013).
- Choi, J. Identification of a plant receptor for extracellular ATP. Science. 343 (6168), 290-294 (2014).
- Choi, W. G., Toyota, M., Kim, S. H., Hilleary, R., Gilroy, S. Salt stress-induced Ca2+ waves are associated with rapid, long-distance root-to-shoot signaling in plants. Proc Natl Acad Sci USA. 111 (17), 6497-6502 (2014).
- Evans, M. J., Choi, W. G., Gilroy, S., Morris, R. J. A ROS-assisted calcium wave dependent on atrbohd and tpc1 propagates the systemic response to salt stress in Arabidopsis roots. Plant Physiol. 171 (3), 1771-1784 (2016).
- Nagai, T., Sawano, A., Park, E. S., Miyawaki, A. Circularly permuted green fluorescent proteins engineered to sense Ca2+. P Natl Acad Sci USA. 98 (6), 3197-3202 (2001).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nat Biotechnol. 19 (2), 137-141 (2001).
- Akerboom, J., et al. Crystal structures of the GCaMP calcium sensor reveal the mechanism of fluorescence signal change and aid rational design. J Biol Chem. 284 (10), 6455-6464 (2009).
- Okumoto, S. Quantitative imaging using genetically encoded sensors for small molecules in plants. Plant J. 70 (1), 108-117 (2012).
- Ohkura, M., Matsuzaki, M., Kasai, H., Imoto, K., Nakai, J. Genetically encoded bright Ca2+ probe applicable for dynamic Ca2+ imaging of dendritic spines. Anal Chem. 77 (18), 5861-5869 (2005).
- Tallini, Y. N. Imaging cellular signals in the heart in vivo: cardiac expression of the high-signal Ca2+ indicator GCaMP2. Proc Natl Acad Sci USA. 103 (12), 4753-4758 (2006).
- Tian, L. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. J Neurosci. 32 (40), 13819-13840 (2012).
- Pedelacq, J. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein. Nat Biotechnol. 24 (1), 79-88 (2006).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Murashige, T., Skoog, F. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiol Plant. 15 (3), 473-497 (1962).
- Baum, G., Long, J. C., Jenkins, G. I., Trewavas, A. J. Stimulation of the blue light phototropic receptor NPH1 causes a transient increase in cytosolic Ca2+. Proc Natl Acad Sci USA. 96 (23), 13554-13559 (1999).
- Johnson, C. H. Circadian oscillations of cytosolic and chloroplastic free calcium in plants. Science. 269 (5232), 1863-1865 (1995).
- Johnson, C. H. Circadian oscillations of cytosolic and chloroplastic free calcium in transgenic luminous plants. Plant Physiol. 114 (3), 1408-1408 (1997).
- Harada, A., Shimazaki, K. I. Phototropins and blue light-dependent calcium signaling in higher plants. Photochem. Photobiol. 83 (1), 102-111 (2007).
- Plieth, C., Hansen, U. P., Knight, H., Knight, M. R. Temperature sensing by plants: the primary characteristics of signal perception and calcium response. Plant J. 18 (5), 491-497 (1999).
- Meyerhoff, O., et al. AtGLR3.4, a glutamate receptor channel-like gene is sensitive to touch and cold. Planta. 222 (3), 418-427 (2005).
- Knight, M. R., Campbell, A. K., Smith, S. M., Trewavas, A. J. Transgenic plant aequorin reports the effects of touch and cold-shock and elicitors on cytoplasmic calcium. Nature. 352 (6335), 524-526 (1991).
- Legue, V. Cytoplasmic free Ca2+ in Arabidopsis roots changes in response to touch but not gravity. Plant Physiol. 114 (3), 789-800 (1997).
- Koo, A. J. K., Gao, X. L., Jones, A. D., Howe, G. A. A rapid wound signal activates the systemic synthesis of bioactive jasmonates in Arabidopsis. Plant J. 59 (6), 974-986 (2009).
- Mousavi, S. A., Chauvin, A., Pascaud, F., Kellenberger, S., Farmer, E. E. GLUTAMATE RECEPTOR-LIKE genes mediate leaf-to-leaf wound signalling. Nature. 500 (7463), 422-426 (2013).
- Kirchner, S. M., Doring, T. F., Saucke, H. Evidence for trichromacy in the green peach aphid, Myzus persicae (Sulz.) (Hemiptera : Aphididae). J Insect Physiol. 51 (11), 1255-1260 (2005).
- Prince, D. C., Drurey, C., Zipfel, C., Hogenhout, S. A. The leucine-rich repeat receptor-like kinase BRASSINOSTEROID INSENSITIVE1-ASSOCIATED KINASE1 and the cytochrome P450 PHYTOALEXIN DEFICIENT3 contribute to innate immunity to aphids in Arabidopsis. Plant Physiol. 164 (4), 2207-2219 (2014).
- Chaudhary, R., Atamian, H. S., Shen, Z. X., Brigg, S. P., Kaloshian, I. GroEL from the endosymbiont Buchnera aphidicola betrays the aphid by triggering plant defense. Proc Natl Acad Sci USA. 111 (24), 8919-8924 (2014).
