Summary
Este protocolo describe un medio clínicamente aplicable de disolver compuestos hidrofóbicos en un ambiente acuoso utilizando combinaciones de uno mismo-montaje de soluciones de péptidos y aminoácidos. Nuestro método tiene una limitación importante de la terapéutica hidrofóbica, que carecen de seguro y eficiente medio de solubilidad y entrega de métodos en contextos clínicos.
Abstract
Uno mismo-montaje péptidos (SAPs) son prometedores vehículos para la entrega de tratamientos hidrófobos para aplicaciones clínicas; sus propiedades anfipáticos que puedan disolver compuestos hidrofóbicos en el ambiente acuoso del cuerpo humano. Sin embargo, soluciones de peptide uno mismo-montaje tienen compatibilidad sanguínea deficiente (p. ej., baja osmolaridad), lo que dificulta su aplicación clínica a través de administración intravenosa. Recientemente hemos desarrollado una plataforma generalizada para la entrega de drogas hidrofóbicas, que combina programas de ajuste estructural con soluciones de aminoácidos (SAP-AA) para mejorar la solubilidad de la droga y aumentar la osmolaridad de la fórmula para alcanzar los requerimientos para aplicaciones clínicas. Esta estrategia de formulación fue probada a fondo en el contexto de tres compuestos hidrofóbicos estructuralmente diferentes: PP2 rottlerin y curcumina – para demostrar su versatilidad. Además, se analizaron efectos de cambiar componentes de la formulación mediante el análisis de 6 diferentes programas de ajuste estructural, 20 aminoácidos existentes naturalmente en concentraciones bajas y altas y dos diversos solventes Co dimetil sulfóxido (DMSO) y etanol. Nuestra estrategia demostrado para ser efectiva en la optimización de componentes para un determinado fármaco hidrofóbico y función terapéutica del inhibidor formulado, PP2, fue observado tanto in vitro como in vivo. Este manuscrito describe nuestro método de formulación generalizada utilizando SAP AA combinaciones de compuestos hidrofóbicos y análisis de solubilidad como un primer paso hacia el posible uso de estas formulaciones en estudios más funcionales. Incluyen los resultados de solubilidad representativas para la formulación de la curcumina compuesta hidrofóbica y discutir cómo nuestra metodología sirve como una plataforma para futuros estudios biológicos y modelos de la enfermedad.
Introduction
Programas de ajuste estructural son una clase de biomateriales que han sido estudiados extensivamente como andamios 3D en medicina regenerativa1,2,3,4. Más recientemente sin embargo, ellos han sido explotados como vehículos para la entrega de la terapéutica debido a sus propiedades biológicas únicas5,6,7,8. Programas de ajuste estructural naturalmente montan en nanoestructuras estable9, proporcionando así un medio de encapsulación del fármaco y la protección. Programas de ajuste estructural son anfipáticos, conformada por un patrón específico de repeticiones del aminoácido hidrofóbico e hidrofílico, conducir su uno mismo-Asamblea de9,10 y lo que les permite servir como un medio entre hidrofóbico e hidrofílico ambientes. En consecuencia, para la administración clínica de drogas hidrofóbicas, que tienen muy baja biodisponibilidad y absorción en el cuerpo debido a la falta de solubilidad en ambientes acuosos11,12 – SAPs son prometedores como una entrega vehículo. Además, su patrón de secuencia implica que SAPs pueden racionalmente diseñados y desarrollados para maximizar la compatibilidad con cualquier fármaco dado o compuesto (es decir, basadas en grupos funcionales) y además ayudar a la solubilidad.
Programas de ajuste estructural se han aplicado como vehículos de entrega de drogas eficaces en muchos in vitro e in vivo configuración13,14,15,16. También han mostrado gran seguridad y biocompatibilidad. Sin embargo, debido a la baja osmolaridad de preparaciones SAP de la droga, no puede utilizarse para inyecciones intravenosas como en ajustes clínicos13. Teniendo en cuenta esta restricción, recientemente hemos desarrollado una estrategia que combina programas de ajuste estructural con soluciones de aminoácidos con el fin de reducir el uso de solventes tóxicos Co y aumentar la osmolaridad de la formulación y por lo tanto, relevancia clínica. Se decidió utilizar los aminoácidos como son los bloques de edificio del SAPs, ya son clínicamente aceptados, y en combinación con programas de ajuste estructural, que aumentan la solubilidad de la droga hidrofóbica mientras que reduce la cantidad de SAP17,18.
Hemos escudriñado combinaciones AA SAP como plataforma generalizada de solubilidad de la droga hidrofóbica y posterior entrega crear una tubería de la proyección de múltiples pasos y aplicando a inhibidor de la fuente, PP2, como un compuesto hidrofóbico modelo. En este proceso, se examinó el efecto de cambiar componentes de la formulación, en última instancia prueba 6 diferentes programas de ajuste estructural, todos los 20 aminoácidos en 2 concentraciones diferentes (bajo y alto; bajo basados en concentraciones en aplicaciones clínicas existentes y de alta las concentraciones fueron x 2, x 3 o x 5 la concentración clínica se basa en la solubilidad máxima de cada aminoácido en el agua) y 2 diferentes solventes Co – y las combinaciones que solubilizados PP2 para su posterior análisis. Esta formulación de la droga demostró para ser eficaz como un vehículo de entrega de droga en cultivo celular, así como en vivo modelos utilizando administración intratraqueal e intravenosa. Además, nuestro trabajo se refirió a la versatilidad de combinaciones de SAP-AA en múltiples solubilizantes, estructuralmente diferentes compuestos hidrofóbicos en ambientes acuosos; específicamente, los medicamentos rottlerin y curcumina18. Este manuscrito describe el método de formulación SAP-AA y el análisis de solubilidad de la curcumina como ejemplo de la etapa primaria en nuestros proyectos de investigación. Este protocolo proporciona una forma simple y reproducible a la pantalla de las óptimas combinaciones de SAP-AA, que disuelven cualquier compuesto hidrofóbico dado.
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Protocol
1. preparación de las soluciones del aminoácido
- prepara y etiqueta dos 50 mL cónico tubos de centrífuga para cada aminoácido (uno para los dos " bajo " y " alta " concentraciones).
- Preparar un gran frasco de 2 L que contenga agua purificada (18.2 MΩ·cm a 25 ° C).
- Calcular la cantidad de cada aminoácido (en gramos) para alcanzar la concentración deseada y pesar la cantidad adecuada de aminoácidos en sus tubos de centrífuga de 50 mL respectivos con una espátula de.
Nota: Para la " alta " concentración de los dos aminoácidos con carga negativa, PBS se utiliza en lugar de agua. No podría aumentar sus concentraciones debido a su solubilidad de agua baja y utilizando PBS en lugar de agua ayuda a mantener el pH bajo. Además, los cálculos de concentración fueron obtenidos usando un volumen final de 40 mL para cada solución de aminoácido. Todas las concentraciones de aminoácidos se contornean en la tabla 3. Asegúrese de enjuagar la espátula entre aminoácidos para evitar la contaminación. Se recomienda un enjuague con agua, seguido por limpieza con etanol al 70%. - Agregar 40 mL de agua purificada (o PBS) en cada tubo de 50 mL con una pipeta serológica. Tapa los tubos y agitar o sacudir vigorosamente hasta que se disuelva. Sonicación de baño de agua (a temperatura ambiente, 130 W, 40 kHz) puede utilizarse también para ayudar en el proceso de solubilidad.
Nota: Las siguientes soluciones de aminoácidos son sensibles a la luz y debe cubrirse con papel de aluminio: triptófano, fenilalanina y tirosina (que consisten en estructuras de anillo aromáticas) y cisteína (reactivo - SH del grupo).
2. Preparación de soluciones de SAP-AA
- viales de centelleo preparar 20 mL de la uno mismo-montaje de péptidos. Para un péptido dado de uno mismo-montaje, preparar un frasco por preparados aminoácidos solución (cada combinación se realizará en un frasco aparte).
- Utilizando una balanza analítica de alta performance (con una legibilidad de hasta 0.1 mg o menos), pesan aproximadamente 1 ± 0.2 mg de péptido en el fondo de cada frasco. La tapa después de pesar y registrar el peso exacto del péptido en el cap.
- Pipetear el volumen apropiado de solución de aminoácidos (preparado en la sección 1) en cada frasco contiene péptidos, para alcanzar la concentración deseada de uno mismo-montaje de péptido (0,1 mg/mL para péptidos largos con una longitud de 16 aminoácidos, o 0,2 mg/mL para péptidos más cortos con una longitud de 8 aminoácidos).
- Someter a ultrasonido durante 10 minutos en un agua baño sonicador (130 W, 40 kHz) a temperatura ambiente, garantizando las soluciones dentro de los frascos se sumergen completamente en el baño de agua.
3. Preparación de drogas-DMSO o soluciones Stock de drogas etanol
- cosechadora 1 mg de droga (en este caso, la curcumina con 100% DMSO) y otro 1 mg con etanol 100% a crear dos soluciones.
Nota: Agregó 200 μL de DMSO y el 400 μL etanol para hacer acciones DMSO cúrcuma y curcumina etanol que fueron 5 mg/mL y 2.5 mg/mL, respectivamente, debido a la diferente solubilidad en cada disolvente; sin embargo, es importante tener en cuenta que la concentración de población se debe ajustar dependiendo de la droga hidrofóbica de interés. Factores como la solubilidad de la droga y concentración biológica efectiva son importantes en la determinación de este valor. También, tenga en cuenta que el stock se diluirá 50 veces y 100-fold en formulaciones DMSO y etanol, respectivamente, cuando se combina con soluciones de SAP-AA (ver sección 4). Puede ser preferido para preparar un volumen mayor de acciones dependiendo del número de formulaciones requeridas – en este caso, se utilizará más de 1 mg de droga. La acción puede ser almacenada a-20 ° C; deshielo en hielo y agitar antes de usar. - Frascos de vortex por 15 s para disolver totalmente la droga.
4. Preparación de formulaciones de drogas
- Prepare claros, tubos de microcentrífuga de 1,5 mL para cada formulación. Asegúrese de que a los tubos de la etiqueta con el previsto autoensamblada péptido del aminoácido (y concentración) y co-solvente.
- Añadir 10 μl del stock de drogas-DMSO, o 20 μl etanol drogas stock a tubos de microcentrífuga apropiado.
- Agregar 990 μl de soluciones ácidas de SAP-AA al apropiado etiquetado tubos de microcentrífuga con stock de drogas-DMSO y 980 μl a los que contienen stock de drogas-etanol. Esto produce formulaciones de drogas de 1 mL con etanol al 1% DMSO o 2%.
Nota: La concentración final de todas las formulaciones de curcumina fue 0.5 mg/mL según el protocolo. Una vez más, esto variará cuando utilizando otros compuestos hidrofóbicos o comenzando con una concentración de acciones diferentes (ver paso 3.1) - Vortex vigorosamente por 30 s y permiten formulaciones reposar 30 min
5. pruebas de solubilidad
- después de período de descanso, vigorosamente nuevamente vortex por 30 s.
- Las formulaciones a 14.220 x g durante 1 minuto de la centrífuga
- Analizar la parte inferior de los tubos de microcentrífuga para precipitación (visualización).
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Representative Results
Para la droga hidrofóbica, curcumina, produjimos formulaciones con 20 todos naturalmente existen aminoácidos en concentraciones bajas, en combinación con un único SAP, EAK16-II, como una prueba de principio. También probamos formulaciones utilizando DMSO y etanol como co solventes. En total, esto produjo 40 curcumina formulaciones, cada una con diferentes componentes. Es importante señalar que, en nuestros estudios anteriores utilizando el inhibidor Src, PP2, incluido más opciones para SAP (6 en total) y la concentración de aminoácidos (clínicos, así como una mayor concentración), que produjeron un total de 480 diferentes formulaciones. Las tendencias de este trabajo se tuvieron en cuenta cuando se seleccione EAK16-II como la savia para este estudio. Las concentraciones de varios componentes se incluyen en la tabla 1, tabla 2y tabla 3 como referencia. Todas las formulaciones de drogas hidrofóbicas son evaluadas para la solubilidad de la droga por visualización y considera solubles si la solución es totalmente clara cualquier precipitado después de la centrifugación (figura 1). Si la droga se precipita hasta el fondo del tubo, esto se considera insoluble y no pasa por pruebas. Además, solubilidad se prueba por triplicado y por dos personas diferentes; Si estos resultados no son reproducibles, formulaciones también no se consideran ser verdaderamente soluble.
De las 40 formulaciones probadas en este estudio, 7 formulaciones disuelven con éxito curcumina (tabla 4). Formulaciones de agrupación por componentes identificados dos tendencias principales: etanol parece ser un co-solvente mejor para disolver la curcumina y cargado positivamente los aminoácidos lisina (K) y arginina (R) también parecen ser componentes óptimos para la disolución de la curcumina (tabla 4). es interesante observar el cambio de color para las formulaciones que contienen R y K, que revelan la curcumina se disuelve en la condición alcalina (figura 1). Es útil a las formulaciones de grupo por las características de los diferentes componentes para hacer tales observaciones.
Figura 1 : Ejemplo de análisis de la precipitación. De estas formulaciones de curcumina que contiene el péptido EAK16-II, etanol y aminoácidos cargados, precipitado puede verse claramente en los tubos de microcentrífuga después de la centrifugación. Formulaciones que contienen lisina (K), arginina (R) o ácido aspártico (D) disolver curcumina (no precipitado), mientras que ésos que contienen histidina (H) o el ácido glutámico (E) no (precipitado, un círculo rojo). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Drogas | Formulación de concentración (mg/mL) |
| PP2 | 0.05 |
| Curcumina | 0.05 |
| Rottlerin | 0.02 |
Tabla 1: Concentración de fármacos utilizados en formulaciones de. Concentraciones de formulación de la droga son diferentes como cada uno tiene una diferente concentración bioactiva y también carga de diferentes capacidades.
| Peptide uno mismo-montaje | Propiedades | Formulación de concentración (mg/mL) |
| EAK16-ME | Familia EAK, largo | 0.1 |
| EAK16-II | Familia EAK, largo | 0.1 |
| EAK16-IV | Familia EAK, largo | 0.1 |
| EFK8-II | EAK modificada, corta | 0.2 |
| A6KE | Como surfactante, corto | 0.2 |
| P6KE | Como surfactante, corto | 0.2 |
Tabla 2: concentración de la uno mismo-montaje de péptidos utilizados en formulaciones de. Con la adición de aminoácidos, se requieren sólo pequeñas concentraciones del peptide uno mismo-montaje (0.1-0.2 mg/mL). Péptidos más cortos son el doble de la concentración frente a péptidos más largos ya que tienen la mitad de la longitud secuencia (8 aminoácidos versus 16 aminoácidos).
Tabla 3: concentración de soluciones de aminoácidos utilizado en formulaciones de. Concentraciones bajas de aminoácidos fueron seleccionadas en base a las aplicaciones clínicas actuales de cada uno. Altas concentraciones son 2 x, 3 x o 5 x la concentración clínica y a la solubilidad máxima de cada aminoácido en el agua. Esta figura ha sido modificada desde Pacheco et al. 18
Tabla 4: resultados de solubilidad representante de curcumina. Un resumen de las combinaciones de SAP-AA que disolvió con eficacia curcumina después de proyección de solubilidad. Esta figura ha sido modificada desde Pacheco et al. 18
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Discussion
En el procedimiento de formulación, hay varios pasos críticos y puntos a considerar en la solución de problemas. En primer lugar, como estamos trabajando con diversos componentes y las concentraciones, varios pasos de vórtice a través del protocolo que sean todas las concentraciones de uniforme y correcta. Algunas de las soluciones de alta concentración, hidrofóbico aminoácido pueden todavía no ser disuelto totalmente después de Vortex, y en este caso, pueden ser sacudidos vigorosamente a mano para ayudar en el proceso. Asimismo, es esencial que las soluciones SAP-AA pasar por el paso de la sonicación se describe en el paso 2.4 ya SAPs tienden naturalmente a agregado y sonicación ayudarán a dividir grupos SAP, lo que resulta en una solución más uniforme. En segundo lugar, de un determinado medicamento hidrofóbico, el caldo y las concentraciones finales en formulaciones de SAP-AA dependerá de la concentración efectiva de ese compuesto en configuración biológica. El protocolo debe modificarse en consecuencia para reflejar esta concentración activa. Además, capacidad de cargamento de droga es también un factor importante a tener en cuenta; es probable que cada droga tendrá una capacidad de carga única usando esta estrategia, y que cada combinación de SAP-AA puede apoyar una cantidad diferente de medicamento basado en la compatibilidad. Esto demuestra la importancia de la investigación para encontrar la combinación óptima de SAP-AA para un compuesto dado.
Hay una serie de ventajas a usar nuestra técnica sobre otros; más específicamente, existe gran importancia sobre el método convencional de usar PAE solo para encapsulación y potencial de un compuesto. Como se mencionó previamente, los aminoácidos son ya clínicamente aceptados y agregar estas soluciones a las formulaciones de SAP aumenta osmolaridad para disminuir actividad hemolítica, tal que las inyecciones intravenosas en escenarios clínicos posibles. También hemos encontrado que incrementar solubilidad compuesto hidrofóbico en casos donde SAPs solos son insuficientes para solubilidad17,18. Las múltiples combinaciones de SAPs y aminoácidos implicados permite la expansión en un método de alto rendimiento a la pantalla para la solubilidad de la droga hidrofóbica. Datos de solubilidad pueden ser analizados en detalle para revelar las tendencias; hemos encontrado que clasificar los resultados por componente de la formulación (SAP o aminoácido) muestra un patrón parece ser único para cada fármaco hidrofóbico. Por ejemplo, los aminoácidos cargados positivamente mejorar la solubilidad de la curcumina (figura 1), mientras que nuestros estudios anteriores demostraron que los aminoácidos cargados negativamente estaban mejores para PP218. Estas tendencias pueden ayudar a determinar la aptitud de componentes específicos para disolver medicamentos con estructura química similar. Además, la sencillez de nuestra pantalla de solubilidad es una ventaja y una limitación; Aunque es fácil de realizar, hay formas más técnicas y precisas de evaluar experimentalmente la solubilidad de un compuesto en solución (por ejemplo, la espectroscopia o métodos cromatográficos). Sin embargo, la estrategia de investigación descrita en este protocolo permite la selección rápida y eficiente de SAP-AA combinaciones que resultan en la mayor solubilidad de la droga y por consiguiente, la más alta actividad biológica potencial para su posterior análisis. Ya que existen numerosas formulaciones de combinaciones diferentes de uno mismo-montaje de péptidos, aminoácidos, concentración de aminoácidos y co-solvente, (480 total en nuestro anterior manuscrito18), esto es un paso necesario para reducir a encontrar óptimo componentes de un medicamento determinado. Después de encontrar formulaciones de drogas solubles, que pueden evaluarse para solubilidad por métodos más técnicos y deben validarse más en análisis funcionales, que evaluación la seguridad y actividad biológica. Estos análisis funcionales se deben adaptar para el uso de la droga formulada, como se indica en nuestro manuscrito optimización de formulaciones de PP218. Expansión de nuestra plataforma en otros compuestos hidrofóbicos revelan tendencias adicionales y mecanismos para mejorar la solubilidad y asistir en ingeniería nuevo SAPs para clínica formulación de compuestos hidrofóbicos específicos.
Entregar el futuro de nuestro método se encuentra en la tubería del potencial de drogas, así como su capacidad para ser automatizado. Hay muchos pasos que involucran polvos de pesaje y dosificación de líquidos, que son los principales factores limitantes de tiempo en el proceso de formulación. Aunque puede parecer un largo procedimiento para llevar a cabo en el laboratorio, estos pasos pueden realizaron fácilmente utilizando dispositivos robóticos. Además, el método tiene un gran potencial para ampliarse en la producción comercial con el uso de escalas automáticas y dispensadores para probar al mismo tiempo la solubilidad de muchos fármacos hidrofóbicos. Esta gran medida aceleraría la formulación y evaluación de procesos, aumentando la precisión y reduciendo el error humano. Así, nuestro método de formulación de medicamentos consisten en combinaciones de SAP-AA es una plataforma generalizada para la solubilidad y la entrega de compuestos hidrofóbicos y se beneficiaría enormemente de tecnologías de alto rendimiento.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo es apoyado por los institutos canadienses de investigación en salud, de funcionamiento otorga 42546 fregona y mopa-119514.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EAK16-I | CanPeptide Inc. | Custom peptide | Sequence: AEAKAEAKAEAKAEAK, N-terminus acetylation and C-terminus amidation, >95% pure by HPLC |
| EAK16-II | CanPeptide Inc. | Custom peptide | Sequence: AEAEAKAKAEAEAKAK, N-terminus acetylation and C-terminus amidation, >95% pure by HPLC |
| EAK16-IV | CanPeptide Inc. | Custom peptide | Sequence: AEAEAEAEAKAKAKAK, N-terminus acetylation and C-terminus amidation, >95% pure by HPLC |
| EFK8-II | CanPeptide Inc. | Custom peptide | Sequence: FEFEFKFK, N-terminus acetylation and C-terminus amidation, >95% pure by HPLC |
| A6KE | CanPeptide Inc. | Custom peptide | Sequence: AAAAAAKE, N-terminus acetylation and C-terminus amidation, >95% pure by HPLC |
| P6KE | CanPeptide Inc. | Custom peptide | Sequence: PPPPPPPKE, N-terminus acetylation and C-terminus amidation, >95% pure by HPLC |
| Alanine | Sigma-Aldrich | A7469-100G | L-Alanine |
| Isoleucine | Sigma-Aldrich | I7403-100G | L-Isoleucine |
| Leucine | Sigma-Aldrich | L8912-100G | L-Leucine |
| Methionine | Sigma-Aldrich | M5308-100G | L-Methionine |
| Proline | Sigma-Aldrich | P5607-100G | L-Proline |
| Valine | Sigma-Aldrich | V0513-100G | L-Valine |
| Phenylalanine | Sigma-Aldrich | P5482-100G | L-Phenylalanine |
| Tryptophan | Sigma-Aldrich | T8941-100G | L-Tryptophan |
| Tyrosine | Sigma-Aldrich | T8566-100G | L-Tyrosine |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8790-100G | L-Glycine |
| Asparagine | Sigma-Aldrich | A4159-100G | L-Asparagine |
| Glutamine | Sigma-Aldrich | G8540-100G | L-Glutamine |
| Serine | Sigma-Aldrich | A7219-100G | L-Serine |
| Threonine | Sigma-Aldrich | T8441-100G | L-Threonine |
| Histidine | Sigma-Aldrich | H6034-100G | L-Histidine |
| Lysine | Sigma-Aldrich | L5501-100G | L-Lysine |
| Arginine | Sigma-Aldrich | A8094-100G | L-Arginine |
| Aspartic Acid | Sigma-Aldrich | A7219-100G | L-Aspartic Acid |
| Glutamic Acid | Sigma-Aldrich | G8415-100G | L-Glutamic Acid |
| Cysteine | Sigma-Aldrich | C7352-100G | L-Cysteine |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | D4540-500ML | DMSO |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 277649-100ML | Anhydrous |
| Curcumin | Sigma-Aldrich | 08511-10MG | Hydrophobic drug, curcumin |
| Rottlerin | EMD Millipore | 557370-10MG | Hydrophobic drug, rottlerin |
| PP2 | Enzo | BML-EI297-0001 | Hydrophobic drug, PP2 |
| Scintillation Vials | VWR | 2650-66022-081 | Borosilicate Glass, with Screw Cap, 20 mL. Vials for weighing peptide. |
| Falcon 50 mL Conical Centrifugation Tubes | VWR | 352070 | Polypropylene, Sterile, 50 mL. For amino acid solutions. |
References
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