Summary
Este protocolo descreve um meio clinicamente aplicável de dissolver compostos hidrofóbicos em um ambiente aquoso, usando combinações de montagem auto soluções de peptídeos e aminoácidos. Nosso método resolve uma limitação importante da terapêutica hidrofóbica, desprovidas de meios seguros e eficientes de solubilidade e entrega métodos em situações clínicas.
Abstract
Peptídeos auto-montagem (SAPs) são veículos promissoras para a entrega da terapêutica hidrofóbica para aplicações clínicas; suas propriedades de anfifílicos lhes permitem dissolver compostos hidrofóbicos no ambiente aquoso do corpo humano. No entanto, soluções de peptídeo auto-montagem tem compatibilidade de sangue pobre (e.g., baixa osmolaridade), dificultando sua aplicação clínica através de administrações intravenosas. Recentemente desenvolvemos uma plataforma generalizada para a entrega da droga hidrofóbico, que combina sucos com soluções de ácido aminado (SAP-AA) para aumentar a solubilidade da droga e aumentar a osmolaridade de formulação para atingir os requisitos para usos clínicos. Esta estratégia de formulação foi exaustivamente testada no contexto de três compostos hidrofóbicos estruturalmente diferentes – PP2, rottlerin e curcumina – a fim de demonstrar a sua versatilidade. Além disso, examinamos os efeitos das variações de componentes de formulação, analisando 6 sucos diferentes, 20 aminoácidos existentes naturalmente em concentrações baixas e altas e dois diferentes co-solventes dimetil sulfóxido (DMSO) e etanol. Nossa estratégia provada para ser eficaz na otimização de componentes para uma determinada droga hidrofóbica e função terapêutica do inibidor formulado, PP2, observou-se tanto em vitro como em vivo. Este manuscrito descreve nosso método de formulação generalizada usando combinações de SAP-AA para compostos hidrofóbicos e análise de solubilidade como um primeiro passo para o potencial de uso destas formulações em estudos mais funcionais. Nós incluir resultados representativos de solubilidade para formulação da curcumina composta, hidrofóbica e discutir como nossa metodologia serve como plataforma para futuros estudos biológicos e modelos de doença.
Introduction
Sucos são uma classe de biomateriais que tem sido estudada extensivamente como andaimes 3D na medicina regenerativa,1,2,3,4. Mais recentemente, no entanto, eles têm sido explorados como veículos para a entrega da terapêutica devido a suas propriedades biológicas únicas5,6,7,8. RPUS naturalmente montam em nanoestruturas estável9, proporcionando assim um meio de proteção e encapsulamento de drogas. Sucos são anfifílicos, composto por um padrão específico de repetições de aminoácidos hidrofóbicos e hidrofílicos, dirigindo seus auto-montagem de9,10 e permitindo-lhes servir como um meio entre hidrofóbica e hidrofílica ambientes. Consequentemente, para a entrega de clínica de fármacos hidrofóbicos – que têm extremamente baixa biodisponibilidade e absorção no corpo devido à falta de solubilidade em ambientes aquosos11,12 – sucos são promissores como uma entrega veículo. Além disso, o seu padrão de sequência também implica que sucos podem ser racionalmente concebidos e projetados para maximizar a compatibilidade com qualquer determinada droga ou composto (ou seja, com base em grupos funcionais) e ajudar ainda mais a solubilidade.
RPUS foram aplicados como veículos de entrega de droga eficaz em muitos in vitro e in vivo configurações13,14,15,16. Eles também têm demonstrado grande segurança e biocompatibilidade. No entanto, devido à baixa osmolaridade de preparações de SAP-droga, eles não podem ser usados para injeções intravenosas como em situações clínicas13. Considerando esta restrição, recentemente desenvolvemos uma estratégia que combina sucos com soluções de aminoácidos para reduzir o uso de solventes tóxicos co e aumentar a osmolaridade de formulação e, portanto, relevância clínica. Nós escolheu usar aminoácidos como eles são os blocos de construção de sucos, já são clinicamente aceitos, e em combinação com sucos, eles aumentam a solubilidade da droga hidrofóbico enquanto reduzindo a quantidade de SAP necessários17,18.
Podemos ter analisadas combinações de SAP-AA como uma plataforma generalizada de solubilidade da droga hidrofóbicas e subsequente entrega criando um pipeline de várias etapas de triagem e aplicá-lo ao inibidor Src, PP2, como um composto hidrofóbico de modelo. Neste processo, nós examinamos o efeito de alterar componentes da formulação – testes, finalmente, 6 sucos diferentes, todos os 20 aminoácidos em 2 concentrações diferentes (baixa e alta; baixo baseados em concentrações nas aplicações clínicas existentes e alta as concentrações foram 2x, 3x ou 5x a concentração clínica baseia-se a solubilidade máxima de cada aminoácido na água) e 2 diferentes co-solventes – e combinações selecionadas que solubilizado PP2 para posterior análise. Esta formulação de droga provou para ser eficaz como um veículo de entrega de drogas em cultura de células, bem como na vivo modelos usando administrações tanto intratraqueal e intravenosa. Da mesma forma, nosso trabalho focou a versatilidade de combinações de SAP-AA em múltiplas solubilizante, estruturalmente diferentes compostos hidrofóbicos em ambientes aquosos; especificamente, as drogas rottlerin e curcumina18. Este manuscrito descreve o método de formulação de SAP-AA e a análise de solubilidade de curcumina como exemplo da etapa principal no nosso pipeline de triagem. Este protocolo fornece uma maneira simples, pode ser reproduzida de tela para as combinações ideais de SAP-AA, que dissolvem qualquer determinado composto hidrofóbico.
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Protocol
1. preparação de soluções de aminoácidos
- preparar e rótulo dois centrifuga conico tubos de 50 mL para cada aminoácido (um de cada para ambos " baixa " e " alta " concentrações).
- Preparar um grande frasco de 2 L contendo água purificada (18,2 MΩ·cm a 25 ° C).
- Calcular a quantidade de cada aminoácido (em gramas) para atingir a concentração desejada e pesar a quantidade adequada de aminoácidos em seus tubos de centrífuga de 50ml respectivos usando uma espátula.
Nota: Para a " alta " concentração dos dois aminoácidos com carga negativa, PBS é usado em vez de água. Não poderíamos aumentar suas concentrações devido a sua baixa hidrossolubilidade e usando PBS em vez de água ajuda a manter o pH baixo. Além disso, os cálculos de concentração foram obtidos utilizando um volume final de 40 mL para cada solução de aminoácido. Todas as concentrações de aminoácidos são descritas na tabela 3. Certifique-se de enxaguar a espátula entre aminoácidos para evitar contaminação. Recomendamos uma lavagem de água, seguida de limpeza com etanol a 70%. - Adicionar 40 mL de água filtrada (ou PBS) em cada tubo de 50 mL com uma pipeta sorológica. Tubos e vórtice do tampão ou agitar vigorosamente até dissolver. Sonication banho de água (temperatura ambiente, 130 W, 40KHz) também pode ser usado para ajudar no processo de solubilidade.
Nota: As seguintes soluções de aminoácidos são sensíveis à luz e deve ser cobertas com folha de alumínio: triptofano, fenilalanina e tirosina (que consistem em estruturas de anel aromáticas) e cisteína (reativa - SH agrupar).
2. Preparação das soluções SAP-AA
- preparar 20 mL frascos de cintilação para montagem automática de peptídeos. Para um determinado peptídeo auto-montagem, preparar um frasco por solução de aminoácido preparado (cada combinação será feita em um frasco separado).
- Usando uma balança analítica de alta performance (com uma legibilidade até 0,1 mg ou menos), pesa aproximadamente 1 ± 0,2 mg de peptídeo no fundo de cada frasco. Cap após a pesagem e registrar o peso exato do peptide sobre o Cap...
- Pipetar o volume adequado de solução de ácido aminado (preparado na secção 1) para cada frasco contendo peptídeos, para atingir a concentração desejada de auto montagem peptídeo (0,1 mg/mL para peptídeos longos com um comprimento de 16 aminoácidos, ou 0,2 mg/mL para peptídeos mais curtos com um comprimento de 8 aminoácidos).
- Sonicate por 10 minutos em uma água banho sonicador (130 W, 40KHz) à temperatura ambiente, garantindo as soluções dentro de frascos são completamente imerso no banho-maria a.
3. Preparação de drogas-DMSO ou droga-etanol Stock soluções
- Combine 1 mg da droga (no caso, a curcumina com 100% DMSO) e outra de 1 mg com 100% de etanol para criar duas soluções estoque.
Nota: Nós adicionamos 200 µ l de DMSO e 400 µ l etanol DMSO-curcumina e etanol-curcumina existências que eram 5 mg/mL e 2,5 mg/mL, respectivamente, devido a variação de solubilidade em cada solvente; no entanto, é importante observar que a concentração de estoque deve ser ajustada dependendo da droga hidrofóbica de interesse. Fatores tais como a solubilidade da droga e eficaz concentração biológica são importantes na determinação deste valor. Também, mantenha na mente que as ações serão diluídas 100-fold e 50-fold em formulações de DMSO e etanol, respectivamente, quando combinada com soluções SAP-AA (ver secção 4). Isso pode ser preferido para preparar um maior volume de estoque, dependendo do número de formulações necessárias – neste caso, seria usado mais de 1 mg da droga. O estoque pode ser armazenado a-20 ° C; degelo no gelo e vórtice antes do uso. - Vortex frascos por 15 s para dissolver completamente a drogas.
4. Preparação de formulações de drogas
- preparar claros, tubos de microcentrifuga de 1,5 mL para cada formulação. Certifique-se de tubos de etiqueta com a pretendida auto montagem peptídeo, aminoácido (e concentração) e solvente co.
- Adicionar 10 µ l de estoque de drogas-DMSO ou estoque de drogas-etanol 20 µ l para tubos apropriado microcentrifuga.
- Adicionar 990 µ l das soluções ácidas de SAP-AA para o apropriado rotulado microcentrifuga tubos contendo ações de drogas-DMSO e 980 µ l para aqueles que contêm o estoque de drogas-etanol. Isto produz formulações de drogas de 1 mL com etanol a 1% DMSO ou 2%.
Nota: A concentração final de todas as formulações de curcumina foi 0,5 mg/mL de acordo com o protocolo. Novamente, isto pode variar quando usando outros compostos hidrofóbicos e/ou começando com uma concentração diferente de estoque (ver passo 3.1) - Vortex vigorosamente por 30 s e permitem formulações descansar por 30 min.
5. teste de solubilidade
- após o período de descanso, vórtice vigorosamente novamente por 30 s.
- Centrifugar as formulações a 14.220 x g por 1 min.
- Analisar o fundo do tubo para a precipitação microcentrifuga (por visualização).
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Representative Results
Para a droga hidrofóbica, curcumina, nós produzimos formulações usando todos os 20 existentes naturalmente aminoácidos em baixas concentrações, em combinação com apenas um SAP, EAK16-II, como uma prova de princípio. Nós também testamos formulações usando DMSO e etanol como co-solventes. No total, isso produziu 40 formulações de curcumina, cada um contendo diferentes componentes. É importante notar que, em nossos estudos anteriores usando o inibidor de Src, PP2, incluímos mais opções para SAP (total de 6) e a concentração do ácido aminado (clínicos, bem como uma maior concentração), que produziu um total de 480 diferentes formulações. Tendências do presente trabalho foram tidos em conta ao selecionar EAK16-II como o SAP para este estudo. As concentrações de vários componentes estão incluídas na tabela 1, tabela 2e tabela 3 como referência. Todas as formulações de drogas hidrofóbicos são selecionadas para a solubilidade da droga por visualização e consideradas solúveis se a solução está completamente livre de qualquer precipitado após centrifugação (Figura 1). Se a droga se precipita para o fundo do tubo, este é considerado não solúveis e não passam mais testes. Além disso, a solubilidade é testada em triplicado e por dois indivíduos diferentes; Se estes resultados não são reproduzíveis, formulações também não são consideradas ser verdadeiramente solúvel.
Fora as 40 formulações testadas neste estudo, 7 formulações com êxito dissolvido curcumina (tabela 4). Formulações de agrupamento por componentes identificadas duas tendências principais: etanol parece ser melhor co solvente para dissolver a curcumina e carregadas positivamente aminoácidos lisina (K) e arginina (R) também parecem ser componentes ideais para a dissolução de curcumina (tabela 4). é interessante notar a mudança de cor para formulações contendo R e K, que revelam a curcumina é dissolvida na condição alcalina (Figura 1). É útil para formulações de grupo por propriedades de vários componentes para fazer tais observações.
Figura 1 : Exemplo de análise de precipitação. Para estas formulações de curcumina contendo o peptídeo EAK16-II, etanol e carregada de aminoácidos, precipitado pode ser visto claramente nos tubos microcentrifuga após a centrifugação. Formulações contendo lisina (K), arginina (R) ou ácido aspártico (D) dissolver curcumina (nenhum precipitado), Considerando que aqueles contendo histidina (H) ou ácido glutâmico (E) não fazem (precipitar, circulado em vermelho). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Droga | Formulação de concentração (mg/mL) |
| PP2 | 0.05 |
| Curcumina | 0.05 |
| Rottlerin | 0.02 |
Tabela 1: Concentração de drogas usadas em formulações. Concentrações de formulação de drogas diferem que cada um tem uma concentração diferente de Bioativo e também as capacidades de carga diferentes.
| Peptídeo de auto-montagem | Propriedades | Formulação de concentração (mg/mL) |
| EAK16-EU | Família EAK, longa | 0.1 |
| EAK16-II | Família EAK, longa | 0.1 |
| EAK16-IV | Família EAK, longa | 0.1 |
| EFK8-II | EAK modificado, curto | 0.2 |
| A6KE | Surfactante-like, curto | 0.2 |
| P6KE | Surfactante-like, curto | 0.2 |
Tabela 2: concentração de montagem auto usados em formulações de peptídeos. Com a adição de aminoácidos, apenas pequenas concentrações de peptídeo auto-montagem são necessárias (0.1-0.2 mg/mL). Peptídeos mais curtos são dobro a concentração em comparação com peptídeos mais como eles têm a metade do comprimento de sequência (8 aminoácidos versus 16 aminoácidos).
Tabela 3: concentrações das soluções de aminoácidos utilizados em formulações. Baixas concentrações de aminoácidos foram escolhidas com base em aplicações clínicas existentes de cada um. Concentrações elevadas são 2x, 3x, ou 5 x concentração clínica e dentro a solubilidade máxima de cada aminoácido na água. Esta figura foi modificada de Pacheco et al . 18
Tabela 4: resultados representativos de solubilidade de curcumina. Um resumo das combinações SAP-AA que efetivamente dissolvidos curcumina após triagem para solubilidade. Esta figura foi modificada de Pacheco et al . 18
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Discussion
O procedimento de formulação, existem várias etapas críticas e pontos a serem considerados na solução de problemas. Primeiro, como estamos trabalhando com vários componentes e concentrações, várias etapas de vórtice em todo o protocolo certifique-se de que todas as concentrações são uniforme e correto. Algumas das soluções de aminoácidos hidrofóbicos, de alta concentração podem ainda não estar completamente dissolvidas após a utilização do vortex, e neste caso, eles podem ser agitados vigorosamente à mão para ajudar no processo de. Da mesma forma, é essencial que soluções SAP-AA submeter-se a etapa de sonication descrita no passo 2.4 como sucos, naturalmente, tendem a agregar e sonication ajudará no fragmentando clusters de SAP, resultando assim em uma solução mais uniforme. Em segundo lugar, para um determinado fármaco hidrofóbico, o estoque e concentrações finais dentro de formulações de SAP-AA devem depender da concentração eficaz de complexo em configurações biológicas. O protocolo deve ser modificado em conformidade para refletir esta concentração ativa. Além disso, a capacidade de carregamento de droga também é um fator importante a considerar; é provável que cada droga terá uma capacidade de carregamento único usando esta estratégia, e que cada combinação de SAP-AA pode suportar uma quantidade diferente de drogas com base na compatibilidade. Isto demonstra a importância do rastreio para encontrar a melhor combinação de SAP-AA para um determinado composto.
Há uma série de vantagens em usar nossa técnica sobre os outros; mais especificamente, há grande importância sobre o método convencional de usar sucos sozinhos para a entrega de encapsulamento e potencial de um composto. Como mencionado anteriormente, os aminoácidos são já clinicamente aceitos e adicionar essas soluções para formulações de SAP aumenta a osmolaridade para diminuir a atividade hemolítica, tal que injeções intravenosas em cenários clínicos são possíveis. Também achamos que eles aumentam significativamente a solubilidade de compostos hidrofóbica em casos onde o SAPs sozinhos são insuficientes para a solubilidade17,18. As vários diferentes combinações de sucos e aminoácidos envolvidos permite a expansão em um método de alta produtividade para tela de solubilidade da droga hidrofóbicas. Dados de solubilidade podem ser analisados em detalhe para revelar tendências; Nós achamos que classificar resultados por componente da formulação (SAP ou aminoácido) mostra um padrão susceptível de ser exclusivo para cada fármaco hidrofóbico. Por exemplo, aminoácidos carregados positivamente melhorar a solubilidade de curcumina (Figura 1), Considerando que nossos estudos anteriores mostraram que aminoácidos carregados negativamente eram melhores para PP218. Estas tendências podem ajudar a determinar a adequação de componentes específicos para dissolução drogas com estrutura química semelhante. Além disso, a simplicidade de nossa tela de solubilidade é uma vantagem e uma limitação; Embora seja fácil de realizar, existem maneiras mais técnicas e precisas para avaliar experimentalmente a solubilidade de um composto em solução (por exemplo, espectroscopia ou métodos cromatográficos). No entanto, a estratégia de triagem descrita neste protocolo permite a seleção rápida e eficiente de combinações de SAP-AA, que resultam na maior solubilidade da droga e por conseguinte, a maior atividade biológica potencial para posterior análise. Como existem inúmeras formulações de diferentes combinações de montagem auto peptídeo, aminoácido, aminoácido concentração e solvente co, (480 total no nosso anterior manuscrito18), este é um passo necessário para estreitar-se abaixo para encontrar o ideal componentes para um determinado medicamento. Depois de encontrar formulações de drogas solúveis, eles podem ser avaliados para solubilidade por métodos mais técnicos e devem ser ainda mais validados em ensaios funcionais, que avaliam a segurança e a actividade biológica. Estes ensaios funcionais devem ser adaptados para o uso pretendido da droga formulado, conforme descrito em nosso manuscrito otimizando formulações de PP218. Expandir nossa plataforma em outros compostos hidrofóbicos irá revelar tendências adicionais e mecanismos para melhorar a solubilidade e auxiliar na engenharia SAPs novas formulação clínicos específicos compostos hidrofóbicos.
Entregar o futuro do nossos método mentiras no pipeline de potencial para drogas, bem como sua capacidade de ser automatizado. Há várias etapas que envolvem a pesagem de pós e líquidos, que são os principais fatores de limitação de tempo no processo de formulação de distribuição. Embora possa parecer um processo moroso para executar em configurações de laboratório, estes passos podem facilmente realizada utilizando dispositivos robóticos. Da mesma forma, o método tem um grande potencial para ser ampliados para produção comercial com o uso de escalas automatizadas e dispensadores para testar simultaneamente a solubilidade de muitos fármacos hidrofóbicos. Isso aceleraria enormemente a formulação e seleção de processos, enquanto aumenta a precisão e reduzir o erro humano. Assim, nosso método de formulação de drogas consistindo de combinações de SAP-AA é uma plataforma generalizada de solubilidade e entrega de compostos hidrofóbicos e iria beneficiar muito de tecnologias de alta produtividade.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho é apoiado por institutos canadenses de pesquisa em saúde, operando concede MOP-42546 e MOP-119514.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EAK16-I | CanPeptide Inc. | Custom peptide | Sequence: AEAKAEAKAEAKAEAK, N-terminus acetylation and C-terminus amidation, >95% pure by HPLC |
| EAK16-II | CanPeptide Inc. | Custom peptide | Sequence: AEAEAKAKAEAEAKAK, N-terminus acetylation and C-terminus amidation, >95% pure by HPLC |
| EAK16-IV | CanPeptide Inc. | Custom peptide | Sequence: AEAEAEAEAKAKAKAK, N-terminus acetylation and C-terminus amidation, >95% pure by HPLC |
| EFK8-II | CanPeptide Inc. | Custom peptide | Sequence: FEFEFKFK, N-terminus acetylation and C-terminus amidation, >95% pure by HPLC |
| A6KE | CanPeptide Inc. | Custom peptide | Sequence: AAAAAAKE, N-terminus acetylation and C-terminus amidation, >95% pure by HPLC |
| P6KE | CanPeptide Inc. | Custom peptide | Sequence: PPPPPPPKE, N-terminus acetylation and C-terminus amidation, >95% pure by HPLC |
| Alanine | Sigma-Aldrich | A7469-100G | L-Alanine |
| Isoleucine | Sigma-Aldrich | I7403-100G | L-Isoleucine |
| Leucine | Sigma-Aldrich | L8912-100G | L-Leucine |
| Methionine | Sigma-Aldrich | M5308-100G | L-Methionine |
| Proline | Sigma-Aldrich | P5607-100G | L-Proline |
| Valine | Sigma-Aldrich | V0513-100G | L-Valine |
| Phenylalanine | Sigma-Aldrich | P5482-100G | L-Phenylalanine |
| Tryptophan | Sigma-Aldrich | T8941-100G | L-Tryptophan |
| Tyrosine | Sigma-Aldrich | T8566-100G | L-Tyrosine |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8790-100G | L-Glycine |
| Asparagine | Sigma-Aldrich | A4159-100G | L-Asparagine |
| Glutamine | Sigma-Aldrich | G8540-100G | L-Glutamine |
| Serine | Sigma-Aldrich | A7219-100G | L-Serine |
| Threonine | Sigma-Aldrich | T8441-100G | L-Threonine |
| Histidine | Sigma-Aldrich | H6034-100G | L-Histidine |
| Lysine | Sigma-Aldrich | L5501-100G | L-Lysine |
| Arginine | Sigma-Aldrich | A8094-100G | L-Arginine |
| Aspartic Acid | Sigma-Aldrich | A7219-100G | L-Aspartic Acid |
| Glutamic Acid | Sigma-Aldrich | G8415-100G | L-Glutamic Acid |
| Cysteine | Sigma-Aldrich | C7352-100G | L-Cysteine |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | D4540-500ML | DMSO |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 277649-100ML | Anhydrous |
| Curcumin | Sigma-Aldrich | 08511-10MG | Hydrophobic drug, curcumin |
| Rottlerin | EMD Millipore | 557370-10MG | Hydrophobic drug, rottlerin |
| PP2 | Enzo | BML-EI297-0001 | Hydrophobic drug, PP2 |
| Scintillation Vials | VWR | 2650-66022-081 | Borosilicate Glass, with Screw Cap, 20 mL. Vials for weighing peptide. |
| Falcon 50 mL Conical Centrifugation Tubes | VWR | 352070 | Polypropylene, Sterile, 50 mL. For amino acid solutions. |
References
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