Biology

בזמן אמת In Vivo הקלטה של תודרנית סידן אותות שהאכילה חרקים באמצעות ביוסנסור פלורסנט

Published: August 15, 2017 doi: 10.3791/56142

Thomas R. Vincent¹, James Canham¹, Masatsugu Toyota^2,3,4, Marieta Avramova¹, Sam T. Mugford⁵, Simon Gilroy², Anthony J. Miller¹, Saskia Hogenhout⁵, Dale Sanders¹

¹Department of Metabolic Biology, John Innes Centre, Norwich Research Park, ²Department of Botany, University of Wisconsin, Madison, ³Department of Biochemistry and Molecular Biology, Saitama University, ⁴Precursory Research for Embryonic Science and Technology (PRESTO), Japan Science and Technology Agency (JST), ⁵Department of Cell and Developmental Biology, John Innes Centre, Norwich Research Park

Summary

פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה לניתוח אותות סידן בצמחים שנוצר על ידי האכלה חרקים hemipteran, כגון כנימות. תודרנית לבנה טרנספורמציה עם החיישן סידן GFP GCaMP3 מאפשרים בזמן אמת אין ויוו ההדמיה של סידן דינמיקה עם רזולוציה טמפורלית, מרחבית גבוהה.

Abstract

יוני הסידן צפויים להיות ישויות איתות מפתח במהלך אינטראקציות ביוטיים, עם סידן איתות ויוצרים חלק בלתי מבוססת התגובה ההגנה צמח elicitors מיקרוביאלי, ופצעו הנגרמת על ידי לעיסה חרקים, העלאת סידן מערכתית אותות בצמחים. עם זאת, תפקידו של הסידן ויוו במהלך ללחץ ביוטיים לא ברור עדיין. פרוטוקול זה מתאר את השימוש בחיישן סידן מקודד גנטית כדי לזהות אותות סידן בצמחים שהאכילה מאת נודניק hemipteran. Hemipterans כגון כנימות פירס מספר קטן של תאים עם מתמחה, מוארך יניקה mouthparts, שהופך אותם כלי אידיאלי ללמוד סידן dynamics בעת צמח מתמודד עם דגש ביוטיים, אשר היא נבדלת לתגובה wounding. בנוסף, פלורסנט ביולוגיים הם מהפכה המידה של איתות מולקולות ויוו של בעלי חיים וצמחים. ביטוי של סידן מבוסס-GFP ביוסנסור, GCaMP3, בצמח דגם תודרנית לבנה מאפשר ההדמיה בזמן אמת של הצמח סידן דינמיקה במהלך חרק האכלה, בעל רזולוציה גבוהה של יכולות. וזמינותו הדיר וחזק פותחה באמצעות מיקרוסקופ פלורסצנטיות את העלים GCaMP3 מנותק, המאפשר מדידה רציפה של סידן cytosolic dynamics לפני, במהלך, ואחרי האכלה חרקים. זה חושף העלאת סידן מהירה מאוד מותאמת לשפות אחרות סביב מימדיה האכלה באתר המתרחשת בתוך דקות ספורות. הפרוטוקול ניתן להתאים מדגיש ביוטיים אחרים, כמו מינים חרקים נוספים, תוך שימוש תודרנית לבנה מאפשר לדור מהירה של מוטציות כדי להקל על הבדיקה המולקולרית של התופעה.

Introduction

סידן (Ca^{2 +}) היא אחד המרכיבים איתות הכי נפוץ בצמחים. עלייה Ca cytosolic^{2 +} ריכוז ארעי ([Ca^{2 +}]_cyt) מפוענח על ידי רשת מורכבת של רכיבים במורד הזרם, ומעורב התגובה בשני מדגיש והאביוטיים וביוטי¹^,². עלייה [Ca^{2 +}]_cytהיא אחת התגובות הראשונות elicitors מיקרוביאלי, ויוצרים חלק משותף של הצמח הגנה תגובה³^,⁴^,⁵. עליות [Ca^{2 +}]_cyt נצפו גם בתגובה ופצעו הנגרמת על ידי לעיסה חרקים כמו⁶^,lepidopterans⁷. עם זאת, התפקיד הפוטנציאלי של צמח Ca^{2 +} אותות בתגובה לחיות איומים ביוטיים לגרום נזק רק כמה תאים לא נחקרו. כנימות עלה אפרסק ירוק המידע שיפורט להלן מתייחס הוא חרק hemipteran המייצג איום משמעותי בעולם החקלאות⁸^,⁹, ומשאיר Ca נצפתה^{2 +} בזרימת מן המרחב חוץ-תאית שורץ שיפורט להלן מתייחס מ¹⁰. זה מתאר פרוטוקול שיטה חזקה הדיר למדידת צמח Ca^{2 +} אותות בזמן מ שיפורט להלן מתייחס ניזונים מן העלים באמצעות של פלורסנט Ca^{2 +} ביוסנסור, עם כנימות והן GCaMP3 המציע כלים חדשניים שאליו לנתח את התפקיד של Ca^{2 +} במהלך אינטראקציות ביוטיים.

Ca^{2 +}-סלקטיבית microelectrodes שימשו בעבר כדי למדוד [Ca^{2 +}] צמחים¹¹^,¹². לאחרונה, גישות זוהרים פלורסנט יש להפוך סטנדרטית. ביולוגיים אלה לאגד^{2 +} Ca, פולטים אור, המאפשר הזדמנויות בלתי paralleled בחקר Ca^{2 +}דינמיקה של תאים ורקמות שלם. Ca^{2 +} ביולוגיים ניתן להזריק לפי צבע או stably מצחק המבוא של החיישן קידוד רצף לתוך הגנום של האורגניזם באמצעות טרנספורמציה (קרי, מקודדים גנטית ביולוגיים). האחרון מציע היתרונות הגדולים בלהיות בקלות מתבטאות רקמה חיה, מסוגל לוקליזציה subcellular¹³. חלבון aequorin, מבודד Aequorea ויקטוריה (מדוזה) היה הראשון מקודדים גנטית Ca^{2 +} החיישן לפרוס צמחים¹⁴. כמו חלבון זוהרים, לא דורשת aequorin עירור על ידי אור חיצוני, אשר מונע כרומופור הלבנת ו- autofluorescence¹⁵. אאקורין שימש בהצלחה למדוד [Ca^{2 +}] פלקסים בתגובה לגירויים שונים, כולל טמפרטורה¹⁶, פתוגנים¹⁷^,¹⁸^,¹⁹, מלח להדגיש²⁰ ^,²¹, ופצעו⁷. עם זאת, זה היא נחותה על ידי עוצמת אות נמוכה יחסית, ביצוע הזיהוי [Ca^{2 +}] פלקסים בתאים בודדים ומן הרקמות עם חיישן המסכן ביטוי קשה¹³.

הפיתוח של Ca^{2 +} ביולוגיים יכולים לזרוח השלים aequorin ומאפשר ניתוח subcellular, רקמות ברמת מפורט של Ca^{2 +} דינמיקה. אחד ביולוגיים פלורסנט הנפוצים ביותר הם העברת האנרגיה תהודה קרינה פלואורסצנטית (סריג)-מבוסס Cameleons. סריג Cameleons מורכבים שני חלבונים, בדרך כלל CFP ו YFP, אשר מובאים במגע קרוב ידי השינוי הסתגלותי המושרה על-ידי האיגוד של Ca^{2 +} לתחום קלמודולין באזור מקשר CFP-YFP. קשר זה מאפשר ההעברה של אנרגיה מן CFP YFP ולאחר השינוי שנוצר ידי קרינה פלואורסצנטית של אלה fluorophores מאפשר כימות מדויק של [Ca^{2 +}] דרך חישוב היחס בין האותות פלורסצנטיות משני fluorophores²². סריג Cameleons נעלים על צבעי נמכרות aequorin, הלא-רציומטרי, כפי שהם שמושפעת פחות רמת ביטוי של חלבונים²³ , לעיתים קרובות יש תשואה פלורסנט גדול יותר, ומאפשר הדמיה, הסלולר, subcellular²³. כך למשל, סריג Cameleons לאחרונה שימשו לזיהוי הבינעירוניים Ca^{2 +} אותות בצמחים וכדי לפתור את הסלולר רמה²⁴^,²⁵^,²⁶.

פריצת הדרך האחרונה עם פלורסנט מבוסס-GFP Ca^{2 +} ביולוגיים כבר התפתחות ביולוגיים רגישה מאוד חד-fluorophore (חד-FP). יחיד-FP ביולוגיים מורכבים של יחיד באופן מעגלי permutated GFP מקושר קלמודולין ו M13 פפטיד, עם Ca^{2 +} מחייב את קלמודולין, וכתוצאה מכך לתגובה בתיווך מים בין קלמודולין GFP אז ולביטול protonate GFP עלייה התשואה פלורסנט²⁷^,²⁸^,²⁹. יחיד-FP חיישנים מציעים כמה יתרונות על פני Cameleons סריג, כולל תכנון ניסויים פשוטים יותר רזולוציה טמפורלית פוטנציאל גבוה יותר של הדמיה³⁰. למרות יחיד-FP חיישנים אי אפשר לכמת המוחלט [Ca^{2 +}] הכי פשוט כמו סריג חיישנים, הם נעלה על הניתוח של הדינמיקות הגיאופוליטיות והמרחביות הטמפורלי של Ca^{2 +} מסמן⁵^,²³. GCaMPs הן אחד יחיד-FP חיישנים best-established²⁸ , עברו מספר תיקונים כדי לשפר שלהם תשואה פלורסנט טווח דינמי, Ca^{2 +} אהדה, יחס אות לרעש³¹^,³² ^, ³³ ^, ³⁴. GCaMPs בהצלחה השתמשו במערכות בעלי חיים, כגון דג זברה מוטורי לגלוקוז³⁵ ופירות לטוס צמתי neuromuscular³⁴. מוטגנזה מכוונת אקראי של GCaMP3 הביא שיעורים נוספים של חיישנים יחיד-FP, כולל GCaMP6 העדינה³⁶ ו- GECOs²⁹. GECOs שימשו לאחרונה תודרנית לבנה (המכונה מעתה ואילך תודרנית) כדי למדוד Ca^{2 +} פלקסים בתגובה ATP, כיטין, את flg22 elicitor חיידקי. מחקר זה הראה גם כי החיישן R-GECO ביצועים טובים יותר את YC3.6 Cameleon סריג במונחים של האות המקסימלי השינוי ואת אות לרעש יחס⁵.

בגלל הקלות של שימוש, ההובג הקופתל פלורסנט ברזולוציה הטמפורלית גבוהה ניתן להשיג עם GCaMP ביולוגיים, GCaMP3 היה גנטית המקודדת תודרנית תחת כרובית מוזאיקת 35S האמרגן. הכלים גנטית למחקר תודרנית מאפשרים ניתוח מולקולרית מפורט של Ca^{2 +} האותות נמדדת GCaMP3. בנוסף, ניתן לאבחן את החיישן GCaMP3 תחת מיקרוסקופ זריחה במקום מערכת קונאפוקלית costlier. פרוטוקול זה מאפשר כל רקמות הדמיה, חיוני בעת ביצוע ניסויים עם לחצים ביוטיים בשידור חי. הניסוי תוכנן כך העלים מנותקת מצמחים 35S::GCaMP3 הם צף במים, כדי למנוע בריחה חרקים וכדי להגביל האכלה לרקמות ספציפיות. שיטת המתוארים במאמר זה ולכן מאפשרת לניתוח של עלה Ca^{2 +} דינמיקה שהאכילה מאת שיפורט להלן מתייחס מ, וכתוצאה מכך האפיון של צמח הרומן איתות התגובה. בשיטה זו ניתן גם להתאים לעבודה עם לחצים ביוטיים אחרים, כגון מיני חרקים נוספים חיידקים פתוגנים, ועם רקמות הצמח אחרות, כגון שורשים.

Protocol

1. הכנה צמח (ימים 1 - 4)

ביום 1, לחטא 35S::GCaMP הזרעים באמצעות שלושה 75% אתנול שוטף, 1 דקה לכל לשטוף, וצלחת אותם על 100 מ מ ² כיכר צלחות פלסטיק עם Murashige ¼-כוח, Skoog (MS) בינונית (מתכון: 1.1 גר' Murashige ו- Skoog בינוני, 7.5 גר' סוכרוז, 10 גרם של אגר Formedium, ו- 1 L מים מיוננים) ³⁷.
Stratify את השתילים בחושך במשך שלושה ימים ב 8 ° C כדי להשיג נביטה סינכרונית.
ביום 4 של הניסוי, להעביר את השתילים GCaMP חדר בסביבה מבוקרת (CER) ב- 23 ° C, עם 16 h כהה אור ו- 8 h photoperiod.

2. . גידול חרקים (ימים 11 - 12)

ביום 11 של הניסוי, להוסיף למבוגרים 15 מ' שיפורט להלן מתייחס בן בשבוע-5 אדמה שגודלו תודרנית צמחים באמצעות אמן לחה ' s המכחול (גודל 2 או 4) (גדל CER ב 22 ° C עם 10 h אור ו- 14 h photoperio כהה ד).
לכלוא הכנימות על הצמח על ידי הנחת צינורות פלסטיק שקוף (10 ס מ x 15 ס מ) סביב הצמח כובע עם מכסה פלסטיק.
לעזוב את הצמחים שורצי כנימות עלה במשך 24 שעות ביממה ב CER ב 22 ° C עם 16-h אור, photoperiod כהה 8-h.
ביום 12 של הניסוי, להסיר כל מבוגר מ שיפורט להלן מתייחס שימוש במכחול.
הערה: חרקים ניתן לראות בעין על הצמח. זה נותן אוכלוסיה של נימפות עם עידן התפתחותיות דומות. בערך נימפה 1 למבוגר יופק בתקופה זו.
לעזוב את הצמחים שורץ ב CER בטמפרטורה נמוכה יותר ב 16 ° C, עם 8 שעות אור ו- 16 h כהה photoperiod, כדי למנוע הנימפות של הגדלת גודל מהר מדי.

3. העלה ניתוק (19 יום)

ביום 19 של הניסוי, להסיר את השתילים 35S::GCaMP3 CER ולנתק העלה הגדול ביותר של כל צמח בעזרת זוג מספריים חדים.
בעזרת זוג מספריים, מקום העלה מנותקת לתוך הבאר של צלחת 96-ובכן המכיל 300 µL של מים מזוקקים, משטח abaxial פונה כלפי מעלה. חזור על עלים נוספים ( איור 1).

איור 1: Assay עלה 35S::GCaMP3. העלה הגדול ביותר של כל שתיל תודרנית בת 16 35S::GCaMP3 מנותק, צף על 300 µL של מים מזוקקים לתוך צלחת 96-ובכן. תמונה שצולמה ביום שאחרי הניתוק. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

לכסות את הצלחת ברור ניילון נצמד, נייר אלומיניום ומשאירים בטמפרטורת החדר לילה כדי לאפשר את הלחץ של הניתוק תתארך.

4. קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ (ימים 20 - 22)

ביום 20 של הניסוי, הסר את לוחית 96-ובכן של האלומיניום, להעביר אותו stereomicroscope-ידי קרינה פלואורסצנטית. קביעת תצורה של זריחה סטריאו מיקרוסקופ כדי לרגש GFP עם 450-490 nm אור, כדי ללכוד את פליטת פלורסנט בין 500 ו- 550 ננומטר.
לאסוף כנימות בני המושבה נוסדה ביום 11 על ידי הסרת את המפעל מן הקרקע והצבתו בקופסה שקופה עם מכסה. לשמור את החרקים הכלולים בתיבה בעת ביצוע הניסוי.
למקם את הצלחת 96-ובכן תחת המיקרוסקופ. לשנות את החשיפה אור עד זריחה GCaMP3 ניתן לאבחן בבירור בעורקיהם של העלים מנותקת. לשמור את החשיפה קבועה עבור כל הניסויים; עבור פרוטוקול הנוכחי, חשיפה 1-s היה בשימוש עם רווח של 3.5 ( איור 2).
להתאים את ההגדלה ואת זום של המיקרוסקופ כזה יכול להיות שנצפו 4 בארות במסגרת אחת; עבור פרוטוקול הנוכחי, שימש של 7.8-הגדלה ומוקד של-127.833 מ-
להעביר כנימות עלה אחד עלה מנותקת תחת המיקרוסקופ באמצעות מכחול לח. להשאיר עלה סמוכים לא מטופל כפקד, אך נוגעים זה בעדינות במכחול כדי לחקות את הנגיעות המתרחשת במהלך העברת כנימות עלה. יש לזכור להניח ניילון נצמד מעל לצלחת 96-ובכן במהלך מיקרוסקופ כדי למנוע את החרק לברוח.
להתחיל בה את ההקלטה זריחה של העלים בזוגות (שטופלו כנימות עלה 1 ו- 1 לא מטופל) על ידי לחיצה " להתחיל ניסוי " בתוכנה מיקרוסקופ מובנה ( איור 2). הקלט מדידות עבור 50 דק
הערה: עבור פרוטוקול הנוכחי, מרווח זמן של 5 s בין מדידות שימש.
לאחר 50 דקות, לעצור את ההקלטה על ידי לחיצה על " לעצור את הניסוי " ולהסיר את כנימות עלה מן העלה. להציל את מדידות קרינה פלואורסצנטית כקבצי תמונה (למשל, מתויג תבנית קובץ תמונה, TIFF).
חזור על הניסוי עם עוד זוגות של עלים; הדמיה ניתן להרחיב את התמונה 2 זוגות של עלים בבת אחת, המאפשרות ההדמיה בו זמנית של 2 אחרים.

5. איסוף נתונים

לייבא את קבצי התמונה פיג'י (תמונה J) ו להמיר אותם ל- 32 סיביות על-ידי לחיצה על " תמונות " > " סוג " > " 32-סיביות; " זה מאפשר ההמרה של התמונות לתוך heatmap קטעי וידאו (ראה שלב 7).
למחוק את הדגימות שבו הכנימות אל תתפשר במיקום אחד עבור יותר מ 5 דקות על-ידי הצגת התנועה חרקים במיקרוסקופ.
הערה: זהו לרוב המכריע של דגימות, עד 100 טיפולים עשויים להידרש כדי למצוא 30 דוגמאות המציגות מוצלח ליישב.
קבע קנה המידה פיקסלים (או המר מ"מ, אם ידועה) ואת את מסגרת הזמן מרווח הזמן באותו המשמשים במהלך מיקרוסקופ על ידי לחיצה על " תמונות " > " מאפיינים. "
באמצעות הסמן, למקם אזור בעל עניין (ROI) מסביב לאזור של רקמות לניתוח GFP.
הערה: בפרוטוקול הנוכחי, פיקסלים 50 רועי מעגלית (0.65 מ"מ) בקוטר שימש ב 3 מקומות עניין: מימדיה האכלה באתר (Fs) אזור מערכתית-midrib של העלה (Sm), אזור מערכתית הסמוך midrib (" לרוחב רקמות " Sl) ( איור 2).
1. צור רועי על ידי ציור אליפסה (להשתמש " הכלי אליפסה "), ולערוך את גודל באמצעות " לערוך " > " בחירה " > " ציין. " ראה איור 2.
עבור הפקד אינו מטופל, בחר ROIs באזורים דומות של העלה את אלה שנבחרו על העלה שטופלו (קרי, באותו האזור של העלה כמו איפה מימדיה ניזונו העלה שטופלו) ( איור 2).

איור 2: ניתוח GCaMP3 זריחה תחת המיקרוסקופ. משמאל: שליטה ללא טיפול עלה. מימין: שטופלו כנימות עלה עלה. כנימות עלה האכלה האתר מזוהה עם חץ. סרגל קנה מידה = שדה בהיר תמונה 1 מ מ. (א). הגדלה: 7.8 X, להתמקד:-127.833 מ מ, חשיפה: 1 ס' (B) GFP תמונה showing ROIs המשמש לניתוח כמותי של זריחה. Fs = האתר האכלה, Sm = midrib מערכתית, Sl = רקמות לרוחב מערכתית. הגדלה: 7.8 X, להתמקד:-127.833 מ מ, חשיפה: 1 s. ה-GFP התרגש באמצעות 450 עד 490 nm הליד, פליטה פלורסנט נלכד בין 500 ו- 550 ננומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

להשתמש תוסף מנתח סדרות זמן על-ידי לחיצה על " תוספים " > " הזמן סדרה מנתח " כדי לנתח את הערכים פלורסצנטיות raw (נ) רועי לאורך זמן. הוסף את רועי עניין (" הוסף [t] "). מוודא כי רועי נבחרה, בחר " לקבל ממוצע; " זה יציג טבלה של ערכי F עבור כל מסגרת זה רועי.
להעתיק את הנתונים לתוך גיליון אלקטרוני-
לחשב את השטח של האות האכלה באתר על-ידי בחירה ראשונה את האזור באמצעות " כלי בחירה חופשי. " המתאר את האות ה-GFP מקסימלי, ואז לחשב את השטח של צורה זו על ידי לחיצה " ניתוח " > " מידה. "
לחשב את המהירות של האות האתר האכלה באמצעות התוסף MTrackJ על-ידי לחיצה על " תוספים " > " מעקב " > " MTrackJ. "
1. לחץ על " Add " הלחצן ולאחר מכן לחץ על הסמן במרכז האות כאשר זה קודם גלוי. לחץ שוב על הקצה של האות בנקודה של הרחוק להתפשט. לחץ על " מידה " כדי לחשב את המהירות של האות.

6. ניתוח נתונים

הגדר נקודת של כנימות עלה להתיישב על ידי משחק דרך מסגרות תמונה של המיקרוסקופ בפיג'י.
הערה: הזמן ליישב הוא המסגרת שבה מימדיה נשאר במיקום יחיד במשך 5 דקות או יותר. משך הזמן ליישב אירועים ניתן גם לחשב את התמונות בפיג'י.
לנרמל את הנתונים F (ΔF/F) לפי המשוואה ΔF/F = (F - F ₀) /F ₀, איפה F ₀ זריחה בסיסית הממוצע מחושב מן הממוצע של F על המסגרות 60 ההקלטה לפני מימדיה התיישבו. . אני חוזר עבור הפקד אינו מטופל.
מגרש של קרינה פלואורסצנטית GFP מנורמל (ΔF/F) במשך הזמן הזה רועי ב העלה טיפול ללא טיפול. למחוק דוגמיות (שני עלים) אם הפקד אינו מטופל מראה גדולה Ca ^{2 +} תופעות מעבר (קרי, ΔF/F עולה מעל 0.2).
חזור עד יש כבר ניתחו דגימות קיימא לפחות 20-30 לכל גנוטיפ.

7. זמן-קורס וידאו הבריאה

המרה של קבצי תמונה 32 סיביות לתוך heatmaps באמצעות התוסף NucMed_Image LUTs על-ידי לחיצה על " תוספים " > " NucMed " > " טבלאות בדיקת מידע. " טבלאות בדיקת מידע בתפריט, בחר " כחול אדום ירוק " כדי להמיר התמונות מפות חום.
שפר החדות של heatmap כדי לסמן GFP של כנימות עלה-elicited אותות באמצעות " תהליך " > " לשפר את הניגודיות " > " להתאים פיקסלים רווי %. "
הוסף פרטי באמצעות התוסף סטמפר זמן על-ידי לחיצה על " תוספים " > " הזמן סטמפר ". להגדיר " זמן ההתחלה "-" 0 " ו " מרווח " מבוסס על מרווח הזמן המשמש את מיקרוסקופ (למשל, 5 s).
ייצוא וידאו זה כמו וידאו וסאונד interleaved (אבי) קובץ.
הערה: וידאו זה ואז ניתן לערוך בהמשך חבילות תוכנה אחרות (למשל, Microsoft Movie Maker).

Representative Results

איור 3 ו איור 4 הם נציג תוצאות ניסוי השוואה של עלה שטופלו כנימות עלה עם פקד ללא טיפול. ניתן לראות גידול מקומי מאוד של קרינה פלואורסצנטית GFP סביב האתר האכלה בתוך דקות ספורות, ברוב המכריע של דגימות, בעוד הדינמיקה^{2 +} Ca בהשהייה עלה שליטה שאינו מטופל יציב יחסית (איור 3A ו- 3B). . זה גם ניתן לצפות משני מגדיל ב GFP פלורסצנטיות לאחר הפסגה הראשונית כמה ניסויים (איור 3B). עד 50% שטופלו עלים, הכנימות אל תתפשר, צריכים להיות מושלך הדגימות. של הדגימות ביישוב שבו מתרחשת, 27% של דגימות לא מוצג מגביר ברור ב- GFP פלורסצנטיות סביב האתר האכלה (איור 3C ו לטבלה 1); לכן, דגימות שכפל 25-30 צריך להיות בממוצע עבור ניתוח כמותי. ויזואליזציה של האזור ואת המהירות של גובה_cyt האתר [Ca^{2 +}] ההאכלה אמורים לגלות אות של מיקרומטר בסביבות 110 שנוסעות 6 מיקרומטר/s (טבלה 1). בנוסף, אין_cyt הגבהים [Ca^{2 +}] שיזוהו מערכתית בתוך העלה על כנימות עלה הטיפול, גם את midrib מערכתית (איור 4A) או האזורים רקמות לרוחב מערכתית (איור 4B). מדגם מייצג של [Ca^{2 +}]_cyt דינמיקה לאורך זמן מוצג 1 וידאו. . זה גם מאפשרת לנתח את התנהגות שיקוע כנימות עלה על-ידי מעקב אחר את המספר ואת משך הזמן של אירועים שיקוע בודדים מתחת למיקרוסקופ. נציג תוצאות עבור התנהגויות אלו מוצגים בטבלה 1, מראה כי הכנימות לקחת בערך 10 דקות לפני, כאשר הם מיישבים בהצלחה, זה נמשך במשך 20 דקות בממוצע. לכן, החרקים הם התיישבו מיקום בודד מכלול של גובה_cyt[Ca^{2 +}].

איור 3: GCaMP3 ניתן להשתמש כדי לזהות כנימות עלה-elicited Ca^{2 +} אותות באתר האכלה ב משאיר מנותקת. שמאל: עקבות נציג (n = 30) של זריחה GFP מנורמל (ΔF/F) סביב האתר האכלה של עלה 35S::GCaMP3 . העקבות להציג 5 דקות לפני עד 25 דקות שלאחר ליישוב. שליטה = מיקום מקביל על עלה לא מטופל 35S::GCaMP3 . מימין: stereomicroscope נציג תמונה של [Ca^{2 +}] העלאת_cyt נראו בסביבה כנימה האכלה באתר על עלה 35S::GCaMP3 . ידי קרינה פלואורסצנטית GFP מסומן בצבע לקנה שיבוץ. מזהה כנימות עלה המתוארים לבן, האכלה באתר המצוין עם חץ. הגדלה: 7.8 X, להתמקד:-127.833 מ מ, חשיפה: 1 s. ה-GFP התרגש באמצעות 450 עד 490 nm הליד, הפליטה פלורסנט נלכד בין 500 ו- 550 ננומטר. (א) דוגמה גדול הנוצרות על-ידי כנימות עלה [Ca^{2 +}]_cytגובה. העלאת_cyt(B) הוא דוגמה ממוצע הנוצרות על-ידי כנימות עלה [Ca^{2 +}]. (ג) דוגמה אין הנוצרות על-ידי כנימות עלה [Ca^{2 +}]_cytהעלאת רמת הרשאות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

פרמטר	ממוצע (± SEM)
[Ca^{2 +}] _cyt העלאת
אחוז הדגימות הצגת העלאת_cyt [Ca^{2 +}]	73%
המהירות של חזית הגל	5.9 מיקרומטר/s (± 0.6)
שטח מרבי של התפשטות	מיקרומטר 110² (± 18)
התנהגות כנימות עלה
מספר ומשתרר (> 5 דקות)	2 (± 0.1)
המספר הכולל של ומשתרר (כל המשכים)	3.8 (± 0.4)
הזמן התיישבו הדמיה ^b	20 דקות (± 2)
עד ליישב הראשונה ^c	11 דקות (± 1.4)
אחוזי הזמן הכולל התיישבו	62% (± 3)

טבלה 1: [Ca^{2 +}]_cytגובה ופרמטרים כנימות עלה התנהגות במהלך 35S::GCaMP3 הדמיה. פרמטרים שמחושבים דוגמאות קיימא אשר שיקוע של > 5 דקות אירעה. מהירות (A) של האות גלוי מנקודת של חניכה אל הנקודה הרחוקה ביותר של התפשטות. משך הזמן של האירועים שיקוע ראשוני המשמש לניתוח של קרינה פלואורסצנטית (B). (ג) משך הזמן בין תחילת הדמיה על מימדיה הראשון להתיישב. [Ca^{2 +}] _cytהעלאת נתונים שהוגשו בעבר תא צמח (מצב נוכחי: îøõ QC).

איור 4: GCaMP3 אינו יכול לזהות כנימות עלה-elicited Ca^{2 +} אותות מערכתית לאתר האכלה. עקבות נציג (n = 30) של זריחה GFP מנורמל (ΔF/F) במיקומים מערכתית מימדיה האכלה אתר ב יוצא 35S::GCaMP3. העקבות להציג 5 דקות לפני עד 25 דקות שלאחר ליישוב. שליטה = מיקום מקביל על עלה לא מטופל 35S::GCaMP3 . (א) ΔF/F באזור midrib מערכתית. (B) ΔF/F אזור הרקמה לרוחב מערכתית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Screenshot
וידאו 1: GCaMP3 Florescence לאורך זמן כהזנות כנימות עלה. ידי קרינה פלואורסצנטית GFP מסומן בצבע לקנה שיבוץ. המיקום של אתר האכלה כנימות עלה מזוהה עם חץ. משמאל: 35S::GCaMP3 עלה חשוף של מסיה שיפורט להלן מתייחס למבוגרים. מימין: 35S::GCaMP3 הבקרה לא-כנימות עלה עלה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)

Discussion

השיטה המתוארת במאמר זה מאפשר ניתוח בזמן אמת של הצמח Ca^{2 +} איתות במהלך מתן דגש ביוטיים כגון חרקים. הוא מדגים כי באחת התגובות הצמח הראשון איומים שכאלה הוא המותאמות לשפות אחרות [Ca^{2 +}]_cyt העלאת סביב האתר האכלה של החרק. באמצעות מוטציות, יאפשר בשיטה זו האפיון פיזיולוגיים המולקולריים של אותות כאלה, דבר שלא היה אפשרי בעבר. שלב קריטי ב פרוטוקול זה נועד להבטיח כי העלים מנותקת אינם מופרעים בצורה מוגזמת במהלך תהליך הניתוק (שלב 3.2) או בעת העברת חרקים העלים (שלב 4.5). בהתחשב בכך הפרוטוקול הנוכחי מספק מדידה יחסית [Ca^{2 +}]_cytולא של ריכוז מוחלט, זה חיוני כי ההגדרות מיקרוסקופ נשמרים קבועה לאורך כל הניסוי. יש גם פוטנציאל נטאי אנושי במהלך בחירת ROIs וניתוח של הנתונים, ככזה, מומלץ כי מתבצעות כפול סמיות.

ישנם מספר יתרונות משמעותיים של מדידה [Ca^{2 +}]_cytבמהלך ללחץ ביוטיים עם פרוטוקול זה. ראשית, השימוש fluorophore יחיד עם פלורסנט תשואה גבוהה מאפשרת ההדמיה להתנהל על stereomicroscope, אשר הוא פחות יקר מאשר באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי. השימוש fluorophore יחיד מאפשר גם לאיסוף וניתוח הנתונים פשוטה, כפי שיש מדידה אחת רק כדי להקליט. בנוסף, השימוש stereomicroscope מאפשר ההדמיה של עלים כולו, שהוא חיוני לאור העובדה אינטראקציות ביוטיים רבים, כולל אינטראקציות צמח-כנימות עלה, להתרחש בקנה מידה גדול מרחבי. הרזולוציה הגבוהה הטמפורלי של התמונה ללכוד אפשרי עם GCaMP3, בהתבסס על השיוך מהירה של Ca^{2 +} חיישן לאחר איגוד²³^,³⁰ ו את התשואה נמכרות גבוהה, מאפשר למדידות להילקח עד כל 5 s. יתר על כן, וזמינותו עלה מונע הבריחה של החרק, מפתח הגבלת צעד כזה ניסויים על כל הצמחים^(בהכנה). העלים מנותק גם להבטיח כי החרק ניזון ממיקום מוגדר מראש, המאפשר הניתוח של Ca^{2 +} דינמיקה לפני, במהלך, ואחרי האכלה. פרוטוקול זה גם מבטיח כי עלים של שלבים התפתחותיים דומים משמשים לצורך ניתוח.

החיסרון העיקרי של פרוטוקול זה מקורו של השימוש ביוסנסור הלא-רציומטרי. עם יחיד-FP ביולוגיים, וריאציה של פליטה GFP העלולות לנבוע משתני הניסוי חוץ [Ca^{2 +}]_cyt, כגון שינויים השתגעת לגמרי, תנועה או את רמת הביטוי החיישן. נושאים אלה הם לא נתקלתי עם סריג Cameleons במהלך סריג, כמו ההעברה של אנרגיה מן CFP ל YFP מתרחשת רק בעת Ca^{2 +} מחייב. מצבים אחרים לשנות את מאפייני fluorophores בודדים פלורסנט צפויים לחקות את השינויים מנוגדות בעוצמתם של CFP, YFP ולאחר בחישוב רציומטרי המשמש מטבעו מווסת את המידות עבור רבים מהם אחרים²³^,אופטי חפצים³⁰. זה הופך את הערכות של מוחלטת [Ca^{2 +}]_cytאמינה יותר עם סריג Cameleons. כתוצאה מכך, GCaMP3 הטוב ביותר משמש ביוסנסור למדוד יחסית [Ca^{2 +}]_cyt, למרות שזה עדיין מספיק כדי לזהות ולאפיין תופעות ביולוגיות⁵צמחים^{,(in preparation)}. לכן, זה חיוני כדי להשתמש בפקדים כדי להציג את האפקט הנצפה עקב Ca^{2 +}, כולל Ca^{2 +}-הקשורים מוטציות גנטיות^(בהכנה) או תרופתי Ca^{2 +} ערוץ מעכבי כגון La^{3 +}. חשוב, יחיד-FP ביולוגיים בדרך כלל להציג תשואה פלורסנט גדול וחדר גדול טווח דינמי (קרי, עלייה florescence על Ca^{2 +} איגוד) מאשר סריג Cameleons²³, מה שהופך את GCaMP המתאים רקמות ברמת הדמיה, בעוד סריג Cameleons הם כלי שימושי עבור הדמיה הסלולר עם מיקרוסקופ קונפוקלי⁵^,²⁵.

במהלך הביצוע של פרוטוקול זה, זה אפשרי כי בעיות יקום הדורשות פתרון בעיות. לדוגמה, מומלץ כי דגימות שבו השליטה (מטופל) עלה מוצג גדול [Ca^{2 +}]_cytהגבהים שנמחקו (שלב 6.3). תופעות מעבר כזה הן ככל הנראה התוצאה של הלחץ הנגרם על ידי מיקרוסקופ. ואכן, האור הכחול ידוע שמעודדים Ca^{2 +} אותות³⁸^,-³⁹^,-⁴⁰^,-⁴¹, האור בעוצמה גבוהה עשויה גם לגרום טמפרטורה, מדגיש osmotic, אשר שניהם גם להפיק [Ca^{2 +}]_cyt הגבהים²¹^,²⁵^,⁴². כתוצאה מכך, להפחתת לחצים כזה, חשוב לערוך את הניסוי בחדר מאוורר היטב, טמפרטורה מבוקרת וכדי למנוע פעמים חשיפה ארוכה שלא לצורך. חשוב גם לא לשבש את העלים בצורה מוגזמת במהלך ניתוק או במהלך של מיקרוסקופ כדי למנוע מגע-elicited [Ca^{2 +}]_cyt הגבהים⁴³^,⁴⁴^,⁴⁵. ייתכן גם נתקל בעיות עם חרקים ליישוב. עם מ' שיפורט להלן מתייחס, החרקים אל תתפשר על העלים מספר הדגימות. זה יכול להיות תוצאה של הפצע-elicited ההגנה⁴⁶^,את העלים מנותקת⁴⁷, או ההפרעה של החרקים באור כחול. אכן, חזון שיפורט להלן מתייחס מ נשלטת על ידי שלוש photoreceptors, כולל אחת עם רגישות שיא של 490 nm⁴⁸. הפחתת החשיפה מיקרוסקופ וטיפול הכנימות עם טיפול עשוי להפחית מצוקה ולעודד ליישוב.

פרוטוקול שמתואר הנייר הנוכחי נותן תובנות חדשות על ההבנה מולקולרית של אינטראקציות צמח-חרק ואת התגובה צמח ללחץ ביוטיים. זה מאפשר החזיית באחת התגובות הצמח הראשון להאכיל חרקים ו מקלה עוד יותר חקירות באמצעות שימוש ניכר תודרנית גנטי המשאבים הזמינים. בנוסף, פרוטוקול זה מאפשר השימוש של אורגניזמים חיים, בניגוד תמציות⁴⁹ או elicitors⁵⁰. בעתיד, טכניקה זו יכול להיות מיושם מדגיש ביוטיים אחרים, כגון מיני חרקים נוספים, נמטודות או חיידקים פתוגנים, וכן מדגיש והאביוטיים. כן, ניתן לשנות את מיקרוסקופ GCaMP3 לשיקוף רקמות הצמח אחרות, ROIs אלטרנטיבית על עלה או צמחים שלמים אפילו. יתר על כן, יש הפוטנציאל החיישן להיות תורשתיly המקודדת מיני צמחים נוספים. כתוצאה מכך, פרוטוקול המתוארים במאמר זה יש פוטנציאל סמוי הבסיס המולקולרי של Ca^{2 +} איתות בטווח של הרומן ביוטיים אינטראקציות בין צמחים לבין מינים אחרים.

Disclosures

המחברים יש שאין ניגודי אינטרסים להכריז.

Acknowledgments

ברצוננו להודות גרנט קלדר (ג'ון אינס מרכז, בריטניה) על העצה בנושא מיקרוסקופ. המחברים גם רוצים להודות את ג'ון אינס הגננות ומרכז המחלקות לאנטומולוגיה לסיוע שלהם. עבודה זו נתמכה על ידי studentship PhD מן ג'ון אינס קרן (בטלויזיה), מענק B/JJ004561/1 של BBSRC ושל קרן ג'ון אינס (טלוויזיה, M.A., ג'יי, בארקדיה, תרגום, ט. מ, ד. ש.), שנה בהצבה התעשייה מ ג'ון אינס מרכז (M.A.) , studentship הקיץ מן האגודה הביוכימי של בריטניה (ג'יי), JST פרסטו (מ. ת), מענקים MCB 1329723 ו- IOS-1557899 של הקרן הלאומית למדע (מ. ת ו ש. ג).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
35S::GCaMP3 Arabidopsis	John Innes Centre/Universty of Wisconsin	-	Step 1.1
100 mm² square plastic plates	R & L Slaughter Ltd, Upminster, UK		For growing GCaMP plants (Step 1.1)
¼ strength Murashige and Skoog (MS) medium	homemade: 1.1 g Murashige and Skoog medium, 7.5 g sucrose, 10 g Formedium agar, 1 L de-ionised water	-	For growing GCaMP plants (Step 1.1)
Col-0 Arabidopsis	-	-	For growing aged aphid colony (Step 2.1)
Myzus persicae(Sulzer)	clone US1L, Mark Stevens, Brooms Barn	-	Orginally from Rothamsted Research, UK (Step 2.1)
Artist's paintbrush size 2	Hobbycraft	610101	To tranfer aphids (Steps 2.1, 2.4 and 4.6)
96-well MicrotitreTM plate	ThermoFisher Scientific	2101	To contain the detached GCaMP3 leaves (Step 3.2)
Aluminium foil	Wrap Film Systems, Telford, UK	26B06	To cover plates with floating leaves overnight (Step 3.3)
Clear plastic wrap	SC Johnson & Son, Racine, WI, USA		To cover plates with floating leaves overnight, and to cover leaves during microscopy (Steps 3.3 and 4.7)
M205FA stereo microscope	Leica Microsystems	-	For GFP imaging (Step 4.1)
Leica Application Suite v3.2.0	Leica Microsystems		Microscope software (Step 4.1)
Fiji (Image J) v1.48a	National Institutes of Health, USA)	-	For image analysis (Step 6.1)