Summary
Dieses Protokoll beschreibt eine einfache Methode für die Analyse von Kalziumsignale in Pflanzen durch die Fütterung von hemipteran Insekten wie Blattläuse generiert. Arabidopsis Thaliana verwandelt mit der GFP-Kalzium-Biosensor GCaMP3 erlauben die Echtzeit- in-Vivo Bildgebung von Kalzium Dynamik mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung.
Abstract
Calcium-Ionen werden voraussichtlich Schlüsselentitäten Signalisierung während biotische Interaktionen mit Kalzium Signalisierung bilden einen fester Bestandteil der Pflanze Verteidigung Reaktion auf mikrobielle spüren und Verwundung, verursacht durch das Kauen von Insekten, systemische Kalzium zu entlocken sein Signale in Pflanzen. Die Rolle von Kalzium in Vivo bei biotischen Stress ist jedoch noch unklar. Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung eines genetisch codierte Kalzium-Sensors Kalziumsignale in Pflanzen erkennen, während der Fütterung durch eine hemipteran Pest. Hemipterans wie Blattläuse stechen eine kleine Anzahl von Zellen mit spezialisiert, länglich, saugen Mundwerkzeuge, so dass sie das ideale Werkzeug, um Kalzium Dynamik zu studieren, wenn eine Pflanze mit einem biotischen Stress konfrontiert ist, die aus einer Verwundung Antwort unterscheidet. Darüber hinaus sind fluoreszierende Biosensoren die Messung der Signalisierung Moleküle in Vivo bei Tieren und Pflanzen revolutioniert. Mit dem Ausdruck eines Biosensors GFP-basierte Kalzium, GCaMP3, in der Modellpflanze Arabidopsis Thaliana ermöglicht die Echtzeit-Darstellung der Pflanze Kalzium Dynamik während Insekten füttern, mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung. Eine wiederholbare und robuste-Assay wurde mit der Fluoreszenz-Mikroskopie freistehende GCaMP3 Blätter, so dass für die kontinuierliche Messung der zytosolischen Kalzium Dynamik vor, während und nach der Fütterung von Insekten entwickelt. Dies zeigt eine stark lokalisiert raschen Kalzium Höhe um die Blattlaus, die Website, die innerhalb von ein paar Minuten füttern. Das Protokoll kann andere biotische Belastungen ausgesetzt, wie z. B. zusätzliche Insektenarten, angepasst werden, während der Einsatz von Arabidopsis Thaliana zur schnellen Erzeugung von Mutanten ermöglicht die molekulare Analyse des Phänomens zu erleichtern.
Introduction
Calcium (Ca2 +) ist eines der allgegenwärtige Signalisierung Elemente in Pflanzen. Ein vorübergehender Anstieg der cytosolischen Ca2 + Konzentration ([Ca2 +]Cyt) wird durch ein komplexes Netzwerk von nachgeschalteten Komponenten decodiert und engagiert sich in der Reaktion auf beide abiotischen und biotischen Beanspruchungen1,2. Ein Anstieg der [Ca2 +]Cyt ist eine der ersten Reaktionen auf mikrobielle spüren, bilden einen gemeinsamen Teil der Pflanze Verteidigung Antwort3,4,5. Anstieg der [Ca2 +]Cyt sind auch als Reaktion auf die Verwundung, verursacht durch das Kauen von Insekten wie Schmetterlinge6,7beobachtet worden. Jedoch die mögliche Rolle der Pflanze Ca2 + Signale auf biotische Bedrohungen zu leben, die nur ein paar Zellen schädigen nicht erforscht worden. Die grüne Pfirsiche-Blattlaus Myzus Persicae ist ein hemipteran Insekt, die stellt eine erhebliche Bedrohung für die Welt Landwirtschaft8,9, und Ca2 + Ausfluss aus dem extrazellulären Raum in beobachtet wurde lässt mit M. Persicae10befallen. Dieses Protokoll beschreibt eine stabile und reproduzierbare Methode zur Messung der Pflanze Ca2 + signalisiert, während M. Persicae aus Blättern, die mit einem fluoreszierenden Ca2 + Biosensor, Blattläuse und GCaMP3 Angebot neuartiger Werkzeuge, mit denen zu füttern die Rolle der Ca2 + während der biotischen Interaktionen zu sezieren.
Ca2 +-selektive Mikroelektroden wurden früher zu messen [Ca2 +] Pflanzen11,12. In jüngerer Zeit, Fluoreszenz und Biolumineszenz Ansätze sind standardisiert geworden. Diese Biosensoren binden Ca2 + und emittieren Licht, un-parallele Studienmöglichkeiten Ca2 + Dynamik in Zellen und ganze Gewebe ermöglicht. Ca2 + Biosensoren können als Farbstoffe injiziert oder stabil bei der Einführung der Biosensor Codierung Sequenz in das Genom des Organismus über Transformation (d. h. genetisch codierte Biosensoren) hergestellt werden. Letzteres bietet die großen Vorteile des Seins einfach ausgedrückt in lebender Gewebe und in der Lage, subzelluläre Lokalisation13. Das Aequorin Protein, isoliert aus Aequorea Victoria (Qualle) war der erste genetisch codierte Ca2 + Biosensor in Pflanzen14eingesetzt. Als Biolumineszenz Protein erfordert Aequorin Erregung durch Fremdlicht, nicht das Chromophor bleichen und Autofluoreszenz15vermeidet. Aequorin wurde erfolgreich verwendet, um die Fluten [Ca2 +] in Reaktion auf verschiedene Reize, einschließlich Temperatur16, Krankheitserreger17,18,19messen, Salz stress-20 ,21und verletzte7. Jedoch ist es durch die relativ niedrige Signalintensität, machen die Erkennung von [Ca2 +] Flussmittel in einzelnen Zellen und Gewebe mit schlechten Sensor Ausdruck schwer13benachteiligt.
Subzelluläre und Gewebe-Ebene Detailanalyse von Ca2 + Dynamik ermöglicht hat die Entwicklung von Ca2 + Biosensoren, die fluoreszieren können Aequorin ergänzt. Eines der am häufigsten verwendeten fluoreszierenden Biosensoren sind die Fluoreszenz Resonanz Energietransfer (FRET)-basierte Cameleons. Bund Cameleons bestehen aus zwei Proteinen, in der Regel CFP und YFP, die durch die Konformationsänderung induziert durch die Bindung von Ca2 + zu einer Domäne Calmodulin in der GFP-YFP-Linker-Region in engen Kontakt gebracht werden. Dieser Kontakt ermöglicht die Übertragung von Energie von GFP YFP und die daraus resultierende Veränderung der Fluoreszenz von diesen Fluorophore ermöglicht die genaue Quantifizierung der [Ca2 +] durch die Berechnung des Verhältnisses der Fluoreszenz-Signale von den beiden Fluorophore22. Bund Cameleons sind Aequorin und nicht ratiometrischen fluoreszierende Farbstoffe, überlegen, wie sie sind weniger durch die Expression des Proteins23 betroffen und haben oft einen höheren Ertrag fluoreszierenden, zulassend zellulärer und subzellulärer bildgebenden23. Zum Beispiel wurden Bund Cameleons kürzlich, Fernverkehr Ca2 + Signale in Pflanzen zu identifizieren und lösen diese auf zellulärer Ebene24,25,26eingesetzt.
Ein neuen Durchbruch mit fluoreszierenden GFP-basierte Ca2 + Biosensoren wurde die Entwicklung von hochsensiblen Single-Fluorophor (Single-FP) Biosensoren. Single-FP Biosensoren bestehen aus einem einzigen kreisförmig artikulierte GFP im Zusammenhang mit einem Calmodulin und M13 Peptid, mit Ca2 + Bindung an Calmodulin, was zu einer Wasser-vermittelte Reaktion zwischen Calmodulin und GFP so Protonate GFP und Erhöhung fluoreszierende Ertrag27,28,29. Single-FP-Sensoren bieten einige Vorteile gegenüber dem Bund Cameleons, einschließlich einfacher experimental Design und eine potenziell höhere zeitliche Auflösung von imaging-30. Obwohl einzelne-FP Sensoren Absolute [Ca2 +] so einfach quantifizieren können nicht als Bund Sensoren sind sie überlegen, für die Analyse der zeitlichen und räumlichen Dynamik von Ca2 + 5,23signalisiert. GCaMPs sind eines der etabliertesten Single-FP Sensoren28 und wurden in mehreren Revisionen zur Verbesserung ihrer fluoreszierenden Ausbeute, Dynamikbereich, Ca2 + Affinität und Signal-Rausch-Verhältnis31,32 , 33 , 34. the GCaMPs haben erfolgreich eingesetzt in tierischen Systemen, wie z. B. Zebrafisch Motoneuronen35 und Obst neuromuskuläre Kreuzungen34fliegen. Zufällige Mutagenese des GCaMP3 führte zu zusätzlichen Klassen von Single-FP-Sensoren, einschließlich der empfindsamen GCaMP636 und die GECOs-29. Die GECOs wurden vor kurzem in Arabidopsis Thaliana (im folgenden als Arabidopsis bezeichnet) verwendet, um Ca2 + Flussmittel in Reaktion auf ATP, Chitin und die bakterielle Auslöser flg22 zu messen. Diese Studie zeigte auch, dass der R-GECO-Biosensor Bund Cameleon YC3.6 in Bezug auf maximale Signal Änderung und Signal-Rausch-Verhältnis5übertroffen.
Wegen der Leichtigkeit der Bedienung, fluoreszierende Hochzinsanleihen und hohe zeitliche Auflösung, der mit GCaMP Biosensoren erreicht werden kann, wurde GCaMP3 in Arabidopsis unter der Blumenkohl-Mosaik-Virus 35 s-Promoter genetisch codiert. Die genetische Tools für Arabidopsis Forschung ermöglichen die detaillierte molekulare Analyse der Ca2 + Signale durch GCaMP3 gemessen. Darüber hinaus kann der GCaMP3-Biosensor unter dem Fluoreszenzmikroskop, anstatt ein teurer konfokale System visualisiert werden. Dieses Protokoll ermöglicht ganz-Gewebe imaging, wichtig bei der Durchführung von Experimenten mit live biotischen Beanspruchungen. Das Experiment ist so ausgelegt, dass freistehende Blätter von 35S::GCaMP3 Pflanzen im Wasser, um Insekten entweichen zu verhindern und einschränken, Verfütterung an einem bestimmten Gewebe geschwommen sind. In diesem Artikel beschriebene Methode ermöglicht somit für die Analyse des Blattes Ca2 + Dynamik während der Fütterung von M. persicae, wodurch die Charakterisierung einer neuartigen Anlage Signalisierung Antwort. Diese Methode kann auch angepasst werden, um mit andere biotischen Belastungen wie z.B. zusätzliche Insektenarten und mikrobiellen Krankheitserregern und anderen pflanzlichen Geweben wie Wurzeln arbeiten.
Protocol
1. Vorbereitung der Pflanze (Tage 1 - 4)
- am 1. Tag, sterilisieren 35S::GCaMP Samen mit drei 75 % Ethanol wäscht, 1 min pro Waschgang und Teller quadratisch auf 100 mm 2 Kunststoffplatten mit ¼-Stärke Murashige und Skoog (MS) Medium (Rezept: 1,1 g Murashige und Skoog Medium, 7,5 g Saccharose, 10 g Formedium Agar und 1 L deionisiertes Wasser) 37.
- Schichten die Sämlinge im Dunkeln für drei Tage bei 8 ° C, synchrone Keimung zu erhalten.
- Am 4. Tag des Experiments, bewegen die GCaMP Sämlinge in einer kontrollierten Umgebung Zimmer (CER) bei 23 ° C, mit einer 16 h Licht und 8 h dunkel Photoperiode.
2. Insekt Erziehung (Tage 11 - 12)
- am 11. Tag des Experiments, 15 Erwachsene M. Persicae hinzufügen 5 Wochen alten Boden gewachsen Arabidopsis-Pflanzen mit einem feuchten Künstler ' s Pinsel (Größe 2 oder 4) (gewachsen in einem CER bei 22 ° C mit 10 h Licht und 14 h dunkel Photoperio (d).
- Käfig die Blattläuse auf der Pflanze durch die Platzierung von klaren Kunststoffschlauch (10 x 15 cm) rund um die Pflanze und die Kappe mit einem Kunststoffdeckel.
- Verlassen die Blattlaus-Befall Werke für 24 h in einem CER bei 22 ° C mit einem 16 h Licht und dunkel Photoperiode 8-h.
- Am 12. Tag des Experiments, alle Erwachsenen M. Persicae mit einem Pinsel entfernen.
Hinweis: Insekten mit Auge auf der Anlage gesehen werden können. Dies gibt eine Bevölkerung von Nymphen mit einem ähnlichen Entwicklungsalter. Etwa 1 Nymphe pro Erwachsenen in diesem Zeitraum produziert werden. - Lassen die befallenen Pflanzen in einem niedrigeren Temperatur CER bei 16 ° C, mit einer 8 h Licht und 16 h dunkel Photoperiode, zu verhindern, dass die Nymphen zu rasch an Größe zunimmt.
3. Blatt-Ablösung (Tag 19)
- am 19. Tag des Experiments, entfernen Sie die 35S::GCaMP3 Sämlinge von CER und lösen das größte Blatt von jeder Pflanze mit einer scharfen Schere.
- Mit der Pinzette, das freistehende Blatt in den Brunnen einer 96-Well-Platte mit 300 µL destilliertes Wasser, abaxial Oberfläche nach oben legen. Wiederholen Sie für zusätzliche Blätter ( Abbildung 1).
Abbildung 1: 35S::GCaMP3 Blatt Assay. Das größte Blatt von jeweils 16 Tage alten 35S::GCaMP3 Arabidopsis Sämling ist freistehend und Schwamm auf 300 µL destilliertes Wasser in eine 96-Well-Platte. Foto des Tages nach Ablösung. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
- die Platte in Klarsichtfolie und Alu-Folie abdecken und lassen bei Raumtemperatur über Nacht zu den Stress der Ablösung abklingen zu lassen.
4. Fluoreszenz-Mikroskopie (Tage 20 - 22)
- am 20. Tag des Experiments, die 96-Well-Platte aus Alu-Folie entfernen und auf eine Fluoreszenz Stereomikroskop übertragen. Konfigurieren Sie die Stereo-Fluoreszenzmikroskop GFP mit einem 450-490 nm Licht begeistern und die fluoreszente Emission zwischen 500 und 550 nm erfassen.
- Sammeln die gealterte Blattläuse aus der Kolonie gegründet am 11. Tag indem Sie entfernen die Pflanze aus dem Boden und es in eine transparente Box mit Deckel. Halten Sie die Insekten während der Durchführung des Experiments in der Box enthalten.
- Ort der 96-Well-Platte unter die Lupe genommen. Ändern Sie die Belichtung, bis die GCaMP3 Fluoreszenz in den Venen der freistehenden Blätter deutlich visualisiert werden kann. Die Belichtung für alle Experimente konstant zu halten; für das aktuelle Protokoll diente eine 1-s-Exposition mit einem Plus von 3,5 ( Abbildung 2).
- Stellen Sie die Vergrößerung und Zoom des Mikroskops, so dass 4 Brunnen in einem Frame beobachtet werden können; für das aktuelle Protokoll diente eine 7,8 X Vergrößerung und die Konzentration von-127,8330 mm.
- Eine Blattlaus auf ein freistehendes Blatt unter dem Mikroskop mit einem feuchten Pinsel übertragen. Lassen Sie eine angrenzende Blatt als Kontrolle unbehandelt, aber berühren Sie es leicht mit dem Pinsel um die Berührung zu imitieren, der während der Blattlaus Übertragung auftritt. Vergessen Sie nicht, setzen Sie die Plastikfolie wieder am Anfang der 96-Well-Platte während Mikroskopie, das Insekt an der Flucht zu verhindern.
- Aufnahme der Fluoreszenz der Blätter zu zweit (1 Blattlaus-behandelten und unbehandelten 1) indem Sie auf " Experiment starten " in der Software integrierte Mikroskop ( Abbildung 2). Messungen für 50 min. aufzeichnen
Hinweis: für das aktuelle Protokoll, ein Zeitintervall von 5 s zwischen Messungen diente. - Nach 50 min Aufnahme stoppen, indem er auf " beenden Test " und entfernen Sie die Blattlaus aus dem Blatt. Speichern Sie die Fluoreszenz-Messungen als Image-Dateien (z. B. tagged Bilddateiformat, TIFF).
- Wiederhole das Experiment mit weiteren Paaren der Blätter; Bildgebung ist erweiterbar um 2 paar Blätter auf einmal Bild ermöglicht die gleichzeitige Darstellung der 2 Genotypen.
5. Datensammlung
- die Bilddateien in Fidschi (Bild J) importieren und wandeln sie in 32 Bits durch Anklicken " Bild " > " Typ " > " 32-Bit; " Dies ermöglicht die Umwandlung der Bilder in Heatmap Videos (siehe Schritt 7).
- Verwerfen die Proben, in denen die Blattläuse nicht Sie sich an einem Ort für mehr als 5 min begnügen durch die Insekten Bewegung unter dem Mikroskop betrachten.
Hinweis: Dies ist oft die Mehrheit der Proben und 30 Proben präsentiert erfolgreiche Ansiedlung finden bis zu 100 Behandlungen erforderlich sein. - Setzen die Messskala Pixel (oder konvertieren in mm, wenn bekannt) und den Zeitrahmen zu gleichen Zeitintervall verwendet während der Mikroskopie durch Anklicken " Bild " > " Eigenschaften. "
- Mit dem Cursor positionieren eine Region of Interest (ROI) um den Bereich des Gewebes für GFP Analyse.
Hinweis: In das aktuelle Protokoll eine kreisförmige ROI 50 Pixel (0,65 mm) im Durchmesser diente an 3 Standorten von Interesse: die Blattlaus Fütterung Website (Fs), eine systemische Region auf der Mittelrippe des Blattes (Sm) und einer systemischen Region angrenzend an die Mittelrippe (" seitliche Gewebe " Sl) ( Abbildung 2).- Erstellen Sie den ROI durch Zeichnen eines Ovals (verwenden der " Oval Tool "), und bearbeiten Sie die Größe mit " bearbeiten " > " Auswahl " > " angeben. " siehe Abbildung 2.
- Wählen Sie bei der unbehandelten Kontrolle ROIs in vergleichbaren Regionen des Blattes zu den ausgewählten am behandelten Blatt (d. h. der gleichen Region des Blattes als denen die Blattlaus am behandelten Blatt gefüttert) ( Abbildung 2).
Abbildung 2: GCaMP3 Fluoreszenz unter dem Mikroskop analysiert. Links: unbehandelten Kontrolle Blatt. Rechts: Blattlaus-behandelte Blatt. Der Blattlaus Futterstelle wird mit einer Pfeilspitze angezeigt. Maßstabsleiste = 1 mm. (A) Hellfeld Bild. Vergrößerung: 7,8 X, Schwerpunkt:-127,8330 mm, Exposure: 1 s. (B) GLP Bild Showing der ROIs verwendet für die Quantitative Analyse der Fluoreszenz. FS = Futterstelle, Sm = systemische Mittelrippe, Sl = systemische seitliche Gewebe. Vergrößerung: 7,8 X, Schwerpunkt:-127,8330 mm, Exposure: 1 s. Die GFP war begeistert mit einem 450 bis 490 nm Metallhalogenidlampe und Fluoreszenz Emission wurde zwischen 500 und 550 nm erfasst. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
- Time Series Analyzer-Plugin verwenden, indem " Plugins " > " Time Series Analyzer " roh Fluoreszenz-Werte (F) in der ROI im Laufe der Zeit zu analysieren. Fügen Sie den ROI von Interesse (" hinzufügen [t] "). Dafür zu sorgen, dass der ROI ausgewählt ist, wählen Sie " bekommen Durchschnitt; " erscheint eine Tabelle mit F-Werte für jeden Frame in diese Rendite.
- Diese Daten in ein Arbeitsblatt kopieren.
- Berechnen Sie die Fläche des Fütterung Website Signals durch die erste Auswahl der Region mit der " Freihandauswahl Werkzeug. " skizzieren das maximale GFP-Signal und dann berechnen Sie die Fläche dieser Form durch Klicken auf " Analyze " > " Maß. "
- Berechnen Sie die Geschwindigkeit der Fütterung Website-Signal mit dem MTrackJ-Plugin durch Klicken auf " Plugins " > " Tracking-" > " MTrackJ. "
- Klicken Sie auf die " Add " Taste und klicken Sie dann den Cursor in der Mitte des das Signal, wenn es zunächst sichtbar ist. Klicken Sie wieder auf die Flanke des Signals an der Stelle des am weitesten verteilen. Klicken Sie auf " messen ", die Geschwindigkeit des Signals zu berechnen.
6. Analyse der Daten
- definieren den Punkt der Blattlaus Beilegung von spielen durch die Bild-Frames vom Mikroskop in Fidschi.
Hinweis: Die Zeit der Abrechnung ist der Rahmen, in dem die Blattlaus an einem einzigen Ort für 5 min oder länger bleibt. Die Dauer der Abwicklung von Veranstaltungen kann auch von den Bildern in Fidschi berechnet werden. - Normalisieren die F-Daten (ΔF/F) nach der Gleichung ΔF/F = (F - F 0) / f 0, wo F 0 die durchschnittliche Baseline Fluoreszenz ist berechnet sich aus dem Durchschnitt der F über die ersten 60 Frames, der Aufzeichnung vor der Blattlaus abgerechnet. Wiederholen Sie für der unbehandelten Kontrolle.
- Plotten die normalisierten GFP-Fluoreszenz (ΔF/F) im Laufe der Zeit für diese Rendite im behandelten und unbehandelten Blatt. Proben (beide Blätter) zu verwerfen, wenn die unbehandelte Kontrolle große Ca 2 + Transienten (d.h., ΔF/F erhebt sich über 0,2 zeigt).
- Wiederholen, bis mindestens 20-30 tragfähige Proben pro Genotyp analysiert wurden.
7. Zeit-Kurserstellung Video
- konvertieren die 32-Bit-Bild-in Heatmaps mit dem NucMed_Image LUTs Plugin Dateien durch Klicken auf " Plugins " > " NucMed " > " Lookup Tabellen. " wählen Sie im Menü der Lookup-Tabellen " blau grün rot " die Bilder konvertieren Heatmaps.
- Erhöhen der Kontrast der Heatmap, markieren Sie die Blattlaus entlockte GLP signalisiert mit " Verfahren " > " Kontrast verbessern " > " anpassen gesättigten Pixel % "
- Add Zeitinformationen mit dem Zeit Stamper Plugin durch Klicken auf " Plugins " > " Zeit Stamper ". Festlegen der " Startzeit " am " 0 " und das " Intervall " basierend auf das Zeitintervall für die Mikroskopie (z.B. 5 s) verwendet.
- Dieses Video als eine audio Video (AVI) Datei Interleaved exportieren.
Hinweis: Dieses Video kann dann bearbeitet werden weiter in anderen Software-Paketen (z. B. Microsoft Movie Maker).
Representative Results
Abbildung 3 und Abbildung 4 sind Vertreter ergibt sich aus einem Experiment eine Blattlaus-behandelte Blatt mit einer unbehandelten Kontrolle zu vergleichen. Eine sehr lokalisierte Zunahme der GFP Fluoreszenz kann rund um die Futterstelle in wenigen Minuten in der Mehrzahl der Proben, gesehen werden, während die Ca2 + Dynamik in den unbehandelten Kontrolle Blatt Aufenthalt relativ stabil (Abbildung 3A und 3 b). Es ist auch möglich, sekundäre erhöht GFP Fluoreszenz nach dem ersten Höhepunkt in einigen Experimenten (Abb. 3 b) zu beobachten. In bis zu 50 % der behandelten Blätter die Blattläuse nicht zufrieden und die Proben sollten weggeworfen werden. Der Proben in die Abrechnung erfolgt aufweisen 27 % der Proben nicht deutliche Steigerungen GFP Fluoreszenz rund um die Futterstelle (Abbildung 3 und Tabelle 1) Daher sollten 25-30 replizieren Proben für Quantitative Analyse gemittelt werden. Visualisierung des Gebiets und die Geschwindigkeit der Fütterung Website [Ca2 +]Cyt Höhe sollte ein Signal von rund 110 µm bei 6 µm/s (Tabelle 1) zeigen. Darüber hinaus sollten keineCyt Erhebungen [Ca2 +] systemisch in das Blatt bei der Blattlaus Behandlung, entweder in der systemischen Mittelrippe (Abb. 4A) oder systemische seitliche Gewebe-Regionen (Abbildung 4 b) erkannt werden. Video 1zeigt eine repräsentative Stichprobe derCyt Dynamik [Ca2 +] im Laufe der Zeit. Es ist auch möglich, Blattlaus Beilegung Verhalten zu analysieren, indem Sie die Anzahl und Dauer der Einschwingzeit Einzelveranstaltungen unter dem Mikroskop verfolgen. Repräsentative Ergebnisse für diese Verhaltensweisen sind in Tabelle 1zeigen, dass die Blattläuse rund 10 Minuten, nehmen bevor er sich, und wenn sie erfolgreich absetzen zu tun, dies 20 min. im Durchschnitt dauert dargestellt. Daher werden die Insekten an einem einzigen Speicherort für die Gesamtheit derCyt Erhebung [Ca2 +] abgerechnet.
Abbildung 3: GCaMP3 lässt sich erkennen, Blattlaus entlockte Ca2 + Signale am Standort Fütterung freistehende verlässt. Links: repräsentative Spuren (n = 30) der normalisierten GFP Fluoreszenz (ΔF/F) rund um die Futterstelle eines 35S::GCaMP3 Blattes. Die Spuren zeigen 5 min bevor er sich bis zu 25 min nach dem absetzen. Steuerung = entsprechenden Speicherort auf einem unbehandelten 35S::GCaMP3 Blatt. Rechts: repräsentative Stereomikroskop Bild [Ca2 +]Cyt Höhe um eine Blattlaus Fütterung Website auf einem 35S::GCaMP3 Blatt gesehen. Die GFP Fluoreszenz ist farbcodiert nach der Inset-Skala. Die Blattlaus-Id in weiß und der Futterstelle umrissen angegeben mit einer Pfeilspitze. Vergrößerung: 7,8 X, Schwerpunkt:-127,8330 mm, Exposure: 1 s. Die GFP war begeistert mit einem 450 bis 490 nm Metallhalogenidlampe, und die fluoreszente Emission wurde zwischen 500 und 550 nm gefangengenommen. (A) ein Beispiel für eine große Blattlaus-induzierte [Ca2 +]Cyt Höhe. (B) ein Beispiel für eine durchschnittliche Blattlaus-induzierte [Ca2 +]Cyt Höhe. (C) ein Beispiel für keine Blattlaus-induzierte [Ca2 +]Cyt Höhe. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
| Parameter | Durchschnitt (± SEM) |
| [Ca2 +] CYT Höhe | |
| Anteil der Proben, die Anzeige einerCyt Höhe [Ca2 +] | 73 % |
| Geschwindigkeit der Wellenfront ein | 5.9 µm/s (± 0,6) |
| Maximale Fläche der Ausbreitung | 110 µm2 (± 18) |
| Blattlaus-Verhalten | |
| Anzahl der Settles (> 5 min) | 2 (± 0,1) |
| Gesamtzahl der Settles (alle Laufzeiten) | 3.8 (± 0,4) |
| Zeit ließ sich für imaging- b | 20 min (± 2) |
| Zeit bis zum ersten Settle c | 11 min (± 1,4) |
| Prozentsatz der gesamten Zeitaufwand abgerechnet | 62 % (± 3) |
Tabelle 1: [Ca2 +]Cyt Höhe und Blattlaus Verhalten Parameter während 35S::GCaMP3 Imaging. Parameter berechnet aus lebensfähigen Proben in die Abrechnung des > 5 min aufgetreten ist. (A) Geschwindigkeit des sichtbaren Signals ab dem Zeitpunkt der Einleitung der weitesten Verbreitung. (B) Dauer der ersten Abrechnung Veranstaltungen verwendet für die Analyse der Fluoreszenz. (C) Länge der Zeit zwischen dem Beginn der Bildgebung und der erste Blattlaus zu begleichen. [Ca2 +] CYT Höhendaten vorher eingereicht, The Plant Cell (Stand: erste QC).
Abbildung 4: GCaMP3 kann nicht Blattlaus entlockte Ca2 + Signale an der Futterstelle systemische erkennen. Repräsentative Spuren (n = 30) der normalisierten GFP Fluoreszenz (ΔF/F) in Standorten systemische, die Blattlaus Fütterung Standort in verlässt 35S::GCaMP3. Die Spuren zeigen 5 min bevor er sich bis zu 25 min nach dem absetzen. Steuerung = entsprechenden Speicherort auf einem unbehandelten 35S::GCaMP3 Blatt. (A) ΔF/F im Bereich systemische Mittelrippe. (B) ΔF/F im Bereich systemische seitliche Gewebe. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Video 1: GCaMP3 die Blüte im Laufe der Zeit als eine Blattlaus ernährt. Die GFP Fluoreszenz ist farbcodiert nach der Inset-Skala. Die Position der Blattlaus Futterstelle wird mit einer Pfeilspitze angezeigt. Links: 35S::GCaMP3 Blatt eine M. Persicae Erwachsenen ausgesetzt. Rechts: Ein 35S::GCaMP3 keine-Blattlaus Kontrolle Blatt. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum download)
Discussion
In diesem Artikel beschriebene Methode ermöglicht die Echtzeit-Analyse der Pflanze Ca2 + Signalisierung bei einer biotischen Stress wie Insekten füttern. Es zeigt, dass eine der ersten Anlage Antworten auf solche Bedrohungen eine lokalisierte [Ca2 +]Cyt Höhe rund um die Futterstelle des Insekts. Diese Methode ermöglicht durch den Einsatz von Mutanten, für die die molekulare und physiologische Charakterisierung von solchen Signalen, die vorher nicht möglich war. Ein wichtiger Schritt in diesem Protokoll soll sicherstellen, dass die freistehende Blätter nicht übermäßig gestört beim ablösen (Schritt 3.2) oder sind bei der Übertragung von Insekten, die Blätter (Schritt 4.5). Angesichts der Tatsache, dass das aktuelle Protokoll eine relative Messung [Ca2 +]Cyt anstatt eine absolute Konzentration sieht, ist es wichtig, dass die Mikroskop-Einstellungen während des Experiments konstant gehalten werden. Es gibt auch das Potential für menschliche Voreingenommenheit bei der Auswahl des ROIs und die Analyse der Daten, und als solche, es wird empfohlen, die Experimente sind Doppel-Blind.
Es gibt mehrere bedeutende Vorteile [Ca2 +]Cyt bei biotischen Stress mit diesem Protokoll zu messen. Zunächst ermöglicht die Verwendung von einem einzigen Fluorophor mit fluoreszierenden ertragreich die Bildgebung auf einem Stereomikroskop durchgeführt werden, die ist billiger als mit einem konfokalen Mikroskop. Die Verwendung von einem einzigen Fluorophor macht auch Datenerhebung und-Analyse einfach, da gibt es nur einer Messung zu erfassen. Darüber hinaus ermöglicht die Verwendung eines Stereomikroskops für die Bildgebung des gesamten Blätter, das ist wichtig, angesichts der Tatsache, dass viele biotische Interaktionen, einschließlich Anlage-Blattlaus Interaktionen, räumliche großflächig auftreten. Die hohe zeitliche Auflösung des Bildes erfassen mit GCaMP3, basierend auf die schnelle Distanzierung von Ca2 + vom Sensor nach Bindung23,30 und fluoreszierendem Hochzinsanleihen möglich, ermöglicht Messungen bis zu treffenden alle 5 s. Darüber hinaus verhindert die Blatt-Assay den Austritt des Insekts, einen Schlüssel Schritt, um solche Experimente auf ganze Pflanzen (in Vorbereitung)zu begrenzen. Die freistehende Blätter sorgen auch dafür, dass das Insekt ernährt sich von einem vordefinierten Ort, so dass für die Analyse von Ca2 + Dynamik vor, während und nach der Fütterung. Dieses Protokoll sorgt auch dafür, dass Blätter von ähnlichen Entwicklungsstufen für die Analyse verwendet werden.
Der größte Nachteil dieses Protokolls stammt aus der Verwendung eines nicht-ratiometrischen Biosensors. Mit Single-FP Biosensoren ergeben Variation der GFP-Emission aus experimentellen Variablen als [Ca2 +]Cyt, wie Veränderungen in der zellulären pH, Bewegung oder die Expression der Biosensor. Diese Fragen sind nicht mit Bund Cameleons beim Bund, anzutreffen, wie die Übertragung von Energie von GFP, YFP nur auf Ca2 + Bindung tritt. Andere Bedingungen, die die fluoreszierenden Eigenschaften des einzelnen Fluorophore verändern werden voraussichtlich die gegnerischen Änderungen in der Intensität der CFP und YFP zu imitieren, und die ratiometrischen Berechnung, die von Natur aus verwendet wird normalisiert die Messungen für viele dieser andere optische Artefakte23,30. Schätzungen des absoluten [Ca2 +]Cyt wird dadurch zuverlässiger mit Bund Cameleons. Infolgedessen GCaMP3 als eines Biosensors eignet sich besonders zur Messung der relativen [Ca2 +]Cyt, obwohl es immer noch reicht zu erkennen und zu charakterisieren, biologische Phänomene in Pflanzen5,(in preparation). Daher ist es unerlässlich, Steuerelemente zu verwenden, um zu zeigen, dass der beobachtete Effekt durch Ca2 +, einschließlich Ca2 +-bezogene genetische Mutanten(in Vorbereitung) oder pharmakologischen Ca2 + -Kanal-Hemmer wie La3 + . Wichtig ist, anzeigen Single-FP Biosensoren in der Regel eine höhere fluoreszierende Ausbeute und größeren Dynamikbereich (d. h. eine Erhöhung der Blüte auf Ca2 + Bindung) als Bund Cameleons23, wodurch GCaMP besser geeignet, um Gewebe-Ebene Imaging, während Bund Cameleons ein nützliches Werkzeug für die zelluläre Bildgebung mit einem confocal Mikroskop5,25 sind.
Während der Durchführung dieses Protokolls ist es möglich, dass einige Probleme entstehen, die die Problembehandlung erfordern. Beispielsweise empfiehlt es sich, dass die Proben, in denen der Kontrolle (unbehandelt) Blatt zeigt große [Ca2 +]Cyt Höhen sind (Schritt 6.3) verworfen. Solchen Transienten sind wahrscheinlich die Folge von Stress induziert durch die Mikroskopie. In der Tat, blaues Licht ist bekannt, Ca zu entlocken2 + Signale38,39,40,41, und das Licht hoher Intensität kann auch Temperatur-und osmotischen Stress führen beide auch [Ca2 +]Cyt Höhen21,25,42zu entlocken. Folglich, um solche Spannungen zu reduzieren, ist es wichtig, das Experiment in einem gut belüfteten und temperierten Raum durchzuführen und unnötig langen Belichtungszeiten zu vermeiden. Es ist auch wichtig, nicht die Blätter übermäßig stören während der Ablösung oder während der Mikroskopie, Touch entlockte [Ca2 +]Cyt Höhen43,44,45zu verhindern. Probleme können auch mit Insekten absetzen. Mit M. Persicaebegnügen sich die Insekten nicht auf den Blättern in mehreren Proben. Dies könnte eine Folge der Wunde entlockte Verteidigung in der freistehenden Blätter46,47, oder die Störung der Insekten durch das blaue Licht. In der Tat unterliegt Vision in M. Persicae drei Photorezeptoren, unter anderem mit einem Peak-Empfindlichkeit von 490 nm48. Reduzierung der Mikroskopie und Handhabung die Blattläuse mit Sorgfalt möglicherweise reduzieren Not und Ansiedlung zu fördern.
Das Protokoll in das aktuelle Papier skizzierten gibt neue Einblicke auf die molekularen Verständnis der Pflanzen-Insekten-Interaktionen und die Pflanze Reaktion auf biotischen Stress. Es ermöglicht die Visualisierung eines der ersten Anlage Antworten auf Insekten füttern und ermöglicht weitere Untersuchungen durch den Einsatz von erheblichen Arabidopsis genetischen Ressourcen zur Verfügung. Darüber hinaus dieses Protokoll ermöglicht den Einsatz von lebenden Organismen, im Gegensatz zu extrahiert49 oder spüren50. In Zukunft könnte diese Technik andere biotische Belastungen ausgesetzt, wie zusätzliche Insektenarten, Nematoden oder mikrobiellen Krankheitserregern sowie abiotischen Belastungen angewendet werden. Die GCaMP3-Mikroskopie kann auch andere Pflanzengewebe, alternative ROIs auf dem Blatt oder sogar ganze Pflanzen Bild angepasst werden. Darüber hinaus gibt es das Potenzial für die Biosensor zu genetischenLy in weitere Pflanzenarten kodiert. Infolgedessen hat das Protokoll in diesem Dokument beschriebenen das Potenzial, undercover die molekulare Grundlagen der Ca2 + -Signalisierung in einer Reihe von neuartigen biotische Interaktionen zwischen Pflanzen und andere Arten.
Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.
Acknowledgments
Wir möchten Grant Calder (John Innes Centre, U.K) Danke für die Beratung zur Mikroskopie. Auch möchten die Autoren John Innes Centre Gartenbau und Entomologie Abteilungen für ihre Unterstützung danken. Diese Arbeit wurde von einem PhD-Zugehörigkeit aus der John Innes (TV) unterstützt die BBSRC und John Innes Foundation B/JJ004561/1 Zuschuss (t.v., M.A., j.c., S.M., s.h., T.M und D.S.), ein Jahr in Industrie-Platzierung aus dem John Innes Centre (M.A.) , ein Sommer-Zugehörigkeit aus der biochemischen Society of the UK (j.c.), JST PRESTO (M.T.) und Zuschüsse MCB 1329723 und IOS-1557899 von der National Science Foundation (M.T. und S.G.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35S::GCaMP3 Arabidopsis | John Innes Centre/Universty of Wisconsin | - | Step 1.1 |
| 100 mm2 square plastic plates | R & L Slaughter Ltd, Upminster, UK | For growing GCaMP plants (Step 1.1) | |
| ¼ strength Murashige and Skoog (MS) medium | homemade: 1.1 g Murashige and Skoog medium, 7.5 g sucrose, 10 g Formedium agar, 1 L de-ionised water | - | For growing GCaMP plants (Step 1.1) |
| Col-0 Arabidopsis | - | - | For growing aged aphid colony (Step 2.1) |
| Myzus persicae(Sulzer) | clone US1L, Mark Stevens, Brooms Barn | - | Orginally from Rothamsted Research, UK (Step 2.1) |
| Artist's paintbrush size 2 | Hobbycraft | 610101 | To tranfer aphids (Steps 2.1, 2.4 and 4.6) |
| 96-well MicrotitreTM plate | ThermoFisher Scientific | 2101 | To contain the detached GCaMP3 leaves (Step 3.2) |
| Aluminium foil | Wrap Film Systems, Telford, UK | 26B06 | To cover plates with floating leaves overnight (Step 3.3) |
| Clear plastic wrap | SC Johnson & Son, Racine, WI, USA | To cover plates with floating leaves overnight, and to cover leaves during microscopy (Steps 3.3 and 4.7) | |
| M205FA stereo microscope | Leica Microsystems | - | For GFP imaging (Step 4.1) |
| Leica Application Suite v3.2.0 | Leica Microsystems | Microscope software (Step 4.1) | |
| Fiji (Image J) v1.48a | National Institutes of Health, USA) | - | For image analysis (Step 6.1) |
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