Summary
Denne protokol beskriver en simpel metode til at analysere calciumsignaler i planter genereret ved at fodre hemipteran insekter såsom bladlus. Arabidopsis thaliana omdannet med normal god landbrugspraksis calcium biosensor GCaMP3 giver mulighed for real-time i vivo billeddannelse af calcium dynamics med en høj tidsmæssige og rumlige opløsning.
Abstract
Calciumioner er forudsagt til at være vigtig signalfunktion enheder under biotiske interaktioner med calcium signalering danner en etableret del af planten forsvar svar mikrobielle elicitors og sårede forårsaget af tygge insekter, fremkalde systemisk calcium signaler i planter. Rollen af calcium i vivo under biotiske stress er imidlertid stadig uklart. Denne protokol beskriver brugen af en genetisk kodet calcium sensor at opdage calciumsignaler i planter under fodring af en hemipteran pest. Hemipterans såsom bladlus gennembore et lille antal celler med specialiserede, aflange sucking mouthparts, hvilket gør dem ideelle værktøj til at studere calcium dynamics, når en plante er konfronteret med en biotiske stress, som adskiller sig fra en såret svar. Derudover revolutionerer fluorescerende biosensorer måling af signalering molekyler i vivo i både dyr og planter. Udtryk for en normal god landbrugspraksis-baserede calcium biosensor, GCaMP3, i model planten Arabidopsis thaliana giver mulighed for real-time imaging af plante calcium dynamics under insekt fodring, med en høj rumlige og tidsmæssige opløsning. En gentagelig og robust assay er blevet udviklet ved hjælp af Fluorescens mikroskopi af fritliggende GCaMP3 blade, giver mulighed for kontinuerlig måling af cytosole calcium dynamics før, under og efter insekt fodring. Dette afslører en stærkt lokaliseret hurtige calcium elevation omkring bladlus fodring site, der forekommer inden for et par minutter. Protokollen kan tilpasses andre biotiske understreger, som yderligere insektarter, mens brugen af Arabidopsis thaliana giver mulighed for den hurtige generation af mutanter at lette den Molekylær analyse af fænomenet.
Introduction
Calcium (Ca2 +) er en af de mest allestedsnærværende signaling elementer i planter. En forbigående stigning i cytosole Ca2 + koncentration ([Ca2 +]cyt) afkodes af et komplekst netværk af downstream komponenter og er involveret i svaret til begge abiotiske og biotiske understreger1,2. En stigning i [Ca2 +]cyt er en af de første svar til mikrobielle elicitors, danner en fælles del af planten forsvar svar3,4,5. Stigninger i [Ca2 +]cyt er også blevet observeret i svar på såret forårsaget af tygge insekter, såsom lepidopterans6,7. Men den potentielle rolle, plante Ca2 + -signaler i svar til live biotiske trusler, der forårsager skader på kun et par celler ikke er blevet undersøgt. Den grønne fersken bladlus Myzus persicae er en hemipteran insekt, der repræsenterer en væsentlig trussel mod verdens landbrug8,9, og Ca2 + efflux fra det ekstracellulære rum er blevet observeret i blade befængt med M. persicae10. Denne protokol beskriver en robust og repeterbare metode til måling af plante Ca2 + -signaler mens M. persicae feed fra blade med en fluorescerende Ca2 + biosensor, med både bladlus og GCaMP3 tilbyder nye værktøjer til at dissekere rolle af Ca2 + under biotiske interaktioner.
Ca2 +-selektive microelectrodes blev tidligere brugt til at måle [Ca2 +] i planter11,12. For nylig, en bioluminescerende og fluorescerende tilgange er blevet standardiseret. Disse biosensorer binde Ca2 + og udsender lys, gør det muligt for un-paralleled muligheder for at studere Ca2 + dynamics i både celler og hele væv. Ca2 + biosensorer kan injiceres som farvestoffer eller stabilt produceret efter indførelsen af biosensor kodende sekvens i genomet af organismen via transformation (dvs., genetisk kodet biosensorer). Sidstnævnte tilbyder de store fordele ved at være let udtrykt i levende væv og i stand til at subcellulært lokalisering13. Aequorin protein, isoleret fra Aequorea victoria (vandmænd) var den første genetisk kodet Ca2 + biosensor indsat i planter14. Som en en bioluminescerende protein kræver aequorin ikke excitation af ekstern lys, som undgår farvelegeme blegning og autofluorescence15. Aequorin held har været anvendt til at måle [Ca2 +] strømme i respons på forskellige stimuli, herunder temperatur16, patogener17,18,19, salt stress20 ,21, og såret7. Dog er det ugunstigt på grund af den relativt lavt signal intensitet, gør påvisning af [Ca2 +] strømme i enkelte celler og væv med dårlig sensor udtryk vanskeligt13.
Udviklingen af Ca2 + biosensorer, som kan fluorescerer har suppleret aequorin med mulighed for detaljeret subcellulært og væv-niveau analyse af Ca2 + dynamics. En af de mest almindelige fluorescerende biosensorer er fluorescens resonans energioverførsel (FRET)-baseret kamæleoner. FRET kamæleoner er sammensat af to proteiner, typisk FFP og YFP, som er bragt i tæt kontakt med den konformationelle ændring induceret af bindingen af Ca2 + et calmodulin domæne i fælles fiskeripolitik-YFP linker region. Denne kontakt giver mulighed for overførsel af energi fra den fælles fiskeripolitik til YFP, og den deraf følgende ændring i fluorescens af disse fluorophores giver mulighed for nøjagtig kvantificering af [Ca2 +] gennem beregning af forholdet mellem fluorescens signaler fra to fluorophores22. FRET kamæleoner er overlegen i forhold til aequorin og ikke-ratiometric fluorescerende farvestoffer, da de er mindre berørt af udtryk niveau af protein23 og har ofte et større fluorescerende udbytte, giver mulighed for cellulært og subcellulært imaging23. For eksempel, har FRET kamæleoner for nylig anvendt til at identificere langdistance Ca2 + signaler i planter og løse disse til det cellulære niveau24,25,26.
En nylig gennembrud med fluorescerende normal god landbrugspraksis-baserede Ca2 + biosensorer har været udviklingen af meget følsomme single-fluorophore (single-FP) biosensorer. Single-FP biosensorer består af en enkelt cirkulært permutated normal god landbrugspraksis knyttet til en calmodulin og M13 peptid, med Ca2 + bindende til calmodulin, hvilket resulterer i en vand-medieret reaktion mellem calmodulin og normal god landbrugspraksis så protonate normal god landbrugspraksis og stigning fluorescerende udbytte27,28,29. Single-FP sensorer tilbyder flere fordele over FRET kamæleoner, herunder enklere eksperimentelle design og en potentielt højere tidsmæssige opløsning af imaging30. Selv om single-FP sensorer kan kvantificere absolut [Ca2 +] så enkelt som FRET sensorer, de er overlegne for analysen af den tidsmæssige og rumlige dynamik af Ca2 + -signaler5,23. GCaMPs er en af de best-established single-FP sensorer28 og har undergået flere revisioner for at forbedre deres fluorescerende udbytte, dynamikområde, Ca2 + affinitet og signal / støj forhold31,32 , 33 , 34. the GCaMPs har været med succes brugt i animalsk systemer, såsom zebrafisk motoriske neuroner35 og frugt flyve neuromuskulære vejkryds34. Tilfældig mutagenese af GCaMP3 har resulteret i yderligere klasser af single-FP sensorer, herunder de ultrasensitive GCaMP636 og GECOs29. GECOs blev for nylig brugt i Arabidopsis thaliana (herefter benævnt Arabidopsis) til at måle Ca2 + strømme i reaktion på ATP, chitin og bakterielle elicitor flg22. Denne undersøgelse viste også, at R-GECO biosensor udkonkurreret FRET Cameleon YC3.6 med hensyn til maksimal signal forandringer og signal / støj forholdet5.
På grund af brugervenlighed, fluorescerende højtydende, og høj tidsmæssige opløsning, der kan opnås med GCaMP biosensorer, var GCaMP3 genetisk kodet i Arabidopsis blomkålsmosaikvirus 35S promotor. De genetiske værktøjer til rådighed for Arabidopsis forskning giver mulighed for en detaljeret Molekylær analyse af Ca2 + signaler målt ved GCaMP3. Derudover kan GCaMP3 biosensor visualiseres under et fluorescens mikroskop i stedet for en dyrere Konfokal system. Denne protokol giver mulighed for hele-væv imaging, afgørende, når gennemføre eksperimenter med levende biotiske understreger. Forsøget er designet sådan at fritliggende blade fra 35S::GCaMP3 planter er flød i vand, til at forhindre insekt flugt og begrænse fodring af en specifik væv. Metoden beskrevet i denne hvidbog derfor giver mulighed for analyse af bladet Ca2 + dynamics under fodring af M. persicae, hvilket resulterer i en karakterisering af en roman plante signalering svar. Denne metode kan også tilpasses til at arbejde med andre biotiske understreger, som yderligere insektarter og mikrobielle patogener, og med andre plantevæv, såsom rødder.
Protocol
1. plante forberedelse (dage 1 - 4)
- på dag 1, sterilisere 35S::GCaMP frø ved hjælp af tre 75% ethanol vasker, 1 min. pr. vask, og pladen dem på 100 mm 2 firkantede plast plader med ¼-styrke Murashige og Skoog (MS) medium (opskrift: 1,1 g af Murashige og Skoog medium, 7,5 g saccharose, 10 g Formedium agar, og 1 L afioniseret vand) 37.
- Stratificere stiklinger i mørke i tre dage ved 8 ° C til indhente synkron spiring.
- På dag 4 af eksperimentet, flytte GCaMP planter til en kontrolleret miljø værelse (CER) ved 23 ° C, med en 16 h lys og 8 h mørke lysperiode.
2. Insekt Rearing (dage 11 - 12)
- dag 11 i eksperimentet, tilføje 15 voksne M. persicae til 5 uger gamle jord-vokset Arabidopsis planter ved hjælp af en fugtig kunstner ' s pensel (størrelse 2 eller 4) (dyrkes i en CER ved 22 ° C med 10 h lys og 14 h mørke photoperio d).
- bur bladlus på anlægget ved at placere klare plastslanger (10 cm x 15 cm) rundt i anlægget og cap med et plastlåg.
- Forlade bladlus angrebne planter i 24 timer i en CER ved 22 ° C med en 16-h lys og 8-h mørke lysperiode.
- På dag 12 i eksperimentet, fjerne alle voksne M. persicae ved hjælp af et paintbrush.
Bemærk: Insekter kan ses med det blotte øje på anlægget. Dette giver en befolkning af nymfer med en lignende udviklingsmæssige alder. Omtrent 1 nymfe pr. voksen vil blive produceret i denne periode. - Forlade de angrebne planter i en lavere temperatur CER ved 16 ° C, med en 8-timers lys og 16 h mørke lysperiode, at forhindre nymfer i alt for hastigt stigende i størrelse.
3. Blad Detachment (dag 19)
- på dag 19 med eksperimentet, fjerne 35S::GCaMP3 stiklinger fra CER og løsrive den største blad fra hver plante ved hjælp af en skarp saks.
- Med en pincet, placere den fritliggende blad i brønden af en 96-brønd plade der indeholder 300 µL destilleret vand, abaxial overflade vender opad. Gentag for ekstra blade ( figur 1).
figur 1: 35S::GCaMP3 blad Assay. De største blade fra hver 16 dage gamle 35S::GCaMP3 Arabidopsis sætteplante er frakoblet og flød på 300 µL af destilleret vand i en 96-brønd plade. Foto taget af dagen efter udstationering. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
- dække plade i klar plast wrap og aluminiumsfolie og lade ved stuetemperatur overnight at tillade stress af udstationering at stilne.
4. Fluorescens mikroskopi (dage 20 - 22)
- dag 20 i eksperimentet, fjerne den 96-brønd plade fra aluminiumsfolie og overføre det til et fluorescens stereomikroskop. Konfigurere stereo fluorescens mikroskop at ophidse normal god landbrugspraksis med 450-490 nm lys og optage den fluorescerende emissioner mellem 500 og 550 nm.
- Indsamle alderen bladlus fra kolonien etableret på dag 11 ved at fjerne planten fra jorden og placere det i en gennemsigtig kasse med et låg. Holde de insekter, der er indeholdt i boksen mens eksperimentet.
- Anbring 96-brønds plade under mikroskop. Ændre den lys eksponering, indtil GCaMP3 fluorescens kan visualiseres tydeligt i venerne i de fritliggende blade. Holde eksponeringen konstant for alle eksperimenter; for den nuværende protokol, en 1-s eksponering blev brugt med en gevinst på 3,5 ( figur 2).
- Justere forstørrelse og zoom i mikroskopet, så 4 brønde kan observeres i én ramme; blev anvendt for den nuværende protokol, en 7,8 X Forstørrelse og et fokus på-127.833 mm.
- Overføre én bladlus til et fritliggende blad under mikroskop ved hjælp af en fugtig pensel. Forlade en tilstødende blad ubehandlet kontrol, men at røre let det med pensel til at efterligne den rørende, der opstår under bladlus overførsel. Husk at placere plastikfolie tilbage oven på den 96-brønd plade under mikroskopi til at forhindre insekter i at flygte.
- Begynder fluorescens optagelse af blade i par (1 bladlus-behandlede og 1 ubehandlet) ved at klikke på " start eksperiment " i den indbyggede mikroskop software ( figur 2). Optage målinger til 50 min.
Bemærk: For den nuværende protokol, et tidsinterval på 5 s mellem målinger blev brugt. - Efter 50 min, stoppe optagelsen ved at klikke på " stop eksperimentet " og fjerne bladlus fra bladet. Gemme fluorescens målinger som billedfiler (f.eks. mærket billed filformat, TIFF).
- Gentage forsøget med yderligere par blade; imaging kan udvides til billede 2 par af bladene på én gang, giver mulighed for den samtidige billeddannelse af 2 genotyper.
5. Indsamling
- importere billedfilerne i Fiji (billedet J) og konvertere dem til 32 bit ved at klikke på " Image " > " Type " > " 32-bit; " dette giver mulighed for konvertering af billeder til heatmap videoer (Se trin 7).
- Kassere prøver som ikke har nøjes bladlus på ét sted i mere end 5 min af gennemsyn de insekt bevægelse under mikroskop.
Bemærk: Dette er ofte fleste af prøverne, og op til 100 behandlinger kan være nødvendigt at finde 30 prøver udstiller vellykket afvikling. - Indstille måleskalaen til pixels (eller Konverter til mm, hvis kendt) og tidsrammen til det samme interval som brugte under mikroskopi ved at klikke på " Image " > " egenskaber. "
- Ved hjælp af markøren, placere en region af interesse (ROI) rundt i området af væv for normal god landbrugspraksis analyse.
Bemærk: I den nuværende protokol, en cirkulær ROI 50 pixels (0,65 mm) i diameter blev brugt på 3 steder af interesse: bladlus fodring websted (Fs), en systemisk region på Midtribbe af bladet (Sm) og en systemisk region støder op til Midtribbe (" lateral væv " Sl) ( figur 2).- Opret Investeringsafkastet ved at tegne en oval (brug den " ovalværktøjet "), og redigere størrelse ved hjælp af " redigere " > " udvalg " > " Angiv. " Se figur 2.
- For ubehandlet kontrol, Vælg ROIs i sammenlignelige regioner i bladet til dem valgt på de behandlede blad (dvs. den samme region af bladet som hvor bladlus fodret på de behandlede blad) ( figur 2).
figur 2: analysere GCaMP3 fluorescens Under mikroskop. Venstre: ubehandlet kontrol blad. Højre: bladlus-behandlede blad. Webstedet bladlus fodring er angivet med en pilespids. Skalalinjen = 1 mm. (A) lysfelt billede. Forstørrelse: 7,8 X, fokusere:-127.833 mm, eksponering: 1 s. (B) normal god landbrugspraksis billede showiNG ROIs anvendes til kvantitativ analyse af fluorescens. FS = fodring site, Sm = systemisk Midtribbe, Sl = systemisk laterale væv. Forstørrelse: 7,8 X, fokusere:-127.833 mm, eksponering: 1 s. Normal god landbrugspraksis var ophidset ved hjælp af en 450 til 490 nm metalhalogen lampe, og fluorescerende emissioner var fanget mellem 500 og 550 nm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
- bruger tid serien Analyzer plugin ved at klikke på " Plugins " > " tid serien Analyzer " til at analysere rå fluorescens værdier (F) i ROI over tid. Tilføje ROI af interesse (" Tilføj [t] "). Og sørg for, at Investeringsafkastet er markeret, Vælg " få gennemsnitlige; " dette vil vise en tabel med F værdier for hver ramme i denne ROI.
- Kopiere disse data i et regneark.
- Beregne område af fodring site signalet ved først at vælge region ved hjælp af den " freehand udvælgelse værktøj. " skitsere den maksimal normal god landbrugspraksis signal og derefter beregne området i denne form ved at klikke på " analyser " > " foranstaltning. "
- Beregne hastigheden af fodring site signalet ved hjælp af MTrackJ plugin ved at klikke på " Plugins " > " sporing " > " MTrackJ. "
- Klik på den " Tilføj " knappen og derefter klikke på markøren i midten af signal når det først er synlige. Klik igen på kanten af signal på sin fjerneste punkt spredes. Klik på " foranstaltning " til at beregne hastigheden af signalet.
6. Dataanalyse
- Definer punktet af bladlus afregning ved at spille gennem billedrammer fra mikroskop i Fiji.
Bemærk: Ved afregning er rammen hvorunder bladlus forbliver på ét sted i 5 min eller mere. Varigheden af afregning begivenheder kan også beregnes ud fra billederne i Fiji. - Normalisere F data (ΔF/F) efter ligningen ΔF/F = (F - F 0) f 0, hvor F 0 er den gennemsnitlige baseline Fluorescens beregnet ud fra gennemsnittet af F over de første 60 rammens af optagelse før bladlus afgjort. Gentag for ubehandlet kontrol.
- Plot de normaliserede normal god landbrugspraksis fluorescens (ΔF/F) over tid for at ROI i den behandlede og ubehandlede blad. Kassere prøver (begge blade), hvis ubehandlet kontrol viser store Ca 2 + transienter (dvs. ΔF/F stiger over 0,2).
- Gentag indtil mindst 20-30 levedygtige prøver er blevet analyseret pr. genotype.
7. Tidsforløb Video skabelse
- konvertere 32-bit-billedfiler i heatmaps ved hjælp af NucMed_Image LUTs plugin ved at klikke på " Plugins " > " NucMed " > " opslag tabeller. " opslag tabeller menu, Vælg " blå grøn rød " at konvertere billeder til varme kort.
- Forbedre kontrasten af heatmap at fremhæve den bladlus-fremkaldte normal god landbrugspraksis signaler ved hjælp af " proces " > " forbedre kontrast " > " justere mættede pixels %. "
- Tilføj tidsoplysninger ved hjælp af tid Stamper plugin ved at klikke på " Plugins " > " tid Stamper ". Angiv den " starttidspunkt " på " 0 " og den " interval " baseret på det tidsinterval, der er brugt til mikroskopi (f.eks. 5 s).
- Eksportere denne video som en audio-video interleaved (AVI) fil.
Bemærk: Denne video kan derefter redigeres yderligere i andre softwarepakker (f.eks Microsoft Movie Maker).
Representative Results
Figur 3 og figur 4 er repræsentant resultater fra et forsøg sammenligne en bladlus-behandlede blad med en ubehandlet kontrolkultur. En meget lokaliserede stigning i normal god landbrugspraksis fluorescens ses omkring fodring stedet inden for et par minutter i fleste af prøverne, mens Ca2 + dynamikken i ubehandlet kontrol blad ophold relativt stabil (figur 3A og 3B). Det er også muligt at observere sekundære stigninger i normal god landbrugspraksis fluorescens efter den første højdepunkt i nogle eksperimenter (figur 3B). I op til 50% af behandlede blade, bladlus at nøjes ikke og prøverne skal kasseres. Af prøverne i hvilken afregning sker, udviser 27% af prøverne ikke tydelige stigninger i normal god landbrugspraksis fluorescens omkring fodring stedet (figur 3 c og tabel 1); Derfor bør i være gennemsnit 25-30 Kontraprøverne, der udtages til kvantitativ analyse. Visualisering af området og hastighed af fodring websted [Ca2 +]cyt elevation skal afsløre et signal på omkring 110 µm rejser på 6 µm/s (tabel 1). Derudover bør ingen [Ca2 +]cyt stigninger påvises systemisk inden for bladet på bladlus behandling, enten i den systemiske Midtribbe (figur 4A) eller systemisk laterale væv regioner (figur 4B). Et repræsentativt udsnit af [Ca2 +]cyt dynamics over tid er vist i Video 1. Det er også muligt at analysere bladlus bilægge adfærd ved at spore antallet og varigheden af individuelle bilægge begivenheder under mikroskop. Repræsentative resultater for disse adfærdsmønstre er vist i tabel 1, viser, at bladlus tage omkring 10 min før afvikling, og når de har nøjes med succes, det holder i 20 min. i gennemsnit. Insekter udlignes derfor i et enkelt sted for helhed af [Ca2 +]cyt elevation.
Figur 3: GCaMP3 kan bruges til at registrere bladlus-fremkaldte Ca2 + signaler på webstedet fodring i fritliggende blade. Venstre: repræsentative spor (n = 30) af normaliserede normal god landbrugspraksis fluorescens (ΔF/F) omkring fodring stedet som et 35S::GCaMP3 blad. Sporene vise 5 min før afvikling indtil 25 min post afregning. Kontrol = tilsvarende placering på en ubehandlet 35S::GCaMP3 blad. Højre: repræsentative stereomikroskopet billede af [Ca2 +]cyt elevation set omkring en bladlus fodring websted på et 35S::GCaMP3 blad. Normal god landbrugspraksis Fluorescens er farvekodet efter inset skala. Bladlus id skitseret i hvid og fodring siden angivet med en pilespids. Forstørrelse: 7,8 X, fokusere:-127.833 mm, eksponering: 1 s. Normal god landbrugspraksis var ophidset ved hjælp af en 450 til 490 nm metalhalogen lampe, og den fluorescerende emissioner var fanget mellem 500 og 550 nm. (A) et eksempel på en stor bladlus-induceret [Ca2 +]cyt elevation. (B) et eksempel på gennemsnitligt bladlus-induceret [Ca2 +]cyt elevation. (C) et eksempel på ingen bladlus-induceret [Ca2 +]cyt elevation. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Parameter | Gennemsnitlig (± SEM) |
| [Ca2 +] Cyt elevation | |
| Procentdel af prøverne viser en [Ca2 +]cyt elevation | 73% |
| Hastigheden af bølge foran en | 5.9 µm/s (± 0,6) |
| Maksimale areal af spredning | 110 µm2 (± 18) |
| Bladlus adfærd | |
| Antallet af afregner (> 5 min) | 2 (± 0,1) |
| Samlede antal afregner (alle varigheder) | 3.8 (± 0,4) |
| Gang nøjedes med imaging b | 20 min (± 2) |
| Tid indtil første settle c | 11 min (± 1.4) |
| Procentdel af samlede tidsforbrug afgjort | 62% (± 3) |
Tabel 1: [Ca2 +]cyt Elevation og bladlus funktionsparametre under 35S::GCaMP3 Imaging. Parametre beregnes fra levedygtige prøver i hvilken afregning af > 5 min opstod. (A) hastighed af den synlige signal med udgangspunkt i indledningen til den længst punkt af spredning. (B) varigheden af de indledende bilægge begivenheder anvendes til analyse af fluorescens. (C) længden af tid mellem begyndelsen af imaging og de første bladlus nøjes. [Ca2 +] Cyt højdedata tidligere indsendt til The plante celle (aktuelle status: indledende QC).
Figur 4: GCaMP3 kan ikke registrere bladlus-fremkaldte Ca2 + signaler systemisk til webstedet fodring. Repræsentative spor (n = 30) af normaliserede normal god landbrugspraksis fluorescens (ΔF/F) steder systemisk til bladlus fodring site i 35S::GCaMP3 efterlader. Sporene vise 5 min før afvikling indtil 25 min post afregning. Kontrol = tilsvarende placering på en ubehandlet 35S::GCaMP3 blad. (A) ΔF/F i regionen systemisk Midtribbe. (B) ΔF/F i regionen systemisk laterale væv. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Video 1: GCaMP3 fluorescens Over tid som en bladlus Feeds. Normal god landbrugspraksis Fluorescens er farvekodet efter inset skala. Placeringen af webstedet bladlus fodring er angivet med en pilespids. Venstre: 35S::GCaMP3 blad udsat for en M. persicae voksen. Højre: Et 35S::GCaMP3 no-bladlus kontrol blad. Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente.)
Discussion
Metoden beskrevet i denne hvidbog giver mulighed for tidstro analyse af planten Ca2 + signalering under en biotiske stress såsom insekt fodring. Det viser, at en af de første anlæg svar på sådanne trusler er en lokaliseret [Ca2 +]cyt elevation omkring fodring stedet af insektet. Ved hjælp af mutanter, denne metode vil give mulighed den molekylære og fysiologiske karakterisering af sådanne signaler, som ikke var tidligere muligt. Et afgørende skridt i denne protokol er at sikre at de fritliggende blade ikke overdrevent forstyrret under udstationering processen (trin 3.2) eller når du overfører insekter til blade (trin 4.5). Da den nuværende protokol giver en relativ måling af [Ca2 +]cyt snarere end en absolut koncentration, er det afgørende, at indstillingerne mikroskop holdes konstant gennem hele eksperimentet. Der er også potentiale for menneskelige bias under udvælgelsen af ROIs og analyse af data, og som sådan, det anbefales, at forsøgene er udført dobbelt-blind.
Der er flere betydelige fordele ved at måle [Ca2 +]cyt under biotiske stress med denne protokol. Først giver brugen af en enkelt fluorophore med en fluorescerende højtydende billeddannelse skal gennemføres på et stereomikroskop, som er billigere end ved hjælp af en Konfokal mikroskop. Brug af en enkelt fluorophore gør også dataindsamling og analyse simple, da der er bare én måling at optage. Desuden brug af et stereomikroskop giver mulighed for billeddannelse af hele blade, der er afgørende, eftersom mange biotiske interaktioner, herunder plante-bladlus interaktioner, forekommer på en stor rumlig skala. Den høje tidsmæssige opløsning af image capture muligt med GCaMP3, baseret på den hurtige afstandtagen af Ca2 + fra sensoren efter bindende23,30 og de fluorescerende højtydende, giver mulighed for målinger skal tages op til hver 5 s. Derudover forhindrer blad assay udslip af insekt, en nøgle begrænsning skridt til at gennemføre sådanne eksperimenter på hele planter (under forberedelse). Fritliggende bladene også sikre at insektet feeds fra en pre-definerede placering, giver mulighed for analyse af Ca2 + dynamics før, under og efter fodring. Denne protokol sikrer også, at bladene af lignende udviklingsstadier bruges til analyse.
Den største ulempe ved denne protokol stammer fra brugen af en ikke-ratiometric biosensor. Med single-FP biosensorer, kan variation i normal god landbrugspraksis emission skyldes eksperimentel variabler end [Ca2 +]cyt, såsom ændringer i cellulære pH, motion eller udtryk niveau af biosensor. Disse spørgsmål er ikke stødt med FRET kamæleoner under FRET, da overførsel af energi fra den fælles fiskeripolitik til YFP kun sker ved Ca2 + bindende. Andre forhold, der ændrer fluorescerende egenskaberne for de individuelle fluorophores er usandsynligt, at efterligne de modsatrettede ændringer i intensiteten af den fælles fiskeripolitik og YFP, og den ratiometric beregning, der bruges i sagens natur normaliserer målinger for mange af disse andre optiske artefakter23,30. Dette gør skøn over absolut [Ca2 +]cyt mere pålidelige med FRET kamæleoner. Derfor er GCaMP3 bedst brugt som en biosensor til at måle relative [Ca2 +]cyt, selvom det er stadig tilstrækkeligt til at påvise og karakterisere biologiske fænomener i planter5,(in preparation). Derfor er det vigtigt at bruge kontrolelementer til at vise, at den observerede effekt er på grund af Ca2 +, herunder Ca2 +-relaterede genetiske mutanter(under forberedelse) eller farmakologiske Ca2 + -kanal hæmmere såsom La3 + . Vigtigere, viser single-FP biosensorer typisk en større fluorescerende udbytte og større dynamikområde (dvs. en stigning i fluorescens ved Ca2 + bindende) end FRET kamæleoner23, hvilket gør GCaMP mere velegnet til væv-niveau imaging, mens FRET kamæleoner er et nyttigt værktøj for cellulære imaging med en Konfokal mikroskop5,25.
Under udførelsen af denne protokol er det muligt, at nogle spørgsmål vil opstå der kræver fejlfinding. Eksempelvis anbefales det, at prøver, hvor kontrol (ubehandlet) blade viser store [Ca2 +]cyt stigninger er kasseret (trin 6.3). Disse transienter er sandsynligvis resultatet af stress induceret af mikroskopi. Faktisk, blå lys er kendt for at fremkalde Ca2 + signaler38,39,40,41, og høj intensitet lys kan også resultere i temperatur og osmotisk understreger, som begge også fremkalde [Ca2 +]cyt højder21,25,42. For at reducere sådanne understreger, er det derfor vigtigt at foretage eksperiment i et godt ventileret og temperatur-kontrolleret rum og undgå unødigt lange eksponeringstider. Det er også vigtigt at ikke forstyrre bladene overdrevent under udstationering eller under mikroskopi til at forhindre touch-fremkaldte [Ca2 +]cyt stigninger43,44,45. Spørgsmål kan også opstå med insekt afregning. Med M. persicae, har insekter ikke nøjes med på bladene i flere prøver. Dette kunne være et resultat af sår-fremkaldte forsvar i fritliggende blade46,47, eller forstyrrelse af insekter af det blå lys. Faktisk, vision i M. persicae er reguleret af tre fotoreceptorer, herunder en med et peak følsomhed på 490 nm48. Reducere mikroskopi eksponering og håndtering af bladlus med pleje kan reducere angst og fremme afregning.
Den protokol, der er skitseret i den nuværende papir giver ny indsigt på molekylær forståelse af plante-insekt interaktioner og plante svar til biotiske stress. Det giver mulighed for visualisering af en af de første anlæg svar til insekt fodring og letter yderligere undersøgelser ved hjælp af de betydelige Arabidopsis genetiske ressourcer til rådighed. Derudover denne protokol giver mulighed for brug af levende organismer, i modsætning til ekstrakter49 eller elicitors50. I fremtiden, kan denne teknik anvendes til andre biotiske understreger, som yderligere insektarter, nematoder eller mikrobielle patogener, samt til abiotiske understreger. GCaMP3 mikroskopi kan også ændres til billede andet plantevæv, alternative ROIs på blad, eller endda hele planter. Desuden er der potentiale for biosensor være genetiskely kodet i yderligere plantearter. Derfor, den protokol, der er skitseret i dette papir har potentiale til at undercover det molekylære grundlag af Ca2 + signalering i en række roman biotiske interaktioner mellem planter og andre arter.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at erklære.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Grant Calder (John Innes centrum, U.K.) for den rådgivning vedrørende mikroskopi. Forfatterne også gerne takke John Innes centrum gartneri og entomologi afdelinger for deres bistand. Dette arbejde blev støttet af en PhD studentship fra John Innes Foundation (T.V.), give JJ004561-B-1 fra BBSRC og John Innes Foundation (T.V., M.A., J.C., S.M., S.H., TM og DS), et år i industriens placering fra John Innes centrum (M.A.) , en sommer studentship fra biokemiske Society UK (JC), JST PRESTO (MT) og tilskud MCB 1329723 og IOS-1557899 fra National Science Foundation (MT og S.G.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35S::GCaMP3 Arabidopsis | John Innes Centre/Universty of Wisconsin | - | Step 1.1 |
| 100 mm2 square plastic plates | R & L Slaughter Ltd, Upminster, UK | For growing GCaMP plants (Step 1.1) | |
| ¼ strength Murashige and Skoog (MS) medium | homemade: 1.1 g Murashige and Skoog medium, 7.5 g sucrose, 10 g Formedium agar, 1 L de-ionised water | - | For growing GCaMP plants (Step 1.1) |
| Col-0 Arabidopsis | - | - | For growing aged aphid colony (Step 2.1) |
| Myzus persicae(Sulzer) | clone US1L, Mark Stevens, Brooms Barn | - | Orginally from Rothamsted Research, UK (Step 2.1) |
| Artist's paintbrush size 2 | Hobbycraft | 610101 | To tranfer aphids (Steps 2.1, 2.4 and 4.6) |
| 96-well MicrotitreTM plate | ThermoFisher Scientific | 2101 | To contain the detached GCaMP3 leaves (Step 3.2) |
| Aluminium foil | Wrap Film Systems, Telford, UK | 26B06 | To cover plates with floating leaves overnight (Step 3.3) |
| Clear plastic wrap | SC Johnson & Son, Racine, WI, USA | To cover plates with floating leaves overnight, and to cover leaves during microscopy (Steps 3.3 and 4.7) | |
| M205FA stereo microscope | Leica Microsystems | - | For GFP imaging (Step 4.1) |
| Leica Application Suite v3.2.0 | Leica Microsystems | Microscope software (Step 4.1) | |
| Fiji (Image J) v1.48a | National Institutes of Health, USA) | - | For image analysis (Step 6.1) |
References
- Sanders, D., Pelloux, J., Brownlee, C., Harper, J. F. Calcium at the crossroads of signaling. Plant Cell. 14, S401-S417 (2002).
- Dodd, A. N., Kudla, J., Sanders, D. The language of calcium signaling. Annu Rev Plant Biol. 61, 593-620 (2010).
- Blume, B., Nurnberger, T., Nass, N., Scheel, D. Receptor-mediated increase in cytoplasmic free calcium required for activation of pathogen defense in parsley. Plant Cell. 12 (8), 1425-1440 (2000).
- Lecourieux, D. Proteinaceous and oligosaccharidic elicitors induce different calcium signatures in the nucleus of tobacco cells. Cell Calcium. 38 (6), 527-538 (2005).
- Keinath, N. F., et al. Live cell imaging with R-GECO1 sheds light on flg22- and chitin-induced transient [Ca2+]cyt patterns in Arabidopsis. Mol Plant. 8 (8), 1188-1200 (2015).
- Verrillo, F., Occhipinti, A., Kanchiswamy, C. N., Maffei, M. E. Quantitative analysis of herbivore-induced cytosolic calcium by using a cameleon (YC 3.6) calcium sensor in Arabidopsis thaliana. J Plant Physiol. 171 (2), 136-139 (2014).
- Kiep, V. Systemic cytosolic Ca(2+) elevation is activated upon wounding and herbivory in Arabidopsis. New Phytol. 207 (4), 996-1004 (2015).
- Blackman, R. L., Eastop, V. F. Aphids on the world's crops: an identification and information guide. , John Wiley & Sons, Ltd. (2000).
- Ng, J. C. K., Perry, K. L. Transmission of plant viruses by aphid vectors. Mol Plant Pathol. 5 (5), 505-511 (2004).
- Ren, G. W., Wang, X. F., Chen, D., Wang, X. W., Liu, X. D. Effects of aphids Myzus persicae on the changes of Ca2+ and H2O2 flux and enzyme activities in tobacco. J Plant Interact. 9 (1), 883-888 (2014).
- Brownlee, C., Wood, J. W. A gradient of cytoplasmic free calcium in growing rhizoid cells of fucus-serratus. Nature. 320 (6063), 624-626 (1986).
- Miller, A. J., Sanders, D. Depletion of cytosolic free calcium induced by photosynthesis. Nature. 326 (6111), 397-400 (1987).
- Kanchiswamy, C. N., Malnoy, M., Occhipinti, A., Maffei, M. E. Calcium imaging perspectives in plants. Int J Mol Sci. 15 (3), 3842-3859 (2014).
- Ridgway, E. B., Ashley, C. C. Calcium transients in single muscle fibers. Biochem Biophys Res Commun. 29 (2), 229 (1967).
- Plieth, C. Plant calcium signaling and monitoring: pros and cons and recent experimental approaches. Protoplasma. 218 (1-2), 1-23 (2001).
- Campbell, A. K., Trewavas, A. J., Knight, M. R. Calcium imaging shows differential sensitivity to cooling and communication in luminous transgenic plants. Cell Calcium. 19 (3), 211-218 (1996).
- Mithofer, A., Mazars, C. Aequorin-based measurements of intracellular Ca2+-signatures in plant cells. Biol Proced Online. 4 (1), 105-118 (2002).
- Kwaaitaal, M., Huisman, R., Maintz, J., Reinstadler, A., Panstruga, R. Ionotropic glutamate receptor (iGluR)-like channels mediate MAMP-induced calcium influx in Arabidopsis thaliana. Biochem J. 440 (3), 355-365 (2011).
- Ranf, S., Eschen-Lippold, L., Pecher, P., Lee, J., Scheel, D. Interplay between calcium signalling and early signalling elements during defence responses to microbe- or damage-associated molecular patterns. Plant J. 68 (1), 100-113 (2011).
- Zhu, X. H., Feng, Y., Liang, G. M., Liu, N., Zhu, J. K. Aequorin-based luminescence imaging reveals stimulus- and tissue-specific Ca2+ dynamics in Arabidopsis plants. Mol Plant. 6 (2), 444-455 (2013).
- Kiegle, E., Moore, C. A., Haseloff, J., Tester, M. A., Knight, M. R. Cell-type-specific calcium responses to drought, salt and cold in the Arabidopsis root. Plant J. 23 (2), 267-278 (2000).
- Miyawaki, A., et al. Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. Nature. 388 (6645), 882-887 (1997).
- Koldenkova, V. P., Nagai, T. Genetically encoded Ca2+ indicators: properties and evaluation. BBA Mol Cell Res. 1833 (7), 1787-1797 (2013).
- Choi, J. Identification of a plant receptor for extracellular ATP. Science. 343 (6168), 290-294 (2014).
- Choi, W. G., Toyota, M., Kim, S. H., Hilleary, R., Gilroy, S. Salt stress-induced Ca2+ waves are associated with rapid, long-distance root-to-shoot signaling in plants. Proc Natl Acad Sci USA. 111 (17), 6497-6502 (2014).
- Evans, M. J., Choi, W. G., Gilroy, S., Morris, R. J. A ROS-assisted calcium wave dependent on atrbohd and tpc1 propagates the systemic response to salt stress in Arabidopsis roots. Plant Physiol. 171 (3), 1771-1784 (2016).
- Nagai, T., Sawano, A., Park, E. S., Miyawaki, A. Circularly permuted green fluorescent proteins engineered to sense Ca2+. P Natl Acad Sci USA. 98 (6), 3197-3202 (2001).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nat Biotechnol. 19 (2), 137-141 (2001).
- Akerboom, J., et al. Crystal structures of the GCaMP calcium sensor reveal the mechanism of fluorescence signal change and aid rational design. J Biol Chem. 284 (10), 6455-6464 (2009).
- Okumoto, S. Quantitative imaging using genetically encoded sensors for small molecules in plants. Plant J. 70 (1), 108-117 (2012).
- Ohkura, M., Matsuzaki, M., Kasai, H., Imoto, K., Nakai, J. Genetically encoded bright Ca2+ probe applicable for dynamic Ca2+ imaging of dendritic spines. Anal Chem. 77 (18), 5861-5869 (2005).
- Tallini, Y. N. Imaging cellular signals in the heart in vivo: cardiac expression of the high-signal Ca2+ indicator GCaMP2. Proc Natl Acad Sci USA. 103 (12), 4753-4758 (2006).
- Tian, L. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. J Neurosci. 32 (40), 13819-13840 (2012).
- Pedelacq, J. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein. Nat Biotechnol. 24 (1), 79-88 (2006).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Murashige, T., Skoog, F. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiol Plant. 15 (3), 473-497 (1962).
- Baum, G., Long, J. C., Jenkins, G. I., Trewavas, A. J. Stimulation of the blue light phototropic receptor NPH1 causes a transient increase in cytosolic Ca2+. Proc Natl Acad Sci USA. 96 (23), 13554-13559 (1999).
- Johnson, C. H. Circadian oscillations of cytosolic and chloroplastic free calcium in plants. Science. 269 (5232), 1863-1865 (1995).
- Johnson, C. H. Circadian oscillations of cytosolic and chloroplastic free calcium in transgenic luminous plants. Plant Physiol. 114 (3), 1408-1408 (1997).
- Harada, A., Shimazaki, K. I. Phototropins and blue light-dependent calcium signaling in higher plants. Photochem. Photobiol. 83 (1), 102-111 (2007).
- Plieth, C., Hansen, U. P., Knight, H., Knight, M. R. Temperature sensing by plants: the primary characteristics of signal perception and calcium response. Plant J. 18 (5), 491-497 (1999).
- Meyerhoff, O., et al. AtGLR3.4, a glutamate receptor channel-like gene is sensitive to touch and cold. Planta. 222 (3), 418-427 (2005).
- Knight, M. R., Campbell, A. K., Smith, S. M., Trewavas, A. J. Transgenic plant aequorin reports the effects of touch and cold-shock and elicitors on cytoplasmic calcium. Nature. 352 (6335), 524-526 (1991).
- Legue, V. Cytoplasmic free Ca2+ in Arabidopsis roots changes in response to touch but not gravity. Plant Physiol. 114 (3), 789-800 (1997).
- Koo, A. J. K., Gao, X. L., Jones, A. D., Howe, G. A. A rapid wound signal activates the systemic synthesis of bioactive jasmonates in Arabidopsis. Plant J. 59 (6), 974-986 (2009).
- Mousavi, S. A., Chauvin, A., Pascaud, F., Kellenberger, S., Farmer, E. E. GLUTAMATE RECEPTOR-LIKE genes mediate leaf-to-leaf wound signalling. Nature. 500 (7463), 422-426 (2013).
- Kirchner, S. M., Doring, T. F., Saucke, H. Evidence for trichromacy in the green peach aphid, Myzus persicae (Sulz.) (Hemiptera : Aphididae). J Insect Physiol. 51 (11), 1255-1260 (2005).
- Prince, D. C., Drurey, C., Zipfel, C., Hogenhout, S. A. The leucine-rich repeat receptor-like kinase BRASSINOSTEROID INSENSITIVE1-ASSOCIATED KINASE1 and the cytochrome P450 PHYTOALEXIN DEFICIENT3 contribute to innate immunity to aphids in Arabidopsis. Plant Physiol. 164 (4), 2207-2219 (2014).
- Chaudhary, R., Atamian, H. S., Shen, Z. X., Brigg, S. P., Kaloshian, I. GroEL from the endosymbiont Buchnera aphidicola betrays the aphid by triggering plant defense. Proc Natl Acad Sci USA. 111 (24), 8919-8924 (2014).
