Biology

في الوقت الحقيقي في فيفو تسجيل إشارات الكالسيوم أعطيت خلال تغذية الحشرة باستخدام بيوسينسور نيون

Published: August 15, 2017 doi: 10.3791/56142

Thomas R. Vincent¹, James Canham¹, Masatsugu Toyota^2,3,4, Marieta Avramova¹, Sam T. Mugford⁵, Simon Gilroy², Anthony J. Miller¹, Saskia Hogenhout⁵, Dale Sanders¹

¹Department of Metabolic Biology, John Innes Centre, Norwich Research Park, ²Department of Botany, University of Wisconsin, Madison, ³Department of Biochemistry and Molecular Biology, Saitama University, ⁴Precursory Research for Embryonic Science and Technology (PRESTO), Japan Science and Technology Agency (JST), ⁵Department of Cell and Developmental Biology, John Innes Centre, Norwich Research Park

Summary

ويحدد هذا البروتوكول طريقة بسيطة لتحليل إشارات الكالسيوم في النباتات التي تم إنشاؤها عن طريق تغذية الحشرات هيميبتيران، مثل المن. التمويل نبات تحول مع بيوسينسور الكالسيوم بروتينات فلورية خضراء GCaMP3 تسمح بالتصوير في الوقت الحقيقي في فيفو الديناميات الكالسيوم مع ارتفاع قرار الزماني والمكاني.

Abstract

أيونات الكالسيوم يتوقع أن تكون كيانات إرسال الإشارات الرئيسية خلال التفاعلات الحيوية، مع إشارات الكالسيوم تشكل جزءا ثابتاً من رد الدفاع مصنع اليسيتورس الجرثومية وجرح الناجمة عن مضغ الحشرات، استخلاص الكالسيوم الجهازية إشارات في النباتات. دور الكالسيوم في فيفو أثناء الإجهاد الحيوية غير لا تزال غير واضحة. ويصف هذا البروتوكول استخدام جهاز استشعار الكالسيوم المرمزة وراثيا كشف الإشارات الكالسيوم في النباتات أثناء التغذية بالآفات هيميبتيران. بيرس هيميبتيرانس مثل المن عدد صغير من الخلايا مع متخصصة، ممدود مص فمها، يجعلها أداة مثالية لدراسة ديناميات الكالسيوم عندما يواجه مصنع لإجهاد حيوية، الذي يختلف عن استجابة إصابة. وبالإضافة إلى ذلك، هي ثورة الفلورسنت أجهزة استشعار العوامل البيولوجية بقياس إشارات الجزيئات في فيفو في الحيوانات والنباتات. التعبير عن بيوسينسور كالسيوم القائم على التجارة والنقل، GCaMP3، في المصنع النموذجي نبات التمويل يسمح للتصوير في الوقت الحقيقي لديناميات الكالسيوم النباتية خلال الحشرة التغذية، مع ارتفاع قرار المكانية والزمانية. وقد وضعت مقايسة قابل للتكرار وقوية استخدام مجهر الأسفار أوراق GCaMP3 منفصلة، مما يسمح لقياس ديناميات الكالسيوم سيتوسوليك مستمرة قبل وأثناء وبعد تغذية الحشرة. وهذا يكشف ارتفاع كالسيوم سريع المترجمة بشدة حول المن تغذية الموقع الذي يحدث في غضون دقائق قليلة. البروتوكول يمكن تكييفها لتؤكد الحيوية الأخرى، مثل أنواع الحشرات إضافية، في حين يتيح استخدام التمويل أعطيت لتوليد طفرات سريعة لتسهيل التحليل الجزيئي لهذه الظاهرة.

Introduction

الكالسيوم (Ca^{2 +}) أحد العناصر إرسال الإشارات في كل مكان آخر في النباتات. ارتفاع عابر في سيتوسوليك Ca^{2 +} تركيز ([Ca^{2 +}]_سيت) هو فك الشفرة بشبكة معقدة من المكونات المتلقين للمعلومات، وهو يشارك في التصدي لكل الضغوط اللاأحيائية والأحيائية¹^،². ارتفاع [Ca^{2 +}]_سيتأحد الاستجابات الأولى للميكروبات اليسيتورس، تشكل جزء مشترك من مصنع الدفاع استجابة³^،^،من⁴⁵. كما لوحظت زيادات في [Ca^{2 +}[_سيت ردا على إصابة الناجمة عن مضغ الحشرات، مثل lepidopterans^،من⁶⁷. بيد أن الدور المحتمل للنبات Ca^{2 +} إشارات في الاستجابة للعيش التهديدات الحيوية التي تسبب الضرر للخلايا قليلة فقط لم تستكشف. المن Myzus persicae الخوخ الأخضر هو الحشرات هيميبتيران الذي يمثل تهديدا كبيرا للعالم الزراعة⁸^،⁹، ويترك Ca^{2 +} افلوكس من الفضاء خارج الخلية وقد لوحظ تعج بيرسيك م.¹⁰. هذه الخطوط العريضة للبروتوكول وسيلة قوية وقابلة للتكرار لقياس مصنع Ca^{2 +} إشارات بينما بيرسيك م آر من أوراق استخدام فلورية Ca^{2 +} بيوسينسور، مع المن و GCaMP3 تقديم أدوات الرواية التي تشريح دور Ca^{2 +} خلال التفاعلات الحيوية.

Ca^{2 +}-ميكروليكتروديس انتقائية واستخدمت سابقا لقياس [Ca^{2 +}] في النباتات¹¹^،¹². في الآونة الأخيرة، قد أصبح توحيد النهج طرحه ونيون. أجهزة الاستشعار هذه ربط Ca^{2 +} وينبعث الضوء، مما يسمح للفرص غير موازية لدراسة Ca^{2 +}الديناميات في الخلايا والأنسجة كاملة. يمكن حقن الأصباغ Ca^{2 +} أجهزة استشعار العوامل البيولوجية أو أنتجت ستابلي عند إدخال biosensor الترميز تسلسل إلى جينوم الكائن الحي عن طريق التحويل (أي، وراثيا ترميز أجهزة استشعار العوامل البيولوجية). هذا الأخير يقدم مزايا الرئيسية المعرب عنها في الأنسجة الحية بسهولة وقادرة على ترجمة سوبسيلولار¹³. وكان البروتين أيكوورين، معزولة عن فيكتوريا أيكووريا (قنديل البحر) أول وراثيا المرمزة Ca^{2 +} بيوسينسور المنتشرة في محطات¹⁴. بروتين طرحه، لا يتطلب أيكوورين الإثارة بالضوء الخارجي، الذي يتجنب chromophore تبيض وأوتوفلوريسسينسي¹⁵. أيكوورين وقد استخدمت بنجاح لقياس [Ca^{2 +}] الدفقات في الاستجابة للمحفزات المختلفة، بما في ذلك درجة الحرارة¹⁶, مسببات الأمراض¹⁷^،^،من¹⁸¹⁹، التأكيد الملح على²⁰ ^،²¹، و جرح⁷. ومع ذلك، فإنه هو المحرومة من كثافة إشارة منخفضة نسبيا، مما يجعل الكشف عن [Ca^{2 +}] الدفقات في خلايا فردية ومن الأنسجة مع استشعار سوء التعبير الصعبة¹³.

واستكمل وضع Ca^{2 +} أجهزة استشعار العوامل البيولوجية التي يمكن أن فلوريس أيكوورين بالسماح لتحليل مفصل سوبسيلولار ومستوى الأنسجة من Ca^{2 +} ديناميات. واحد من أجهزة استشعار العوامل البيولوجية الفلورسنت الأكثر شيوعاً هي نقل الطاقة صدى الأسفار (الحنق)-على أساس كاميليونس. كاميليونس الحنق تتألف من اثنين من البروتينات، عادة الحراجية المعتمدة ويفب، التي يتم إحضارها إلى الاتصال الوثيق بالتغير كونفورماشونال الناجمة عن الربط من Ca^{2 +} إلى مجال كالمودولين في منطقة رابط يفب الحراجية المعتمدة. يسمح هذا الاتصال نقل الطاقة من الحركة إلى يفب، والتغير الناتج في الأسفار من هذه فلوروفوريس يسمح بتقدير دقيق [Ca^{2 +}] من خلال حساب نسبة إشارات الأسفار من اثنين فلوروفوريس²². كاميليونس الحنق تعلو على صبغات الفلورسنت أيكوورين وغير راتيوميتريك، كما أنها أقل تأثرا بمستوى التعبير البروتين²³ وغالباً ما يكون عائد أكبر فلورسنت، مما يسمح للخلايا وسوبسيلولار من التصوير²³. على سبيل المثال، كاميليونس بكى مؤخرا استخدمت لتحديد Ca^{2 +} إشارات بعيدة في النباتات وحل هذه للهاتف الخلوي مستوى²⁴^،^،من²⁵²⁶.

اختراق الأخيرة مع نيون القائم على التجارة والنقل Ca^{2 +} أجهزة استشعار العوامل البيولوجية تم تطوير أجهزة الاستشعار الحساسة للغاية واحدة-فلوروفوري (واحد-FP). واحد-FP أجهزة استشعار العوامل البيولوجية تتكون من واحد دائري المبدّلة بروتينات فلورية خضراء مرتبطة إلى كالمودولين والببتيد M13، مع Ca^{2 +} الملزم كالمودولين مما أدى إلى رد فعل الماء بوساطة بين كالمودولين والتجارة والنقل حتى فيما يتعلق بالتجارة والنقل بروتوناتي وزيادة العائد الفلورسنت²⁷^،^،من²⁸²⁹. أجهزة الاستشعار واحد-تنظيم الأسرة تقدم العديد من المزايا كاميليونس الحنق، بما في ذلك أبسط تصميم تجريبي ويحتمل أن تكون أعلى دقة الزمانية التصوير³⁰. على الرغم من أن أجهزة الاستشعار واحد-تنظيم الأسرة لا يمكن قياس المطلقة [Ca^{2 +}] بساطة كأجهزة استشعار الحنق، متفوقة لإشارات تحليل ديناميات الزماني والمكاني من Ca^{2 +} ⁵^،²³. جكامبس هي واحدة من أجهزة الاستشعار واحد-FP بيستيستابليشيد²⁸ وخضعت لعدة تعديلات تحسين الغلة الفلورسنت والنطاق الديناميكي، Ca^{2 +} تقارب، والإشارات إلى الضجيج نسبة³¹^،³² ^, ³³ ^, ³⁴-"جكامبس" وقد استخدمت بنجاح في النظم الحيوانية، مثل الفواكه و الخلايا العصبية الحركية الزرد³⁵ يطير الوصلات العصبية العضلية³⁴. أدت الطفرات العشوائية من GCaMP3 فئات إضافية من أجهزة الاستشعار واحد-تنظيم الأسرة، بما في ذلك GCaMP6 أولتراسينسيتيفي³⁶ و GECOs²⁹. GECOs استخدمت مؤخرا في التمويل نبات (يشار إليها من الآن فصاعدا أعطيت) لقياس Ca^{2 +} الدفقات في الاستجابة إلى ATP وكيتين flg22 اليسيتور البكتيرية. كما أظهرت هذه الدراسة أن بيوسينسور R-جيكو تفوقت YC3.6 Cameleon الحنق من حيث إشارة القصوى التغيير والإشارات إلى الضجيج نسبة⁵.

بسبب سهولة الاستخدام وعالية الغلة الفلورسنت، وعالية الدقة الزمنية التي يمكن أن يتحقق مع أجهزة استشعار العوامل البيولوجية جكامب، تم ترميز GCaMP3 وراثيا في نبات تحت المروج فيروس تبرقش القنبيط 35S. الأدوات الجينية المتاحة للبحوث أعطيت السماح للتحليل الجزيئي المفصل Ca^{2 +} الإشارات التي تقاس GCaMP3. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن تصور بيوسينسور GCaMP3 تحت مجهر fluorescence بدلاً من نظام [كنفوكل] أكثر تكلفة. يسمح هذا البروتوكول للتصوير، أساسي عند إجراء التجارب مع الإجهادات الأحيائية يعيش كل الأنسجة. التجربة مصممة بحيث يتم طرح أوراق منفصلة من النباتات 35S::GCaMP3 في المياه، لمنع هروب الحشرات وتقييد التغذية إلى أنسجة محددة. ولذلك يسمح بالطريقة المبينة في هذه الورقة لتحليل أوراق Ca^{2 +} ديناميات خلال التغذية قبل بيرسيك م.، أسفر عن توصيف النبات رواية مما يشير إلى الاستجابة. هذا الأسلوب يمكن تكييفها أيضا للعمل مع غيرها من الضغوط الحيوية، مثل أنواع إضافية من الحشرات ومسببات الأمراض الميكروبية، والأنسجة النباتية الأخرى، مثل الجذور.

Protocol

1-"إعداد المصنع" (الأيام 1-4)

في اليوم 1، تعقيم 35S::GCaMP البذور باستخدام ثلاثة 75% إيثانول يغسل، 1 دقيقة للمياه والصرف الصحي، ولوحة لهم على 100 مم ² ساحة ألواح البلاستيك مع Murashige ¼ قوامها و المتوسطة سكوغ (مللي ثانية) (وصفه: 1.1 غ من Murashige وسكوغ المتوسطة، ز 7.5 من السكروز، 10 غم من أجار فورميديوم، و 1 لتر من الماء المتأين الشطب) ³⁷-
التجهيزة الشتلات في الظلام لمدة ثلاثة أيام في 8 درجة مئوية للحصول على إنبات متزامن.
في يوم 4 من التجربة، نقل الشتلات جكامب إلى غرفة في بيئة تسيطر عليها (CER) في 23 درجة مئوية، مع ح 16 كبيرة مظلمة الضوء و 8 ح.

2. تربية الحشرات (أيام 11-12)

في اليوم 11 من التجربة، إضافة البالغين 15 M. persicae إلى عمرها 5 الأسبوع التربة تزرع النباتات نبات فنان رطبة باستخدام ' فرشاة طلاء s (حجم 2 أو 4) (نمت في تخفيضات معتمدة للانبعاثات عند 22 درجة مئوية مع فوتوبيريو الظلام الضوء و 14 ح ح 10 د)-
قفص المن في المصنع بوضع أنابيب البلاستيك الشفاف (10 سم × 15 سم) حول المصنع وكاب مع غطاء بلاستيكي.
ترك النباتات التي تنتشر فيها أولاً بأول عن 24 ساعة في تخفيضات معتمدة للانبعاثات عند 22 درجة مئوية مع الضوء 16-ح وكبيرة مظلمة 8-ح.
في اليوم 12 من التجربة، إزالة جميع البالغين بيرسيك م. باستخدام فرشاة الطلاء.
ملاحظة: يمكن رؤية الحشرات بالعين المجردة على النبات. وهذا يعطي أن الحوريات مع عصر إنمائية مماثلة. تقريبا سيتم إنتاج حورية 1 كل شخص بالغ خلال هذه الفترة.
ترك النباتات المصابة في تخفيضات معتمدة للانبعاثات أدنى درجات الحرارة في 16 درجة مئوية، مع ح 8 الضوء و 16 h الظلام كبيرة، للحيلولة دون زيادة في الحجم جداً سرعة الحوريات.

3. نبات مفرزة (19 يوما)

يوم 19 من التجربة، إزالة الشتلات 35S::GCaMP3 من CER وفصل ورقة أكبر من كل مصنع باستخدام مقص حاد.
باستخدام زوج من ملاقط، ضع ورقة منفصلة في البئر لصفيحة 96-كذلك تحتوي على 300 ميليلتر من الماء المقطر، أباكسيال سطح مواجهة. تكرار لأوراق إضافية ( الشكل 1).

الرقم 1: فحص أوراق 35S::GCaMP3. فصل ورقة أكبر من كل يوم من العمر 16 35S::GCaMP3 نبات الشتلات وطرحت على 300 ميليلتر من الماء المقطر في صفيحة 96-جيدا. صورة تم التقاطها في اليوم التالي لمفرزة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

تغطي لوحة واضحة من البلاستيك ورقائق الألومنيوم وتترك في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها للسماح لضغط مفرزة لتهدأ.

4-"الأسفار مجهرية" (أيام 20-22)

في يوم 20 من التجربة، إزالة لوحة 96-جيدا من رقائق الألومنيوم ونقلها إلى ستيريوميكروسكوبي fluorescence. تكوين fluorescence ستيريو المجهر تثير التجارة والنقل مع ضوء 450-490 نانومتر والتقاط انبعاثات الفلورسنت بين 500 و 550 نانومتر.
جمع المن أعمارهم من مستعمرة أنشئت في اليوم 11 بإزالة النبات من التربة ووضعه في مربع شفاف مع غطاء. الحفاظ على الحشرات الواردة في المربع أثناء إجراء التجربة.
مكان لوحة 96-البئر تحت المجهر. يغير التعرض للضوء حتى يمكن تصور الأسفار GCaMP3 وضوح في عروق أوراق منفصلة. الاحتفاظ التعرض المستمر لجميع التجارب؛ للبروتوكول الحالي، تم استخدام تعرض 1-s مع ربح 3.5 ( الشكل 2).
ضبط التكبير والتكبير من المجهر مثل أنه يمكن ملاحظة 4 آبار في إطار واحد؛ واستخدمت للبروتوكول الحالي، 7.8 X التكبير وتركيز مم-127.8330.
المن واحدة على ورقة منفصلة تحت المجهر باستخدام فرشاة طلاء رطبة. ترك جريد مجاورة دون علاج كعنصر تحكم، ولكن طفيفة لمسها مع الرسام لتقليد لمس التي تحدث أثناء نقل أولاً بأول. تذكر لوضع الأغطية البلاستيكية مرة أخرى على رأس لوحة 96-جيدا أثناء الفحص المجهري لمنع الحشرة من الفرار-
بدء التسجيل الأسفار من الأوراق في أزواج (1 يعامل أولاً بأول ودون علاج 1) بواسطة النقر فوق " بدء التجربة " في برنامج مجهر المدمج ( الشكل 2). تسجيل القياسات للحد الأدنى 50
ملاحظة: للبروتوكول الحالي، فاصل زمني من 5 استخدمت s بين القياسات.
بعد 50 دقيقة، إيقاف التسجيل عن طريق النقر على " التوقف عن تجربة " وإزالة المن من النبات. حفظ قياسات الأسفار كملفات الصور (مثل كلمات تنسيق ملف الصورة، TIFF).
تكرار التجربة مع أزواج المزيد من أوراق الشجر؛ والتصوير يمكن أن تمتد إلى الصورة 2 أزواج من الأوراق في وقت واحد، مما يسمح لتصوير المتزامن للأنماط الجينية 2-

5. جمع البيانات

استيراد ملفات الصور في فيجي (صورة ي) وتحويلها إلى 32 بت بالنقر فوق " صورة " > " نوع " > " 32 بت؛ " وهذا ما يسمح لتحويل الصور إلى ملفات الفيديو heatmap (راجع الخطوة 7).
العينات التي المن لا تسوية في مكان واحد لأكثر من 5 دقائق عن طريق عرض حركة الحشرات تحت المجهر.
ملاحظة: هذا هو غالباً معظم العينات، وما يصل إلى 100 من العلاجات قد يكون مطلوباً للعثور على عينات 30 العارضة تسوية ناجحة.
تعيين مقياس القياس بكسل (أو تحويل إلى ملم، إذا كانت معروفة)، والإطار الزمني لنفس الفترة الزمنية المستخدمة أثناء الفحص المجهري عن طريق النقر على " الصورة " > " خصائص. "
باستخدام المؤشر، وضع منطقة للفائدة (ROI) حول المنطقة الأنسجة لتحليل التجارة والنقل-
ملاحظة: في البروتوكول الحالي، استخدمت كسل 50 دوروا دائرية (0.65 مم) في القطر في 3 مواقع للفائدة: المن تغذية الموقع (خ) ومنطقة المنهجي على الضلع الأوسط الورقة (Sm) ومنطقة الجهازية المتاخمة للضلع الأوسط (" الوحشي الأنسجة ، " Sl) ( الشكل 2).
1. إنشاء العائد على الاستثمار برسم شكل بيضاوي (استخدم " أداة البيضاوي ")، وتحريرها باستخدام حجم " تحرير " > " اختيار " > " تحديد. " انظر الشكل 2.
لعنصر التحكم غير المعالجة، حدد رويس في المناطق المقارنة نبات لتلك المحددة في أوراق المعالجة (أي نفس المنطقة نبات حيث يتغذى المن في أوراق المعالجة) ( الشكل 2).

رقم 2: تحليل GCaMP3 Fluorescence تحت المجهر. اليسار: أوراق التحكم غير المعالجة. الحق: أوراق يعامل أولاً بأول. تتم الإشارة إلى موقع تغذية أولاً بأول مع سهم. مقياس بار = 1-(أ) صورة مشرقة الحقل. التكبير: 7.8 X، تركز:-127.8330 ملم، والتعرض: 1 س. (ب) التجارة والنقل الصورة شويالحرس الوطني رويس تستخدم للتحليل الكمي للأسفار. خ م = تغذية الموقع، خ = الضلع الأوسط النظمية، م = الأنسجة الجانبية الجهازية. التكبير: 7.8 X، تركز:-127.8330 ملم، والتعرض: 1 s. كان سعيداً التجارة والنقل باستخدام مصباح هاليد معدني 450 إلى 490 نيوتن متر، وتم القبض على الانبعاثات الفلورسنت بين 500 و 550 نانومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

استخدام البرنامج المساعد "محلل سلسلة الوقت" عن طريق النقر فوق " الإضافات " > " "محلل سلسلة الوقت" " لتحليل القيم الفلورية الخام (و) في العائد على الاستثمار مع مرور الوقت. إضافة العائد على الاستثمار الفائدة (" إضافة [ر] "). التأكد من أنه يتم تحديد العائد على الاستثمار، حدد " الحصول على متوسط؛ " هذا سيتم عرض جدول القيم و لكل إطار في هذا العائد على الاستثمار-
نسخ هذه البيانات في جدول بيانات.
حساب مساحة الموقع إشارة التغذية عن طريق تحديد أول استخدام المنطقة " أداة التحديد اليدوي. " مخطط إشارة بروتينات فلورية خضراء القصوى وثم حساب مساحة هذا الشكل عن طريق النقر فوق " تحليل " > " التدبير. "
حساب سرعة إشارة موقع التغذية باستخدام البرنامج المساعد متراكج بواسطة النقر فوق " الإضافات " > " تتبع " > " متراكج. "
1. انقر فوق على " إضافة " الزر ومن ثم انقر فوق المؤشر في وسط إشارة عند أول مرئياً. انقر مرة أخرى على حافة الإشارة في نقطة أبعد انتشار. انقر فوق " التدبير " لحساب سرعة الإشارات.

6. تحليل بيانات

تعريف نقطة المن تسوية عن طريق اللعب من خلال إطارات الصور من المجهر في فيجي-
ملاحظة: وقت تسوية هو الإطار الذي يبقى المن في موقع واحد لمدة 5 دقائق أو أكثر. ويمكن أيضا حساب مدة تسوية الأحداث من الصور في فيجي-
تطبيع البيانات و (ΔF/F) وفقا للمعادلة ΔF/F = (F-و ₀)/F ₀، أين هو و ₀ fluorescence الأساس متوسط محسوبة من متوسط و عبر الإطارات 60 أولاً التسجيل قبل المن واستقر. تكرار لعنصر التحكم غير المعالجة-
fluorescence بروتينات فلورية خضراء طبيعية (ΔF/و) على مر الزمن لأن العائد على الاستثمار في أوراق المعالجة وغير المعالجة. تجاهل عينات (يترك كلا) إذا لم يظهر عنصر التحكم غير المعالجة الكبيرة Ca ^{2 +} العابرين (أي، ΔF/و يرتفع فوق 0.2).
كرر حتى نماذج قابلة للتطبيق على الأقل 20-30 قد تم تحليلها في النمط الوراثي.

7. الوقت--دورة "فيديو إنشاء"

تحويل ملفات الصور 32 بت إلى heatmaps باستخدام البرنامج المساعد NucMed_Image طرفيات المستعملين المحليين عن طريق النقر فوق " الإضافات " > " نوكميد " > " بحث الجداول. " في القائمة جداول البحث، حدد " أحمر أخضر أزرق " لتحويل الصور إلى خرائط الحرارة.
تعزيز إشارات على النقيض heatmap لتسليط الضوء على بروتينات فلورية خضراء أثارت أولاً بأول باستخدام " عملية " > " تعزيز التباين " > " ضبط مشبعة بكسل %. "
معلومات الوقت إضافة باستخدام البرنامج المساعد "محرد الوقت" بالنقر فوق " الإضافات " > " "محرد الوقت" ". تعيين " وقت البدء " في " 0 " " الفاصل الزمني " استناداً إلى الفترة الزمنية المستخدمة للفحص المجهري (مثلاً 5 ق).
هذا الفيديو كما معشق صوت وفيديو (AVI) الملف.
ملاحظة: هذا الفيديو يمكن أن تكون ثم تحريرها في حزم البرامج الأخرى (مثل Microsoft Movie Maker).

Representative Results

الشكل 3 و الرقم 4 هي ممثل ناتجة عن تجربة مقارنة جريد تعالج أولاً بأول مع عنصر تحكم غير معالجة. يمكن رؤية نسبة عالية مترجمة في الأسفار بروتينات فلورية خضراء حول موقع التغذية في غضون دقائق قليلة في معظم العينات، بينما Ca^{2 +} الديناميات في البقاء ليف التحكم غير المعالجة مستقرة نسبيا (الشكل 3 ألف و 3 باء). من الممكن أيضا ملاحظة الزيادات الثانوية في الأسفار بروتينات فلورية خضراء بعد الذروة الأولى في بعض التجارب (الشكل 3B). تصل إلى 50% أوراق المعالجة، لا تسوية المن والعينات يجب أن يتم تجاهل. عينات في تسوية الذي يحدث، 27 في المائة عينات لا يحمل زيادات واضحة في الأسفار بروتينات فلورية خضراء حول موقع التغذية (الشكل 3 و الجدول 1)؛ ولذلك ينبغي أن المتوسط 25-30 تكرار عينات للتحليل الكمي. ينبغي أن تكشف عن التصور للمنطقة وسرعة الارتفاع_سيت الموقع [Ca^{2 +}] تغذية إشارة من حوالي 110 ميكرون السفر في 6 ميكرومتر/s (الجدول 1). وبالإضافة إلى ذلك، يجب اكتشافها لا_سيت المرتفعات [Ca^{2 +}] عناصره داخل الورقة عند العلاج أولاً بأول، أما في الضلع الأوسط الجهازية (الشكل 4A) أو مناطق الأنسجة الجانبية الجهازية (الشكل 4 باء). ويبين الفيديو 1عينة تمثيلية من_سيت ديناميات [Ca^{2 +}] على مر الزمن. من الممكن أيضا لتحليل سلوك تسوية أولاً بأول عن طريق تتبع عدد ومدة لإحداث تسوية فردية تحت المجهر. وتظهر نتائج تمثيلية لهذه السلوكيات في الجدول 1، تبين أن المن يستغرق حوالي 10 دقيقة قبل أن يستقر، وعندما يستوطنون بنجاح، وهذا يستمر لمدة 20 دقيقة في المتوسط. ولذلك، تتم تسوية الحشرات في موقع واحد للكامل الارتفاع_سيت[Ca^{2 +}].

الشكل 3: يمكن استخدام GCaMP3 إلى كاليفورنيا أثارت "أولاً بأول كشف"^{2 +} إشارات في "موقع تغذية" في "أوراق منفصلة". اليسار: آثار الممثل (ن = 30) لتطبيع التجارة والنقل الفلورية (ΔF/و) حول موقع تغذية نبات 35S::GCaMP3 . الآثار عرض 5 دقائق قبل أن يستقر حتى 25 دقيقة بعد تسوية. التحكم = موقع مكافئ في جريد غير معالجة 35S::GCaMP3 . اليمنى: الصورة ستيريوميكروسكوبي الممثل_سيت الارتفاع [Ca^{2 +}] ينظر في جميع أنحاء المن تغذية الموقع على ورقة 35S::GCaMP3 . الأسفار بروتينات فلورية خضراء مرمزة وفقا لجدول داخلي. وأشارت إلى معرف المن المبينة في الأبيض وفي موقع تغذية برأس سهم. التكبير: 7.8 X، تركز:-127.8330 ملم، والتعرض: 1 s. كان سعيداً التجارة والنقل باستخدام مصباح هاليد معدني 450 إلى 490 نيوتن متر، وتم القبض على انبعاث الفلورسنت بين 500 و 550 نانومتر. (أ) مثال الكبيرة التي يسببها المن [Ca^{2 +}]_سيتمن الارتفاع. (ب) مثال عن المتوسط الناجم عن المن [Ca^{2 +}]_سيتالارتفاع. (ج) مثال على لا فعل المن [Ca^{2 +}]_سيتمن الارتفاع. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

المعلمة	متوسط (± SEM)
[Ca^{2 +}] ارتفاع _سيت
النسبة المئوية للعينات عرض_سيت ارتفاع [Ca^{2 +}]	73%
سرعة من جبهة الموجه	5.9 ميكرومتر/s (± 0.6)
المساحة القصوى لانتشار	² ميكرومتر 110 (± 18)
السلوك المن
عدد يستقر (> 5 دقيقة)	2 (± 0.1)
العدد الإجمالي ليستقر (جميع المدد)	3.8 (± 0.4)
سويت مرة للتصوير ^ب	20 دقيقة (± 2)
الوقت حتى يتم تسوية أول ^ج	11 دقيقة (± 1.4)
النسبة المئوية من إجمالي الوقت المستغرق تسويتها	62% (± 3)

الجدول 1: [Ca^{2 +}]_سيتالارتفاع و "معلمات السلوك أولاً بأول" أثناء 35S::GCaMP3 التصوير. المعلمات محسوبة من نماذج قابلة للتطبيق في أي تسوية من > حدث 5 دقيقة. (A) سرعة إشارة مرئية من نقطة البدء إلى نقطة أبعد من انتشار. (ب) المدة لإحداث تسوية الأولية المستخدمة في التحليل للأسفار. (ج) طول الفترة الزمنية بين بداية التصوير والمن الأول تسوية. [Ca^{2 +}] بيانات الارتفاع _سيتالمقدمة سابقا "الخلية النباتية" (الوضع الحالي: الأولى ومراقبة الجودة).

الشكل 4: لا يمكن الكشف عن GCaMP3 أولاً بأول-وأثارت Ca^{2 +} إشارات النظمية لتغذية الموقع. آثار الممثل (ن = 30) لتطبيع التجارة والنقل الفلورية (ΔF/و) في مواقع النظمية المن تغذية الموقع في يترك 35S::GCaMP3. الآثار عرض 5 دقائق قبل أن يستقر حتى 25 دقيقة بعد تسوية. التحكم = موقع مكافئ في جريد غير معالجة 35S::GCaMP3 . (أ) ΔF/F في منطقة الضلع الأوسط الجهازية. (ب) ΔF/F في منطقة الأنسجة الجانبية الجهازية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Screenshot
الفيديو 1: GCaMP3 "التنوير عبر" الوقت "المن موجز ويب". الأسفار بروتينات فلورية خضراء مرمزة وفقا لجدول داخلي. تتم الإشارة إلى مكان موقع تغذية أولاً بأول مع سهم. اليسار: أوراق 35S::GCaMP3 يتعرضون بيرسيك م الكبار. حق: مراقبة المن لا 35S::GCaMP3 ورقة. من فضلك انقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بالزر الأيمن التحميل.)

Discussion

الطريقة الموضحة في هذه الورقة يسمح للتحليل في الوقت الحقيقي للمصنع-Ca^{2 +} إشارات أثناء إجهاد حيوية مثل تغذية الحشرات فإنه يوضح أن أحد الردود المحطة الأولى لمثل هذه التهديدات مترجمة [Ca^{2 +}]_سيت رفع حول موقع تغذية الحشرة. من خلال استخدام طفرات، سيسمح هذا الأسلوب لتوصيف الجزيئية والفيزيولوجية لهذه الإشارات، التي لم يكن ممكناً في السابق. خطوة حاسمة في هذا البروتوكول هو التأكد من أن أوراق منفصلة ليست مفرطة بالانزعاج أثناء عملية مفرزة (الخطوة 3، 2) أو عند نقل الحشرات ليترك (الخطوة 4، 5). نظراً لأن البروتوكول الحالي يوفر قياس [Ca^{2 +}]_سيتبدلاً من تركيز مطلق نسبي، من المهم الاحتفاظ بالإعدادات مجهر ثابت في كافة مراحل التجربة. وهناك أيضا احتمال التحيز البشري أثناء اختيار رويس، وتحليل البيانات، وعلى هذا النحو، فإنه يوصي بإجراء التجارب مزدوجة التعمية.

وهناك العديد من المزايا الهامة لقياس [Ca^{2 +}]_سيتأثناء الإجهاد الحيوية مع هذا البروتوكول. أولاً، يتيح استخدام فلوروفوري واحد مع عالية غلة فلورسنت التصوير تجري في ستيريوميكروسكوبي، وأقل تكلفة من استخدام مجهر [كنفوكل]. استخدام فلوروفوري واحد أيضا يجعل من جمع وتحليل البيانات البسيطة، كما يوجد قياس واحد فقط لتسجيل. وبالإضافة إلى ذلك، يتيح استخدام ستيريوميكروسكوبي لتصوير أوراق كاملة، وهو أمر ضروري نظراً لأن العديد من التفاعلات الحيوية، بما في ذلك التفاعلات بين النباتية-أولاً بأول وتحدث واسعة النطاق المكاني. عالية الدقة الزمنية للصورة التقاط ممكن مع GCaMP3، استناداً عدم اقتران السريع من Ca^{2 +} من أجهزة الاستشعار بعد ربط²³^،³⁰ وعالية الغلة الفلورسنت، ويسمح للمقاييس الواجب اتخاذها حتى كل 5 s. وعلاوة على ذلك، يمنع فحص أوراق هروب الحشرات، مفتاح الحد من خطوة لإجراء مثل هذه التجارب على النباتات كلها^{(قيد الإعداد)}. أوراق منفصلة أيضا ضمان أن الحشرة يتغذى من موقع محدد مسبقاً، مما يسمح لتحليل Ca^{2 +} ديناميات قبل وأثناء وبعد الرضاعة. ويضمن هذا البروتوكول أيضا أن يترك لمراحل تنموية مشابهة تستخدم للتحليل.

والعيب الرئيسي لهذا البروتوكول تنبع من استخدام بيوسينسور غير راتيوميتريك. مع تنظيم الأسرة وحيدة أجهزة استشعار العوامل البيولوجية، قد يؤدي الاختلاف في الانبعاثات بروتينات فلورية خضراء من المتغيرات التجريبية عدا [Ca^{2 +}]_سيت، مثل التغيرات في الرقم الهيدروجيني الخلوية أو الحركة أو مستوى التعبير بيوسينسور. هذه القضايا لا تصادف مع كاميليونس الحنق خلال الحنق، كما نقل الطاقة من الحركة إلى يفب تحدث فقط عند Ca^{2 +} ملزمة. الشروط الأخرى التي تغير خصائص الفلورية fluorophores الفردية من غير المرجح لتقليد التغييرات المتعارضة في كثافة الحركة ويفب، وحساب راتيوميتريك المستخدمة أصلاً بضبط القياسات للعديد من هذه أخرى التحف الضوئية²³^،³⁰. وهذا يجعل التقديرات المطلقة [Ca^{2 +}]_سيتأكثر موثوقية بالحنق كاميليونس. ونتيجة لذلك، GCaMP3 يستخدم أفضل بيوسينسور لقياس نسبي [Ca^{2 +}]_سيت، على الرغم من أنها ما زالت كافية لكشف وتوصيف الظواهر البيولوجية في النباتات⁵^{,(in preparation)}. ولذلك، من الضروري استخدام عناصر التحكم لإظهار أن التأثير الملاحظ سبب Ca^{2 +}، بما في ذلك Ca^{2 +}-المتصلة بطفرات وراثية^{(قيد الإعداد)} أو Ca الدوائية^{2 +} مثبطات قناة مثل La^{3 +}. الأهم من ذلك، عرض واحد-FP أجهزة استشعار العوامل البيولوجية عادة الغلة الفلورسنت أكبر وأكبر مجموعة ديناميكية (أي زيادة في التنوير عند Ca^{2 +} ملزمة) من الحنق كاميليونس²³، مما يجعل جكامب أكثر ملاءمة مستوى الأنسجة التصوير، بينما بكى كاميليونس أداة مفيدة لتصوير الخلوية مع⁵^،مجهر [كنفوكل]²⁵.

أثناء تنفيذ هذا البروتوكول، فمن الممكن أن تنشأ بعض القضايا التي تحتاج إلى استكشاف الأخطاء وإصلاحها. على سبيل المثال، من المستحسن أن العينات التي تجاهلها يعرض ورقة التحكم (دون علاج) كبيرة_سيتالمرتفعات [Ca^{2 +}] (خطوة 6.3). العابرين هذه هي على الأرجح نتيجة للإجهاد الناجم عن الفحص المجهري. في الواقع، هو معروف الضوء الأزرق إلى التماس Ca^{2 +} إشارات³⁸^،³⁹^،^،من⁴⁰⁴¹، وقد يؤدي أيضا إلى ضوء الكثافة العالية في درجة الحرارة، وتؤكد ناضح كلاهما كما تحظى [Ca^{2 +}]_سيت المرتفعات²¹^،²⁵^،⁴². ونتيجة لذلك، للحد من هذه الضغوط، من المهم إجراء التجربة في غرفة جيدة التهوية والتحكم في درجة الحرارة وتجنب مرات التعرض الطويل دون داع. من المهم أيضا عدم تعطيل الأوراق مفرطة مفرزة أو أثناء الفحص المجهري لمنع اللمس أثارت [Ca^{2 +}]_سيت المرتفعات⁴³^،^،من⁴⁴⁴⁵. قد تصادف أيضا قضايا مع تسوية الحشرات. مع م. بيرسيك، لا تستقر الحشرات على الأوراق في عدة عينات. وهذا يمكن أن يكون نتيجة لآثار الجرح الدفاع في⁴⁶^،أوراق منفصلة⁴⁷، أو الإخلال بالحشرات بالضوء الأزرق. في الواقع، تحكمها الرؤية في M. persicae photoreceptors الثلاثة، بما في ذلك واحدة مع حساسية ذروة من 490 نيوتن متر⁴⁸. الحد من تعرض الفحص المجهري والتعامل مع المن مع الرعاية قد خفض الشدة والتشجيع على تسوية.

ويعطي البروتوكول الواردة في الورقة الحالية رؤى جديدة على فهم التفاعلات بين النبات-الحشرات الجزيئية واستجابة النبات للإجهاد الحيوية. أنها تسمح للتصور من أحد الردود المحطة الأولى لتغذية الحشرات وييسر مواصلة التحقيقات من خلال استخدام كبيرة أعطيت الموارد الوراثية المتاحة. وبالإضافة إلى ذلك، يسمح هذا البروتوكول باستخدام الكائنات الحية، كمقابل لاستخراج⁴⁹ أو اليسيتورس⁵⁰. في المستقبل، ويمكن تطبيق هذا الأسلوب لتؤكد الحيوية الأخرى، مثل أنواع الحشرات إضافية، والديدان الخيطية أو مسببات الأمراض الميكروبية، وكذلك الإجهادات الأحيائية واللااحيائيه. يمكن أيضا تعديل مجهرية GCaMP3 الصورة في الأنسجة النباتية الأخرى، رويس البديلة على أوراق، أو النباتات كلها حتى. وعلاوة على ذلك، هناك احتمال بيوسينسور لتكون الوراثيةly المشفرة في الأنواع النباتية إضافية. ونتيجة لذلك، البروتوكول الواردة في هذه الورقة لديه القدرة على السرية الأساس الجزيئي ل Ca^{2 +} إشارات في طائفة من رواية التفاعلات الحيوية بين النباتات وغيرها من الأنواع.

Disclosures

الكتاب قد لا يوجد تضارب في إعلان.

Acknowledgments

نود أن نشكر منحة كالدر (مركز جون إينيس، المملكة المتحدة) للحصول على المشورة فيما يتعلق بالفحص المجهري. الكتاب تود أيضا أن أشكر جون إينيس مركز البستنة وأقسام علم الحشرات لمساعدتها. أيد هذا العمل منحة دكتوراه من جون إينيس مؤسسة (التلفزيون)، منحة ب/JJ004561/1 من بسرك ومؤسسة جون إينيس (التلفاز، ماجستير، J.C.، س. م.، وادمغة، الخرائط، و D.S.)، سنة في صناعة التنسيب من مركز جون إينيس (شهادة الماجستير) ، سنهم صيف من "جمعية الكيمياء الحيوية" "المملكة المتحدة" (كيركراده)، JST المعزوفة (فرص)، ومنح المجلس 1329723 ودائرة الرقابة الداخلية--1557899 من "المؤسسة الوطنية للعلوم" (فرص و S.G.).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
35S::GCaMP3 Arabidopsis	John Innes Centre/Universty of Wisconsin	-	Step 1.1
100 mm² square plastic plates	R & L Slaughter Ltd, Upminster, UK		For growing GCaMP plants (Step 1.1)
¼ strength Murashige and Skoog (MS) medium	homemade: 1.1 g Murashige and Skoog medium, 7.5 g sucrose, 10 g Formedium agar, 1 L de-ionised water	-	For growing GCaMP plants (Step 1.1)
Col-0 Arabidopsis	-	-	For growing aged aphid colony (Step 2.1)
Myzus persicae(Sulzer)	clone US1L, Mark Stevens, Brooms Barn	-	Orginally from Rothamsted Research, UK (Step 2.1)
Artist's paintbrush size 2	Hobbycraft	610101	To tranfer aphids (Steps 2.1, 2.4 and 4.6)
96-well MicrotitreTM plate	ThermoFisher Scientific	2101	To contain the detached GCaMP3 leaves (Step 3.2)
Aluminium foil	Wrap Film Systems, Telford, UK	26B06	To cover plates with floating leaves overnight (Step 3.3)
Clear plastic wrap	SC Johnson & Son, Racine, WI, USA		To cover plates with floating leaves overnight, and to cover leaves during microscopy (Steps 3.3 and 4.7)
M205FA stereo microscope	Leica Microsystems	-	For GFP imaging (Step 4.1)
Leica Application Suite v3.2.0	Leica Microsystems		Microscope software (Step 4.1)
Fiji (Image J) v1.48a	National Institutes of Health, USA)	-	For image analysis (Step 6.1)