Summary
本议定书描述了一种临床适用的方法, 溶解疏水化合物在水环境中使用自肽和氨基酸溶液的组合。我们的方法解决疏水疗法的一个主要局限, 缺乏安全, 有效的手段溶解和交付方法入临床设置。
Abstract
自组装多肽 (sap) 是有前途的车辆提供疏水疗法的临床应用;它们的亲特性使它们能够在人体的水环境中溶解疏水化合物。然而, 自肽解决方案有较差的血液相容性 (例如, 低渗透), 阻碍了他们的临床应用通过静脉注射管理。我们最近开发了一个通用的疏水药物输送平台, 它将 sap 与氨基酸溶液 (液-AA) 结合起来, 提高药物的溶解度, 增加配方渗透, 达到临床使用的要求。在三种不同的疏水性化合物--PP2、rottlerin 和姜黄素--的背景下, 对这种配方进行了彻底的测试, 以证明其通用性。此外, 我们研究了改变配方成分的影响, 分析了6种不同的结构, 20 种天然氨基酸在低和高浓度, 和两个不同的 co-solvents 二甲基亚砜和乙醇。我们的策略被证明是有效的, 以优化一个给定的疏水性药物的成分, 和治疗功能的配方抑制剂, PP2, 被观察到的体外和在体内。这篇手稿概述了我们的通用配方方法使用 SAP-AA 组合疏水性化合物, 并分析溶解度作为第一步, 以潜在使用这些配方在更多的功能性研究。我们包括有代表性的溶解度结果的配方疏水性化合物, 姜黄素, 并讨论如何作为一个平台, 未来的生物研究和疾病模型的方法。
Introduction
sap 是一类生物材料广泛研究的3D 支架在再生医学1,2,3,4。然而, 最近, 由于其独特的生物学特性5、6、7、8, 它们被作为治疗药物的载体而被利用。sap 自然组装成稳定的纳米结构9, 从而提供了一种药物的封装和保护手段。sap 是亲, 由一个特定的疏水性和亲水性氨基酸重复的模式, 驱动他们的自组装9,10 , 并允许他们作为一个介乎疏水性和亲水性环境.因此, 对于疏水性药物的临床交付--由于在水环境中由于缺乏溶解度而在人体内具有极低的生物利用度和吸收率11,12 -sap 是希望作为交付车辆.此外, 他们的序列模式还意味着, sap 可以合理设计和工程, 以最大限度地与任何特定药物或化合物 (即, 基于功能基团) 的兼容性, 并进一步协助溶解度。
在许多体外和体内设置13、14、15、16中, sap 已被应用为有效的药物运载工具。它们也显示出极大的安全性和生物相容性。然而, 由于低渗透的 SAP 药物制剂, 它们不能用于静脉注射, 在临床设置13。考虑到这种限制, 我们最近制定了一项战略, 将 sap 与氨基酸解决方案结合起来, 以减少毒性 co-solvents 的使用, 并增加处方渗透, 从而提高临床相关性。我们选择使用氨基酸, 因为它们是结构化结构的基石, 已经被临床接受, 并与 sap 结合, 它们增加了疏水性药物的溶解度, 同时减少了需要的17,18的数量。
我们已经审查了 SAP-AA 组合作为一个通用平台的疏水性药物溶解度和后续交付通过创建一个多步骤筛选管道, 并将其应用于 Src 抑制剂, PP2, 作为一个模型疏水性化合物。在这个过程中, 我们研究了改变配方的成分-最终测试6种不同的结构, 所有20种氨基酸在2不同浓度 (低和高; 低根据现有临床应用的浓度, 和高浓度是 2x, 3x, 或5x 的临床浓度的基础上, 每个氨基酸在水中的最大溶解度), 和2不同的 co-solvents-和选择的组合, 溶解 PP2 进一步分析。这种药物制剂在细胞培养中被证明是一种有效的药物载体, 同时也在使用气管和静脉的管理的体内模型。同样, 我们的工作涉及的多功能性的 SAP-AA 组合在磷多, 结构不同的疏水性化合物在水环境中;具体来说, 药物 rottlerin 和姜黄素18。本文概述了液-AA 的配方方法和姜黄素溶解度分析为例, 在我们的筛选管道的主要步骤。该协议提供了一个简单的, 可重现的方式来筛选最佳的 SAP-AA 组合, 它可以溶解任何给定的疏水性化合物。
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Protocol
1. 氨基酸溶液的制备
- 为每种氨基酸准备和标记两个50毫升圆锥离心管 (分别用于两个和 #34; 低和 #34; 和 #34; 高 #34; 浓度).
- 准备一个大2升瓶, 含纯净水 (18.2 米和 #937; #183; cm 在25和 #176; C).
- 计算每种氨基酸 (克) 达到所需浓度, 并使用刮刀将适当数量的氨基酸称量到各自的50毫升离心管中.
注: 对于 #34; 高 #34; 两种带负电荷的氨基酸的浓度, 用 PBS 代替水。由于水的溶解度低, 我们不能增加其浓度, 而使用 PBS 代替水有助于维持低 pH 值。此外, 每种氨基酸溶液的浓度计算都是通过40毫升的最终体积得到的。所有氨基酸浓度在 表 3 中概述。一定要清洗在氨基酸之间的刮刀, 以避免污染。我们建议用水冲洗, 然后用70% 乙醇擦拭. - 使用血清吸管将40毫升纯净水 (或 PBS) 加入每50毫升的试管中。帽管和涡旋或剧烈摇动直至溶解。水浴超声 (室温, 130 W, 40 赫) 也可用于协助溶解度过程.
注: 以下氨基酸溶液对光敏感, 应覆盖铝箔: 色氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸 (包括芳香环状结构) 和半胱氨酸 (活性 SH 组).
2。准备 SAP-AA 解决方案
- 为自肽准备20毫升闪烁小瓶。对于一个给定的自肽, 准备一瓶每个准备的氨基酸溶液 (每个组合将在一个单独的小瓶).
- 使用高性能的分析平衡 (可读性降低到0.1 毫克或更低), 重约1和 #177; 0.2 毫克的肽到每个小瓶的底部。盖后称量, 并记录的确切重量的肽的上限.
- 将适当数量的氨基酸溶液 (在1节中制备) 放入每一个含有肽的小瓶中, 以便达到所需的自肽浓度 (0.1 毫克/毫升, 用于长肽, 长度为16氨基酸, 或0.2 毫克/毫升短肽, 长度为8氨基酸).
- 几种在室温下为10分钟的水浴 sonicator (130 W, 40 赫), 确保瓶子内的溶液完全浸入水浴中.
3。药物-二甲基亚砜或药物乙醇库存溶液的制备
- 将1毫克的药物 (在本例中为姜黄素) 与100% 的二甲基亚砜结合, 另1毫克与100% 乙醇一起创建两个股票解决方案.
注: 我们增加了200和 #181; l 二甲基亚砜和400和 #181; l 乙醇, 分别为5毫克/毫升和2.5 毫克/毫升, 由于每个溶剂中的溶解度不同, 而使其成为两甲基苯甲酸二甲砜-姜黄素和乙醇-姜黄素的股票;然而, 重要的是要注意, 股票的浓度应调整取决于疏水性药物的利益。诸如药物溶解度和有效生物浓度等因素在确定这一价值时很重要。同时, 请记住, 当与 SAP-AA 解决方案结合使用时, 该股票将分别被稀释100倍和50倍的二甲基亚砜和乙醇制剂 (见第4节)。根据所需配方的数量和 #8211, 最好准备大量的存货; 在这种情况下, 将使用超过1毫克的药物。库存可储存在-20 和 #176;使用前解冻冰和涡旋. - 漩涡瓶十五年代完全溶解药物.
4。药物制剂的制备
- 为每个配方准备清晰的、1.5 毫升的离心管。一定要用预定的自肽、氨基酸 (和浓度) 和溶剂标签管.
- 添加10和 #181; 药物-二甲基亚砜库存, 或20和 #181; l 药物乙醇库存到适当的离心管.
- 添加990和 #181; SAP-AA 酸解决方案的适当标记离心管含有药物-二甲基亚砜的股票, 和980和 #181; 我对那些含有药物乙醇的股票。这产生1毫升药物配方与1% 二甲基亚砜或2% 乙醇.
注: 根据该协议, 所有姜黄素制剂的最终浓度为0.5 毫克/毫升。同样, 当使用其他疏水化合物和/或开始与不同的存货集中 (参见步骤 3.1) - 漩涡强烈三十年代和允许公式化休息为 30 min.
5. 溶解度测试
- 在休息期过后, 漩涡又一次剧烈地三十年代.
- 离心 14220 x g 的配方1分钟.
- 分析离心管底部的降水 (通过可视化).
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Representative Results
对于疏水性药物, 姜黄素, 我们生产的配方使用所有20种天然存在的氨基酸在低浓度, 结合只有一个 SAP, EAK16-II, 作为一个原理。我们还测试了使用二甲基亚砜和乙醇作为 co-solvents 的配方。总的, 这产生了40姜黄素配方, 每个含有不同的成分。重要的是要注意, 在我们以前的研究使用 Src 抑制剂, PP2, 我们包括更多的选择的 SAP (共 6) 和氨基酸浓度 (临床, 以及较高的浓度), 这产生了共480种不同的配方。在选择 EAK16-II 作为本研究的 SAP 时, 这项工作的趋势被考虑在内。各种组件的浓度包括在表 1、表 2和表 3中作为参考。所有疏水性药物制剂通过可视化的方法进行药物溶解度筛选, 如果溶液完全清除离心后的任何沉淀物, 则被认为是可溶性的 (图 1)。如果药物沉淀到底部的管, 这被认为是不, 并没有经过进一步的测试。此外, 溶解度由两个不同的个体来检验;如果这些结果不能重现, 配方也不被认为是真正的可溶性。
在本研究中测试的40配方中, 7 配方成功溶解了姜黄素 (表 4)。按组件分组配方确定了两个主要趋势: 乙醇似乎是溶解姜黄素的较好溶剂, 而正电荷的氨基酸赖氨酸 (K) 和精氨酸 (R) 也似乎是溶解姜黄素的最佳组分 (表4). 有趣的是注意到含有 R 和 K 的配方的颜色变化, 这表明姜黄素是溶解在碱性条件 (图 1)。通过各种成分的性质对配方进行分组来进行观察是很有帮助的。
图 1: 降水分析的例子.对于这些含有肽 EAK16-II、乙醇和带电氨基酸的姜黄素配方, 在离心后的离心管中可以清楚地看到沉淀。含有赖氨酸 (K)、精氨酸 (R) 或天门冬氨酸 (D) 的配方溶解姜黄素 (no 沉淀), 而含有组氨酸 (H) 或谷氨酸 (E) 的制剂不 (沉淀, 用红色圆圈)。请单击此处查看此图的较大版本.
| 药物 | 配方浓度 (毫克/毫升) |
| PP2 | 0.05 |
| 姜黄素 | 0.05 |
| Rottlerin | 0.02 |
表 1:制剂中使用的药物浓度.药物制剂浓度各不相同, 各有不同的生物活性浓度, 也有不同的负荷能力。
| 自组装肽 | 属性 | 配方浓度 (毫克/毫升) |
| EAK16-I | 家庭, 长 | 0。1 |
| EAK16-II | 家庭, 长 | 0。1 |
| EAK16-IV | 家庭, 长 | 0。1 |
| EFK8-II | 修改的讲, 短 | 0。2 |
| A6KE | 表面活性剂样, 短 | 0。2 |
| P6KE | 表面活性剂样, 短 | 0。2 |
表 2: 配方中使用的自肽的浓度.随着氨基酸的增加, 只有小浓度的自肽是必需的 (0.1-0.2 毫克/毫升)。较短的肽是双倍的浓度比较长的肽, 因为他们有一半的序列长度 (8 氨基酸与16氨基酸)。
表 3: 配方中使用的氨基酸溶液的浓度.根据现有的临床应用, 选择低浓度的氨基酸。高浓度是 2x, 3x, 或5x 的临床浓度和在水中的每个氨基酸的最大溶解度。此图已从帕切科et al.中修改18
表 4: 姜黄素具有代表性的溶解度结果摘要的 SAP-AA 组合, 有效溶解姜黄素筛选后的溶解度。此图已从帕切科et al.中修改18
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Discussion
在制定过程中, 有许多关键步骤和问题需要考虑。首先, 当我们使用不同的组件和浓度时, 整个协议中的多个涡旋步骤确保所有浓度都是一致和正确的。一些高浓度的疏水性氨基酸溶液在涡流后仍可能无法完全溶解, 在这种情况下, 它们可以用手使劲摇动, 以协助过程。同样, sap-AA 解决方案必须经过步骤2.4 中概述的超声步骤, 因为结构调整结构自然倾向于聚合, 而超声将帮助分割 sap 集群, 从而产生更统一的解决方案。其次, 对于给定的疏水性药物, SAP-AA 制剂中的库存和最终浓度应取决于该化合物在生物环境中的有效浓度。该议定书应相应地加以修改, 以反映这种积极的集中。此外, 药物的装载能力也是一个重要的考虑因素;这可能是每个药物都有一个独特的负载能力使用这种策略, 每个 SAP-AA 组合可能支持不同数量的药物的基础上的兼容性。这表明了筛选的重要性, 找到最佳的 SAP-AA 组合为给定的化合物。
使用我们的技术对其他人有许多好处;更具体地说, 在传统的方法中, 单独使用结构化结构来封装和潜在的化合物的交付是非常重要的。如前所述, 氨基酸已被临床接受, 并加入这些解决方案的 SAP 配方增加渗透减少溶血活性, 这样, 静脉注射在临床情况是可能的。我们还发现, 它们大大增加疏水性复合溶解度的情况下, 单独的结构, 只有 sap 是不够的溶解度17,18。多种不同组合的 sap 和氨基酸参与允许扩展到高通量的方法筛选疏水性药物溶解度。可对溶解度数据进行详细分析, 揭示趋势;我们发现, 配方成分 (SAP 或氨基酸) 的分类结果显示, 每种疏水药物都有一个独特的模式。例如, 正电荷的氨基酸改善了姜黄素的溶解度 (图 1), 而我们先前的研究表明, 带负电荷的氨基酸对 PP218是更好的。这些趋势有助于确定特定成分对类似化学结构的药物溶解的适用性。此外, 我们的溶解度屏幕的简单性是一个优点和局限性;虽然它是容易执行, 有更多的技术和准确的方法来实验评估化合物的溶解度在解决方案 (如, 光谱学或色谱方法)。然而, 该协议中概述的筛选策略允许快速而高效地选择 SAP-AA 组合, 从而导致最高的药物溶解度, 因此, 是进一步分析的最高潜在生物活性。由于有许多配方的不同组合的自肽, 氨基酸, 氨基酸浓度, 和溶剂, (480 总在我们以前的手稿18), 这是一个必要的步骤, 缩小到寻找最佳特定药物的成分。在发现可溶性药物制剂后, 可通过更多的技术方法对其溶解度进行评估, 并在功能分析中进一步验证, 以评估生物活性和安全性。这些功能性的分析应该是量身定做的药物的预期用途, 在我们的手稿优化 PP2 配方18。扩大我们的平台, 在其他疏水性化合物将揭示更多的趋势和机制, 以提高溶解度, 并协助工程新的 sap 临床配方的特定疏水性化合物。
我们的方法的未来在于潜在的药物输送管道, 以及它的自动化能力。有许多步骤, 涉及重量粉和配药液体, 这是主要的 time-limiting 因素在制定过程中。尽管在实验室设置中执行过程可能看起来很冗长, 但这些步骤可以使用自动设备轻松地执行。同样, 该方法有很大的潜力, 以扩大到商业化生产, 使用自动秤和分配器, 以同时测试的溶解度, 许多疏水性药物。这将大大加快制定和筛选过程, 同时提高准确性和减少人为错误。因此, 我们的药物配方方法组成的 SAP-AA 组合是一个通用平台的溶解度和交付疏水性化合物, 并将大大受益于高通量技术。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到加拿大卫生研究所的支持, MOP-42546 和 MOP-119514 的运作赠款。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EAK16-I | CanPeptide Inc. | Custom peptide | Sequence: AEAKAEAKAEAKAEAK, N-terminus acetylation and C-terminus amidation, >95% pure by HPLC |
| EAK16-II | CanPeptide Inc. | Custom peptide | Sequence: AEAEAKAKAEAEAKAK, N-terminus acetylation and C-terminus amidation, >95% pure by HPLC |
| EAK16-IV | CanPeptide Inc. | Custom peptide | Sequence: AEAEAEAEAKAKAKAK, N-terminus acetylation and C-terminus amidation, >95% pure by HPLC |
| EFK8-II | CanPeptide Inc. | Custom peptide | Sequence: FEFEFKFK, N-terminus acetylation and C-terminus amidation, >95% pure by HPLC |
| A6KE | CanPeptide Inc. | Custom peptide | Sequence: AAAAAAKE, N-terminus acetylation and C-terminus amidation, >95% pure by HPLC |
| P6KE | CanPeptide Inc. | Custom peptide | Sequence: PPPPPPPKE, N-terminus acetylation and C-terminus amidation, >95% pure by HPLC |
| Alanine | Sigma-Aldrich | A7469-100G | L-Alanine |
| Isoleucine | Sigma-Aldrich | I7403-100G | L-Isoleucine |
| Leucine | Sigma-Aldrich | L8912-100G | L-Leucine |
| Methionine | Sigma-Aldrich | M5308-100G | L-Methionine |
| Proline | Sigma-Aldrich | P5607-100G | L-Proline |
| Valine | Sigma-Aldrich | V0513-100G | L-Valine |
| Phenylalanine | Sigma-Aldrich | P5482-100G | L-Phenylalanine |
| Tryptophan | Sigma-Aldrich | T8941-100G | L-Tryptophan |
| Tyrosine | Sigma-Aldrich | T8566-100G | L-Tyrosine |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8790-100G | L-Glycine |
| Asparagine | Sigma-Aldrich | A4159-100G | L-Asparagine |
| Glutamine | Sigma-Aldrich | G8540-100G | L-Glutamine |
| Serine | Sigma-Aldrich | A7219-100G | L-Serine |
| Threonine | Sigma-Aldrich | T8441-100G | L-Threonine |
| Histidine | Sigma-Aldrich | H6034-100G | L-Histidine |
| Lysine | Sigma-Aldrich | L5501-100G | L-Lysine |
| Arginine | Sigma-Aldrich | A8094-100G | L-Arginine |
| Aspartic Acid | Sigma-Aldrich | A7219-100G | L-Aspartic Acid |
| Glutamic Acid | Sigma-Aldrich | G8415-100G | L-Glutamic Acid |
| Cysteine | Sigma-Aldrich | C7352-100G | L-Cysteine |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | D4540-500ML | DMSO |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 277649-100ML | Anhydrous |
| Curcumin | Sigma-Aldrich | 08511-10MG | Hydrophobic drug, curcumin |
| Rottlerin | EMD Millipore | 557370-10MG | Hydrophobic drug, rottlerin |
| PP2 | Enzo | BML-EI297-0001 | Hydrophobic drug, PP2 |
| Scintillation Vials | VWR | 2650-66022-081 | Borosilicate Glass, with Screw Cap, 20 mL. Vials for weighing peptide. |
| Falcon 50 mL Conical Centrifugation Tubes | VWR | 352070 | Polypropylene, Sterile, 50 mL. For amino acid solutions. |
References
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