Summary
Denne protokollen skisserer en enkel metode for å analysere kalsium signaler i planter generert av fôring hemipteran insekter, som bladlus. Arabidopsis thaliana forvandles med GFP kalsium biosensor GCaMP3 gir sanntid i vivo avbilding av kalsium dynamics med høy timelige og romlig oppløsning.
Abstract
Kalsiumioner er spådd til å bli viktig signalnettverk enheter under biotiske samhandling, med kalsium signalering danner en del av anlegget forsvar svaret mikrobiell elicitors og såret skyldes tygge insekter, fremlokkende systemisk kalsium signaler i planter. Rollen av kalsium i vivo under biotiske stress er imidlertid uklart. Denne protokollen beskriver bruken av en genetisk kodet kalsium sensor å oppdage kalsium signaler i planter under mating av en hemipteran pest. Felles at munndelene som bladlus pierce et lite antall celler med spesialisert, langstrakte suge munndeler, noe som gjør dem ideelle verktøyet å studere kalsium dynamics når en plante står overfor en biotiske stress, som er adskilt fra såret svar. I tillegg er fluorescerende biosensors revolusjonerer målingen signalnettverk molekyler i vivo i både dyr og planter. Uttrykke en GFP-baserte kalsium biosensor, GCaMP3, i modellen fabrikken Arabidopsis thaliana gir sanntid avbilding av anlegget kalsium dynamics under insekt fôring, med en høy romlig og tidsmessige oppløsning. En repeterbar og robust analysen har blitt utviklet ved hjelp av fluorescens mikroskopi frittliggende GCaMP3 blader, tillater for kontinuerlig måling av cytosolic kalsium dynamics før, under og etter insekt fôring. Dette avslører en sterkt lokalisert rask kalsium høyde rundt bladlus mate nettsted som oppstår innen få minutter. Protokollen kan tilpasses andre biotiske påkjenninger, for eksempel insekt vokser mens bruk av Arabidopsis thaliana tillater for rask generasjon av mutanter til rette molekylær analyse av fenomenet.
Introduction
Kalsium (Ca2 +) er en av de mest utbredte signalnettverk elementene i planter. En forbigående økning i cytosolic Ca2 + konsentrasjon ([Ca2 +]cyt) dekodes av et kompleks nettverk av nedstrøms komponenter og er involvert i svaret til både abiotiske og biotiske påkjenninger1,2. En økning i [Ca2 +]cyt er en av de første svarene å mikrobiell elicitors, danner en vanlig del av anlegget forsvar svar3,4,5. Stiger i [Ca2 +]cyt har også blitt observert svar på såret skyldes tygge insekter, som lepidopterans6,7. Imidlertid potensielle rolle plante Ca2 + signaler Svar å leve biotiske trusler som skade bare noen celler ikke har blitt undersøkt. Den grønne fersken bladlus Myzus persicae er et hemipteran insekt som representerer en betydelig trussel mot verden landbruk8,9, og Ca2 + middelklasseinnbyggere fra ekstracellulære plass er observert i blader infisert med M. persicae10. Denne protokollen beskriver en robust og repeterbare metode for å måle anlegget Ca2 + signaler mens M. persicae feed fra bladene med et fluorescerende Ca2 + biosensor, med både bladlus og GCaMP3 tilbyr romanen verktøy som dissekere rollen av Ca2 + under biotiske interaksjoner.
Ca2 +-selektiv microelectrodes tidligere ble brukt til å måle [Ca2 +] i planter11,12. Flere nylig, bioluminescent og fluorescerende tilnærminger har blitt standardisert. Disse biosensors binder Ca2 + og avgir lys, slik at un paralleled muligheter til å studere Ca2 + dynamikk i både celler og hele vev. Ca2 + biosensors kan injiseres som fargestoffer eller stabilt produsert ved innføring av biosensor koding sekvens i genomet av organismen via transformasjon (dvs. genetisk kodet biosensors). Sistnevnte gir store fordeler av å være enkelt uttrykkes i levende vev og dyktige subcellular lokalisering13. Aequorin protein, isolert fra Aequorea victoria (maneter) var den første genetisk kodet Ca2 + biosensor i planter14. Som en bioluminescent protein krever ikke aequorin magnetisering av eksterne lys, som unngår chromophore bleking og autofluorescence15. Aequorin har blitt brukt til å måle [Ca2 +] flukser i respons på ulike stimuli, inkludert temperatur16, patogener17,18,19, salt stress20 ,21, og såret7. Men er det vanskeligstilte av relativt lav signalstyrke intensiteten, gjør påvisning av [Ca2 +] flukser i individuelle celler og vev med dårlig sensor uttrykk vanskelig13.
Utviklingen av Ca2 + biosensors som kan fluoresce utfylt aequorin ved at for detaljert subcellular og vev-nivå analyse av Ca2 + dynamics. En av de vanligste fluorescerende biosensors er fluorescens resonans energi-overføring (bånd)-basert Cameleons. BÅND Cameleons består av to proteiner, vanligvis CFP og YFP, som er brakt i nærkontakt av conformational endringen av binding av Ca2 + et calmodulin domene i regionen CFP-YFP linker. Denne kontakten kan om overføring av energi fra CFP YFP, og den resulterende forandringen i fluorescens av disse fluorophores gir nøyaktig kvantifisering av [Ca2 +] gjennom beregningen av forholdet mellom fluorescens signalene fra to fluorophores22. BÅND Cameleons er bedre enn aequorin og ikke-ratiometric fluorescerende fargestoffer, som de er mindre påvirket av hvilket uttrykk protein23 og ofte har en større fluorescerende avkastning, tillater for mobilnettet og subcellular tenkelig23. For eksempel har bånd Cameleons nylig brukt til å identifisere langdistanse Ca2 + signaler i planter og løse disse til mobilnettet nivå24,25,26.
Et siste gjennombrudd med fluorescerende GFP-baserte Ca2 + biosensors har vært utviklingen av svært følsom single-fluorophore (single-FP) biosensors. Single-FP biosensors består av en enkelt sirkulært permutated GFP koblet til et calmodulin M13 peptid, med Ca2 + binding til calmodulin, noe som resulterer i en vann-mediert reaksjon mellom calmodulin og GFP så protonere GFP og øke fluorescerende avkastning27,28,29. Single-FP sensorer tilbyr flere fordeler sammenlignet med bånd Cameleons, inkludert enklere eksperimentell design og potensielt høyere timelige oppløsning Imaging30. Selv om single-FP sensorer ikke kan tallfeste absolutt [Ca2 +] som bare som bånd sensorer, de er overlegen for analyse av timelige og romlig dynamikken i Ca2 + signaler5,23. GCaMPs er en av de best etablerte single-FP sensorer28 og har gjennomgått flere endringer for å forbedre deres fluorescerende avkastning, dynamisk område, Ca2 + affinitet og signal-til-støy-forhold31,32 , 33 , 34. the GCaMPs har blitt brukt i dyr systemer, slik som sebrafisk motor neurons35 og frukt fly nevromuskulær veikryss34. Tilfeldig mutagenese av GCaMP3 har resultert i flere klasser av enkelt-FP sensorer, inkludert de ultrasensitive GCaMP636 og GECOs29. GECOs ble nylig brukt i Arabidopsis thaliana (heretter referert til som Arabidopsis) å måle Ca2 + flukser svar på ATP og chitin bakteriell elicitor flg22. Denne studien viste også at R-GECO-biosensor oppnådd bånd Cameleon YC3.6 i maksimal signal endring og signal-til-støy forholdet5.
På grunn av brukervennlighet bruk, høykapasitets fluorescerende og høy midlertidig løsning som kan oppnås med GCaMP biosensors, var GCaMP3 genetisk kodet i Arabidopsis under blomkål mosaikk virus 35S arrangøren. Genetisk verktøyene for Arabidopsis forskning gir detaljert molekylær analyse av Ca2 + signaler målt ved GCaMP3. I tillegg kan GCaMP3 biosensor visualiseres under fluorescens mikroskop snarere enn en dyrere AC confocal system. Denne protokollen gir hele-vev imaging essensielt når gjennomføre eksperimenter med live biotiske påkjenninger. Eksperimentet er utformet slik at frittliggende blader fra 35S::GCaMP3 planter er fløt i vann, å forhindre insekt rømme og begrense fôring til en bestemt vev. Metoden beskrevet i dette dokumentet derfor tillater for analyse av blad Ca2 + dynamics under mating av M. persicae, resulterer i karakterisering av en roman plante signalering svar. Denne metoden kan også tilpasses med andre biotiske påkjenninger, for eksempel insekt vokser og mikrobiell patogener, og med andre plante vev, som røtter.
Protocol
1. anlegget forberedelse (dager 1 - 4)
- på dag 1, sterilisere 35S::GCaMP frø med tre 75% etanol vasker, 1 min per vask og plate dem på 100 mm 2 kvadrat plast-plater med ¼-styrke Murashige og Skoog (MS) medium (Oppskrift: 1.1 g av Murashige og Skoog medium, 7.5 g av sukrose, 10 g Formedium agar og 1 L de-ionisert vann) 37.
- Stratify seedlings i mørket i tre dager på 8 ° C å oppnå synkron spiring.
- På dag 4 av eksperimentet, flytte GCaMP seedlings til et kontrollert miljø rom (CER) på 23 ° C, med en 16 timer lys og 8t mørke fotoperiode.
2. Insekt Rearing (dager 11 - 12)
- på dag 11 av eksperimentet, legger 15 voksen M. persicae til 5-uke-gamle jord dyrket Arabidopsis planter ved hjelp av en fuktig artist ' s pensel (størrelse 2 eller 4) (dyrket i en CER på 22 ° C med 10t lys og 14 h mørk photoperio d).
- bur bladlus på anlegget ved å plassere klar plast slangen (10 cm x 15 cm) rundt anlegget og lue med plast lokk.
- La bladlus-infested planter for 24 timer i en CER på 22 ° C med en 16-h lys og 8-h mørke fotoperiode.
- På dag 12 i eksperimentet, fjerne alle voksen M. persicae ved hjelp av en pensel.
Merk: Insekter kan sees av øyet på anlegget. Dette gir en befolkning på nymfer med samme utviklingsmessige alder. Omtrent 1 nymfe per voksen vil bli produsert i denne perioden. - La infested plantene i en lavere temperatur CER ved 16 ° C, med en 8 timer lys og 16 h mørke fotoperiode, hindre at nymfene øker i størrelse for fort.
3. Leaf avdeling (dag 19)
- på dag 19 i eksperimentet, Fjern 35S::GCaMP3 seedlings fra CER og koble det største bladet fra hver plante med en skarp saks.
- Med en pinsett, plassere frittliggende bladet i av en 96-brønns plate inneholder 300 µL av destillert vann, abaxial overflaten grossist. Gjenta for flere blader ( figur 1).
figur 1: 35S::GCaMP3 blad analysen. Det største bladet fra hver 16 dager gamle 35S::GCaMP3 Arabidopsis frøplante er frittstående og fløt på 300 µL destillert vann i en 96-brønns plate. Bilde tatt dagen etter avdeling. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- dekk platen i klar plast brytes og aluminiumsfolie og la ved romtemperatur over natten for å tillate stress brøkdel å avta.
4. fluorescens mikroskopi (dager 20 - 22)
- på dag 20 i eksperimentet, fjerne 96-brønns platen fra aluminiumsfolie og overføre den til en fluorescens stereomicroscope. Konfigurere stereo fluorescens mikroskopet opphisse GFP med 450-490 nm lys og ta opp fluorescerende utslipp mellom 500 og 550 nm.
- Samle alderen bladlus fra kolonien etablert på dag 11 av fjerner anlegget fra jord og plassert i en gjennomsiktig boks med lokk. Holde insekter finnes i boksen mens drive eksperimentet.
- Sted 96-brønns platen under mikroskopet. Endre lys eksponering til GCaMP3 fluorescens kan være tydelig visualisert i venene frittliggende bladene. Holde eksponering konstant for alle eksperimentene; for gjeldende protokollen, en 1-s eksponering ble brukt med en gevinst på 3,5 ( figur 2).
- Justerer forstørrelsen og zoom av mikroskopet slik at 4 brønner kan observeres i en ramme, for gjeldende protokollen, brukte en 7,8 X forstørrelse og fokus på-127.833 mm.
- Overføre en bladlus til et frittstående blad under mikroskop med en fuktig maling pensel. La en tilstøtende blad ubehandlet som en kontroll, men lett berøring den med pensel til å etterligne den berøre som oppstår under bladlus overføring. Husk å plassere plastfolie tilbake over 96-brønns platen under mikroskopi å hindre insekt rømmer.
- Starte fluorescens innspillingen av bladene parvis (1 bladlus behandlet og 1 ubehandlet) ved å klikke " starte eksperiment " i innebygde mikroskop programvaren ( figur 2). Registrer målinger for 50 min.
Merk: For gjeldende protokollen, et tidsintervall 5 s mellom målinger ble brukt. - Etter 50 min, stoppe innspillingen ved å klikke på " stoppe eksperimentet " og fjerne bladlus fra bladet. Lagre fluorescens målinger som bildefiler (f.eks merket image arkiv formatter, TIFF).
- Gjenta eksperimentet med ytterligere par blader, bildebehandling kan utvides slik bilde 2 par blader samtidig, slik at samtidig avbilding av 2 genotyper.
5. Innsamling av
- importere bildefilene i Fiji (bilde J) og konvertere dem til 32 bits ved å klikke på " bilde " > " Type " > " 32-bit; " dette gir konvertering av bilder i heatmap videoer (se trinn 7).
- Forkaste prøvene der bladlus ikke slå på ett sted for mer enn 5 min ved å vise insekt bevegelse under mikroskopet.
Merk: Dette er ofte fleste av prøver og opptil 100 behandlinger kan være nødvendig å finne 30 prøvene stille vellykket settling. - Angi målskalaen piksler (eller konvertere mm, hvis kjent) og tidsrammen til det samme tidsintervallet som brukes under mikroskopi ved å klikke på " bilde " > " egenskaper. "
- Bruker markøren, plasserer en region av interesse (ROI) rundt området av vev for GFP analyse.
Merk: I den gjeldende protokollen, en sirkulær ROI 50 piksler (0,65 mm) i diameter ble brukt på 3 steder av interesse: bladlus mate område (AS), et systemisk område på midrib av bladet (Sm) og et systemisk område ved siden av midrib (" lateral vev " Sl) ( figur 2).- Opprette Avkastningen ved å tegne ellipser (bruker den " oval verktøyet "), og redigere størrelse med " redigere " > " utvalg " > " angi. " se figur 2.
- For ubehandlede kontrollen Velg ROIs i sammenlignbare regioner i bladet til valgte på behandlet blad (dvs. samme område av bladet som der bladlus fed på behandlet blad) ( figur 2).
figur 2: analysere GCaMP3 fluorescens Under mikroskopet. Venstre: ubehandlet kontroll blad. Høyre: bladlus-behandlet blad. Bladlus mate området angis med pilspiss. Skala bar = 1 mm. (A) lyse feltet bilde. Forstørrelse: 7,8 X, fokus:-127.833 mm, eksponering: 1 s. (B) GFP bildet showing ROIs brukes for kvantitativ analyse av fluorescens. FS = fôring området, Sm = systemisk midrib, Sl = systemisk lateral vev. Forstørrelse: 7,8 X, fokus:-127.833 mm, eksponering: 1 s. GFP var glade med en 450 til 490 nm metall metallhalid lampe og fluorescerende utslipp ble fanget mellom 500 og 550 nm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- bruker tid serien Analyzer plugg ved å klikke " Plugins " > " tid serien Analyzer " analysere rå fluorescens verdiene (F) i avkastning over tid. Legge til Avkastningen av interesse (" Legg [t] "). Pass på at Avkastningen er valgt, Velg " få gjennomsnittlig; " dette vil vise en tabell med F verdier for hver ramme i at Avkastningen.
- Kopiere dataene til et regneark.
- Beregne arealet av fôring området signalet ved først å velge område ved hjelp av " Frihånd utvalg verktøy. " viser maksimal GFP signalet og deretter beregne arealet av denne figuren ved å klikke " analyser " > " mål. "
- Beregn hastigheten på fôring området signalet med MTrackJ plugg ved å klikke " Plugins " > " sporing " > " MTrackJ. "
- Klikk på den " Legg til " og klikk deretter markøren i midten av signalet er først synlig. Klikk igjen på kanten av signalet på punktet av lengst spredt. Klikk " måle " til å beregne hastigheten til signalet.
6. Dataanalyse
- Definer poenget med bladlus bosatte seg ved å spille gjennom delbildene fra mikroskopet Fiji.
Merk: Tid for å bosette er rammen der bladlus forblir på ett sted i 5 minutter eller mer. Varigheten av settling hendelser kan også beregnes fra bildene i Fiji. - Normaliserer F dataene (ΔF/F) i henhold til formelen ΔF/F = (F - F 0) /F 0, der F 0 er den gjennomsnittlige planlagte fluorescensen beregnes ut fra gjennomsnittet av F over de første 60 rammene i innspillingen før bladlus avgjort. Gjenta for ubehandlet kontroll.
- Plot den normaliserte GFP fluorescensen (ΔF/F) over tid for at Avkastningen i behandlet og ubehandlet blad. Forkaste prøver (både blader) hvis ubehandlet kontrollen viser stor Ca 2 + transienter (dvs. ΔF/F stiger over 0,2).
- Gjenta til minst 20-30 levedyktig prøver er analysert per genotype.
7. Tid-kurs Video opprettelse
- konvertere den 32-bits bildefiler i heatmaps med NucMed_Image LUTs plugg ved å klikke " Plugins " > " NucMed " > " oppslag tabeller. " oppslag tabeller menyen Velg " blå grønn rød " å konvertere bilder til varme kart.
- Forbedre kontrasten av heatmap å markere bladlus-skapte GFP signaler ved hjelp av " prosessen " > " forbedre kontrasten " > " justere mettet piksler %. "
- Legg til tidsinformasjon med tid Stamper plugg ved å klikke på " Plugins " > " tid Stamper ". Angi de " startklokkeslettet " på " 0 " og " intervall " basert på tidsintervallet brukes til mikroskopi (f.eks 5 s).
- Eksportere denne videoen som en audio video interleaved (AVI)-fil.
Merk: Denne videoen kan deretter redigeres i andre programvarepakker (f.eks Microsoft Movie Maker).
Representative Results
Figur 3 og Figur 4 er representant resultater fra et eksperiment sammenligne en bladlus-behandlet blad med en ubehandlet kontroll. En svært lokaliserte økning i GFP fluorescens kan sees rundt fôring området innen få minutter i fleste prøver, mens Ca2 + dynamikken i ubehandlet kontroll blad opphold relativt stabile (figur 3A og 3B). Det er også mulig å sekundær øker GFP fluorescens etter den første toppen i noen eksperimenter (figur 3B). Bladlus slå ikke opp til 50% av behandlet blader, og prøvene skal kastes. Prøvene i som settling oppstår, viser 27% av prøver ikke klar økning i GFP fluorescens rundt fôring området (Figur 3 c og tabell 1); 25-30 Repliker eksempler bør derfor være gjennomsnitt for kvantitativ analyse. Visualisering av området og hastigheten på fôring stedet [Ca2 +]cyt høyden skal avsløre et signal for omkring 110 µm reiser på 6 µm/s (tabell 1). I tillegg skal ingen [Ca2 +]cyt høyder oppdages systemisk i bladet på bladlus behandling, enten i den systemiske midrib (figur 4A) eller systemisk lateral vev regionene (figur 4B). Video 1vises et representativt utvalg av [Ca2 +]cyt dynamics over tid. Det er også mulig å analysere bladlus bosetting atferd ved å spore antallet og varigheten av bosetting enkelthendelser under mikroskopet. Representant resultatene for disse atferder vises i tabell 1viser at bladlus ta rundt 10 min før settling, og når de utligner vellykket, dette varer i 20 min i gjennomsnitt. Derfor avgjøres insekter på ett sted for helheten av [Ca2 +]cyt høyde.
Figur 3: GCaMP3 kan brukes til å oppdage bladlus-skapte Ca2 + signaler på webområdet fôring i frittstående blader. Venstre: representant spor (n = 30) av normaliserte GFP fluorescens (ΔF/F) rundt fôring et 35S::GCaMP3 blad. Spor vise 5 min før settling inntil 25 min post settling. Kontroll = tilsvarende plasseringen på en ubehandlet 35S::GCaMP3 blad. Høyre: representant stereomicroscope bilde av [Ca2 +]cyt heving sett rundt en bladlus mate område på et 35S::GCaMP3 blad. GFP fluorescens er fargekodet etter innfelt skalaen. Bladlus IDen i hvitt og fôring området angitt med pilspiss. Forstørrelse: 7,8 X, fokus:-127.833 mm, eksponering: 1 s. GFP var glade med en 450 til 490 nm metall metallhalid lampe og fluorescerende utslipp ble fanget mellom 500 og 550 nm. (A) et eksempel på en stor bladlus-indusert [Ca2 +]cyt høyde. (B) et eksempel på en gjennomsnittlig bladlus-indusert [Ca2 +]cyt høyde. (C) et eksempel på ingen bladlus-indusert [Ca2 +]cyt høyde. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Parameteren | Gjennomsnittlig (± SEM) |
| [Ca2 +] cyt heving | |
| Prosent av prøvene viser en [Ca2 +]cyt heving | 73% |
| Hastigheten på wave foran en | 5.9 µm/s (± 0,6) |
| Maksimum area of spredning | 110 µm2 (± 18) |
| Bladlus atferd | |
| Antall ro (> 5 min) | 2 (± 0.1) |
| Totalt antall ro (alle varigheter) | 3.8 (± 0,4) |
| Tiden bosatte seg for tenkelig b | 20 min (± 2) |
| Tid før første bosette c | 11 min (± 1.4) |
| Andelen totale tidsbruk avgjort | 62% (± 3) |
Tabell 1: [Ca2 +]cyt høyde og bladlus oppførselsparameterne i løpet av 35S::GCaMP3 Imaging. Parametere beregnet fra levedyktig prøver som bosetting av > 5 min oppstod. (A) hastigheten på synlig signalet fra poenget med innvielsen til lengst punktet spredt. (B) varighet av første bosetting hendelsene brukes til analyse av fluorescens. (C) tidsrom mellom begynnelsen av imaging og den første bladlus bosette. [Ca2 +] cyt Høydedata tidligere sendt til The anlegget celle (gjeldende status: første QC).
Figur 4: GCaMP3 finner bladlus-skapte Ca2 + signaler systemisk til fôring området. Representant spor (n = 30) av normaliserte GFP fluorescens (ΔF/F) steder systemisk til bladlus mate området i 35S::GCaMP3 forlater. Spor vise 5 min før settling inntil 25 min post settling. Kontroll = tilsvarende plasseringen på en ubehandlet 35S::GCaMP3 blad. (A) ΔF/F i regionen systemisk midrib. (B) ΔF/F i regionen systemisk lateral vev. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Video 1: GCaMP3 Florescence Over tid som en bladlus Feeds. GFP fluorescens er fargekodet etter innfelt skalaen. Bladlus mate området angis med pilspiss. Venstre: 35S::GCaMP3 blad utsatt for en M. persicae voksen. Høyre: En 35S::GCaMP3 no-bladlus kontroll blad. Vennligst klikk her å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Discussion
Metoden beskrevet i dette dokumentet kan for sanntids analyse av Ca2 + signalering under en biotiske stress som insekt fôring. Viser at en av første anlegget svar slike trusler er en lokalisert [Ca2 +]cyt heving rundt fôring området av insekt. Ved hjelp av mutanter, denne metoden vil tillate for den molekylære og fysiologiske karakterisering av slike signaler, som ikke var mulig tidligere. Et viktig skritt i denne protokollen er å sikre at frittliggende bladene ikke er overdrevet forstyrret avdeling (trinn 3.2) eller når du overfører insekter til bladene (trinn 4.5). Gitt at gjeldende protokollen gir en relativ måleenhet for [Ca2 +]cyt i stedet for en absolutt konsentrasjon, er det viktig at innstillingen mikroskop holdes konstant gjennom hele eksperimentet. Det er også muligheten for menneskelig bias under valg av ROIs og analyse av data, og som sådan, anbefales det at eksperimenter er gjennomført dobbelt-blind.
Det er flere viktige fordeler av måler [Ca2 +]cyt under biotiske stress med denne protokollen. Først, bruk av en enkelt fluorophore med en høy fluorescerende avkastning lar avbilding gjennomføres på en stereomicroscope, som er mindre kostnadskrevende enn å bruke en AC confocal mikroskop. Bruk av en enkelt fluorophore gjør også datainnsamling, analyse enkelt, som det er bare ett mål å registrere. I tillegg kan bruken av en stereomicroscope for avbilding av hele blader, som det er viktig at mange biotiske interaksjoner, inkludert plante-bladlus interaksjoner, oppstår romlige stort. Høy timelige oppløsningen til fange mulig med GCaMP3, basert på den raske tilknytningene til Ca2 + fra sensoren etter bindende23,30 og fluorescerende høykapasitets, tillater mål å bli tatt opp til hver 5 s. Videre hindrer blad analysen rømning av insekt, en nøkkel som begrenser skritt for å gjennomføre slike eksperimenter på hele planter (i forberedelse). Frittstående bladene også sikre at insekt strømmer fra en forhåndsdefinert plassering, slik at for analyse av Ca2 + dynamics før, under og etter fôring. Denne protokollen sikrer også at bladene av lignende utviklingsstadier brukes for analyse.
Det hovedavdeling ulempen av denne protokollen kommer fra bruk av en ikke-ratiometric biosensor. Med ett-FP biosensors, kan det føre variasjon i GFP utslipp fra experimental variabler enn [Ca2 +]cyt, for eksempel endringer i mobilnettet pH, bevegelse eller hvilket uttrykk i biosensor. Disse problemene er ikke oppdaget med bånd Cameleons under bånd, overføring av energi fra CFP til YFP bare forekommer ved Ca2 + bindende. Andre forhold som endrer fluorescerende egenskapene for den personlige fluorophores er usannsynlig å etterligne de motstridende endringene i intensiteten av CFP og YFP, og ratiometric beregningen som brukes iboende normaliserer målene for mange av disse andre optisk gjenstander23,30. Dette gjør beregninger av absolutt [Ca2 +]cyt mer pålitelig med bånd Cameleons. Følgelig brukes GCaMP3 som en biosensor til å måle relative [Ca2 +]cyt, selv om det er fremdeles nok til å oppdage og karakterisere biologiske fenomener i planter5,(in preparation). Derfor er det viktig å bruke kontroller til å vise at den observerte effekten skyldes Ca2 +, inkludert Ca2 +-relaterte genetiske mutanter(i forberedelse) eller farmakologiske Ca2 + kanal hemmere som La3 + . Viktigere, vise enkelt-FP biosensors vanligvis en større fluorescerende avkastningen og større dynamisk område (dvs. en økning i florescence på Ca2 + bindende) enn bånd Cameleons23, som gjør GCaMP mer egnet til vev-nivå bildebehandling, mens bånd Cameleons er et nyttig verktøy for mobil bildebehandling med en AC confocal mikroskop5,25.
Under kjøring av denne protokollen er det mulig at noen problemer vil oppstå som krever problemløsing. Det anbefales for eksempel som eksempler der kontroll (ubehandlet) blad viser store [Ca2 +]cyt høyder er forkastet (trinn 6.3). Slike transienter er sannsynligvis et resultat av stress indusert av mikroskopi. Faktisk, blått lys kjent å lokke fram Ca2 + signaler38,39,40,41, og høy intensitet lys kan også resultere i temperatur og osmotisk påkjenninger, begge også framprovosere [Ca2 +]cyt høyder21,25,42. Derfor redusere slike påkjenninger, er det viktig å gjennomføre eksperimentet i et godt ventilert og temperaturkontrollerte rom og unngå unødvendig lange eksponeringstider. Det er også viktig å ikke forstyrre bladene overdrevet under avdeling eller under mikroskopi å hindre touch-skapte [Ca2 +]cyt høyder43,44,45. Problemene kan også oppstå med insekt settling. Med M. persicaeslå insekter ikke på bladene i flere prøver. Dette kan være et resultat av såret-skapte forsvar i frittstående blader46,-47, eller forstyrrelse av insekter av blått lys. Faktisk styres synet på M. persicae av tre fotoreseptorer, inkludert ett med en topp følsomhet på 490 nm48. Redusere mikroskopi eksponering og håndtering bladlus med omsorg kan redusere nød og oppmuntre settling.
Protokollen i dagens papir gir ny innsikt på molekylære forståelsen av plante-insekt interaksjoner og plante svaret biotiske stress. Det gir effekten av en av første anlegget svar insekt fôring og forenkler videre undersøkelser ved hjelp av de betydelige Arabidopsis plantegenetiske ressursene tilgjengelig. I tillegg denne protokollen tillater bruk av levende organismer, i motsetning til ut49 eller elicitors50. I fremtiden, kan denne teknikken brukes til andre biotiske påkjenninger, for eksempel insekt vokser og nematoder mikrobiell patogener, og abiotiske stress. GCaMP3 mikroskopi kan også endres for å image andre plante vev, alternativ ROIs på bladet, eller hele planter. Videre er mulig for biosensor å være genetically kodet i flere plantearter. Følgelig har protokollen i dette papiret potensial til undercover molekylær grunnlag av Ca2 + signalering i en rekke romanen biotiske interaksjoner mellom planter og andre arter.
Disclosures
Forfatterne har ingen konflikter av interesse å erklære.
Acknowledgments
Vi ønsker å takke Grant Calder (John Innes Centre, U.K.) for råd om mikroskopi. Forfatterne også ønsker å takke John Innes sentrum hagebruk og entomologi avdelinger for deres hjelp. Dette arbeidet ble støttet av en PhD studentship fra John Innes Foundation (T.V.), gi B/JJ004561/1 fra BBSRC og John Innes Foundation (TV, M.A., JC, S.M., sh, T.M. og DS), et år i bransjen plassering fra John Innes sentrum (M.A.) , en sommer studentship fra biokjemiske Society UK (JC), JST VIPs (Mt) og gir kalt MCB 1329723 og IOS-1557899 fra National Science Foundation (MT og S.G.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35S::GCaMP3 Arabidopsis | John Innes Centre/Universty of Wisconsin | - | Step 1.1 |
| 100 mm2 square plastic plates | R & L Slaughter Ltd, Upminster, UK | For growing GCaMP plants (Step 1.1) | |
| ¼ strength Murashige and Skoog (MS) medium | homemade: 1.1 g Murashige and Skoog medium, 7.5 g sucrose, 10 g Formedium agar, 1 L de-ionised water | - | For growing GCaMP plants (Step 1.1) |
| Col-0 Arabidopsis | - | - | For growing aged aphid colony (Step 2.1) |
| Myzus persicae(Sulzer) | clone US1L, Mark Stevens, Brooms Barn | - | Orginally from Rothamsted Research, UK (Step 2.1) |
| Artist's paintbrush size 2 | Hobbycraft | 610101 | To tranfer aphids (Steps 2.1, 2.4 and 4.6) |
| 96-well MicrotitreTM plate | ThermoFisher Scientific | 2101 | To contain the detached GCaMP3 leaves (Step 3.2) |
| Aluminium foil | Wrap Film Systems, Telford, UK | 26B06 | To cover plates with floating leaves overnight (Step 3.3) |
| Clear plastic wrap | SC Johnson & Son, Racine, WI, USA | To cover plates with floating leaves overnight, and to cover leaves during microscopy (Steps 3.3 and 4.7) | |
| M205FA stereo microscope | Leica Microsystems | - | For GFP imaging (Step 4.1) |
| Leica Application Suite v3.2.0 | Leica Microsystems | Microscope software (Step 4.1) | |
| Fiji (Image J) v1.48a | National Institutes of Health, USA) | - | For image analysis (Step 6.1) |
References
- Sanders, D., Pelloux, J., Brownlee, C., Harper, J. F. Calcium at the crossroads of signaling. Plant Cell. 14, S401-S417 (2002).
- Dodd, A. N., Kudla, J., Sanders, D. The language of calcium signaling. Annu Rev Plant Biol. 61, 593-620 (2010).
- Blume, B., Nurnberger, T., Nass, N., Scheel, D. Receptor-mediated increase in cytoplasmic free calcium required for activation of pathogen defense in parsley. Plant Cell. 12 (8), 1425-1440 (2000).
- Lecourieux, D. Proteinaceous and oligosaccharidic elicitors induce different calcium signatures in the nucleus of tobacco cells. Cell Calcium. 38 (6), 527-538 (2005).
- Keinath, N. F., et al. Live cell imaging with R-GECO1 sheds light on flg22- and chitin-induced transient [Ca2+]cyt patterns in Arabidopsis. Mol Plant. 8 (8), 1188-1200 (2015).
- Verrillo, F., Occhipinti, A., Kanchiswamy, C. N., Maffei, M. E. Quantitative analysis of herbivore-induced cytosolic calcium by using a cameleon (YC 3.6) calcium sensor in Arabidopsis thaliana. J Plant Physiol. 171 (2), 136-139 (2014).
- Kiep, V. Systemic cytosolic Ca(2+) elevation is activated upon wounding and herbivory in Arabidopsis. New Phytol. 207 (4), 996-1004 (2015).
- Blackman, R. L., Eastop, V. F. Aphids on the world's crops: an identification and information guide. , John Wiley & Sons, Ltd. (2000).
- Ng, J. C. K., Perry, K. L. Transmission of plant viruses by aphid vectors. Mol Plant Pathol. 5 (5), 505-511 (2004).
- Ren, G. W., Wang, X. F., Chen, D., Wang, X. W., Liu, X. D. Effects of aphids Myzus persicae on the changes of Ca2+ and H2O2 flux and enzyme activities in tobacco. J Plant Interact. 9 (1), 883-888 (2014).
- Brownlee, C., Wood, J. W. A gradient of cytoplasmic free calcium in growing rhizoid cells of fucus-serratus. Nature. 320 (6063), 624-626 (1986).
- Miller, A. J., Sanders, D. Depletion of cytosolic free calcium induced by photosynthesis. Nature. 326 (6111), 397-400 (1987).
- Kanchiswamy, C. N., Malnoy, M., Occhipinti, A., Maffei, M. E. Calcium imaging perspectives in plants. Int J Mol Sci. 15 (3), 3842-3859 (2014).
- Ridgway, E. B., Ashley, C. C. Calcium transients in single muscle fibers. Biochem Biophys Res Commun. 29 (2), 229 (1967).
- Plieth, C. Plant calcium signaling and monitoring: pros and cons and recent experimental approaches. Protoplasma. 218 (1-2), 1-23 (2001).
- Campbell, A. K., Trewavas, A. J., Knight, M. R. Calcium imaging shows differential sensitivity to cooling and communication in luminous transgenic plants. Cell Calcium. 19 (3), 211-218 (1996).
- Mithofer, A., Mazars, C. Aequorin-based measurements of intracellular Ca2+-signatures in plant cells. Biol Proced Online. 4 (1), 105-118 (2002).
- Kwaaitaal, M., Huisman, R., Maintz, J., Reinstadler, A., Panstruga, R. Ionotropic glutamate receptor (iGluR)-like channels mediate MAMP-induced calcium influx in Arabidopsis thaliana. Biochem J. 440 (3), 355-365 (2011).
- Ranf, S., Eschen-Lippold, L., Pecher, P., Lee, J., Scheel, D. Interplay between calcium signalling and early signalling elements during defence responses to microbe- or damage-associated molecular patterns. Plant J. 68 (1), 100-113 (2011).
- Zhu, X. H., Feng, Y., Liang, G. M., Liu, N., Zhu, J. K. Aequorin-based luminescence imaging reveals stimulus- and tissue-specific Ca2+ dynamics in Arabidopsis plants. Mol Plant. 6 (2), 444-455 (2013).
- Kiegle, E., Moore, C. A., Haseloff, J., Tester, M. A., Knight, M. R. Cell-type-specific calcium responses to drought, salt and cold in the Arabidopsis root. Plant J. 23 (2), 267-278 (2000).
- Miyawaki, A., et al. Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. Nature. 388 (6645), 882-887 (1997).
- Koldenkova, V. P., Nagai, T. Genetically encoded Ca2+ indicators: properties and evaluation. BBA Mol Cell Res. 1833 (7), 1787-1797 (2013).
- Choi, J. Identification of a plant receptor for extracellular ATP. Science. 343 (6168), 290-294 (2014).
- Choi, W. G., Toyota, M., Kim, S. H., Hilleary, R., Gilroy, S. Salt stress-induced Ca2+ waves are associated with rapid, long-distance root-to-shoot signaling in plants. Proc Natl Acad Sci USA. 111 (17), 6497-6502 (2014).
- Evans, M. J., Choi, W. G., Gilroy, S., Morris, R. J. A ROS-assisted calcium wave dependent on atrbohd and tpc1 propagates the systemic response to salt stress in Arabidopsis roots. Plant Physiol. 171 (3), 1771-1784 (2016).
- Nagai, T., Sawano, A., Park, E. S., Miyawaki, A. Circularly permuted green fluorescent proteins engineered to sense Ca2+. P Natl Acad Sci USA. 98 (6), 3197-3202 (2001).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nat Biotechnol. 19 (2), 137-141 (2001).
- Akerboom, J., et al. Crystal structures of the GCaMP calcium sensor reveal the mechanism of fluorescence signal change and aid rational design. J Biol Chem. 284 (10), 6455-6464 (2009).
- Okumoto, S. Quantitative imaging using genetically encoded sensors for small molecules in plants. Plant J. 70 (1), 108-117 (2012).
- Ohkura, M., Matsuzaki, M., Kasai, H., Imoto, K., Nakai, J. Genetically encoded bright Ca2+ probe applicable for dynamic Ca2+ imaging of dendritic spines. Anal Chem. 77 (18), 5861-5869 (2005).
- Tallini, Y. N. Imaging cellular signals in the heart in vivo: cardiac expression of the high-signal Ca2+ indicator GCaMP2. Proc Natl Acad Sci USA. 103 (12), 4753-4758 (2006).
- Tian, L. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. J Neurosci. 32 (40), 13819-13840 (2012).
- Pedelacq, J. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein. Nat Biotechnol. 24 (1), 79-88 (2006).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Murashige, T., Skoog, F. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiol Plant. 15 (3), 473-497 (1962).
- Baum, G., Long, J. C., Jenkins, G. I., Trewavas, A. J. Stimulation of the blue light phototropic receptor NPH1 causes a transient increase in cytosolic Ca2+. Proc Natl Acad Sci USA. 96 (23), 13554-13559 (1999).
- Johnson, C. H. Circadian oscillations of cytosolic and chloroplastic free calcium in plants. Science. 269 (5232), 1863-1865 (1995).
- Johnson, C. H. Circadian oscillations of cytosolic and chloroplastic free calcium in transgenic luminous plants. Plant Physiol. 114 (3), 1408-1408 (1997).
- Harada, A., Shimazaki, K. I. Phototropins and blue light-dependent calcium signaling in higher plants. Photochem. Photobiol. 83 (1), 102-111 (2007).
- Plieth, C., Hansen, U. P., Knight, H., Knight, M. R. Temperature sensing by plants: the primary characteristics of signal perception and calcium response. Plant J. 18 (5), 491-497 (1999).
- Meyerhoff, O., et al. AtGLR3.4, a glutamate receptor channel-like gene is sensitive to touch and cold. Planta. 222 (3), 418-427 (2005).
- Knight, M. R., Campbell, A. K., Smith, S. M., Trewavas, A. J. Transgenic plant aequorin reports the effects of touch and cold-shock and elicitors on cytoplasmic calcium. Nature. 352 (6335), 524-526 (1991).
- Legue, V. Cytoplasmic free Ca2+ in Arabidopsis roots changes in response to touch but not gravity. Plant Physiol. 114 (3), 789-800 (1997).
- Koo, A. J. K., Gao, X. L., Jones, A. D., Howe, G. A. A rapid wound signal activates the systemic synthesis of bioactive jasmonates in Arabidopsis. Plant J. 59 (6), 974-986 (2009).
- Mousavi, S. A., Chauvin, A., Pascaud, F., Kellenberger, S., Farmer, E. E. GLUTAMATE RECEPTOR-LIKE genes mediate leaf-to-leaf wound signalling. Nature. 500 (7463), 422-426 (2013).
- Kirchner, S. M., Doring, T. F., Saucke, H. Evidence for trichromacy in the green peach aphid, Myzus persicae (Sulz.) (Hemiptera : Aphididae). J Insect Physiol. 51 (11), 1255-1260 (2005).
- Prince, D. C., Drurey, C., Zipfel, C., Hogenhout, S. A. The leucine-rich repeat receptor-like kinase BRASSINOSTEROID INSENSITIVE1-ASSOCIATED KINASE1 and the cytochrome P450 PHYTOALEXIN DEFICIENT3 contribute to innate immunity to aphids in Arabidopsis. Plant Physiol. 164 (4), 2207-2219 (2014).
- Chaudhary, R., Atamian, H. S., Shen, Z. X., Brigg, S. P., Kaloshian, I. GroEL from the endosymbiont Buchnera aphidicola betrays the aphid by triggering plant defense. Proc Natl Acad Sci USA. 111 (24), 8919-8924 (2014).
