Optische cross-sectionele spier gebied bepaling van Drosophila Melanogaster volwassen indirecte vlucht spieren

Summary

Wij rapporteren een methode om te kwantificeren spier gebied, dat een indirecte methode is om spiermassa in Drosophila volwassenen. We laten zien dat de toepassing van onze methodologie door het analyseren van de indirecte vlucht spieren in een Drosophila model van myotone dystrofie ziekte.

Abstract

Spiermassa verspillen, is bekend als spieratrofie, een gemeenschappelijk fenotype in Drosophila modellen van neuromusculaire ziekten. We hebben gebruik gemaakt van de indirecte vlucht spieren (IFMs) van vliegen, specifiek de dorso-longitudinale spieren (DLM), als de experimentele onderworpen aan maatregel het atrofische fenotype door verschillende genetische oorzaken teweeggebracht. In dit protocol, beschrijven we hoe te verankeren vliegen thorax spieren voor halve dunne segmenteren, het verkrijgen van een goed contrast tussen spieren en het omringende weefsel en hoe optische Microscoop afbeeldingen voor halfautomatische verwerving van meetbare gegevens wilt verwerken en analyse. We beschrijven drie specifieke toepassingen van de methodologische pijpleiding. Ten eerste, laten we zien hoe de methode kan worden toegepast om te kwantificeren spier degeneratie in een vlieg model van myotone dystrofie; Ten tweede, meting van de oppervlakte van de dwarsdoorsnede van de spier kan helpen bij het identificeren van genen die bevorderen of voorkomen spieratrofie en/of degeneratie van de spier; Ten derde, dit protocol kan worden toegepast om te bepalen of een kandidaat-verbinding kunnen aanzienlijk wijzigen een bepaald atrofische fenotype geïnduceerd door een ziekte-veroorzakende mutatieof door een milieu-trigger.

Introduction

De thorax van de fruitvlieg bevat twee verschillende klassen van de vlucht spieren, die functioneel, fysiologisch en anatomisch onderscheiden zijn. Deze spieren zijn: de indirecte vlucht spieren (IFM), die zijn samengesteld uit dorso-longitudinaal (DLM) en dorso-ventrale (DVM) spieren (Figuur 1), en de synchrone vlucht controle spieren^1,2. Deze spieren genereren samen de verhoogde mechanische kracht nodig is voor de vlucht. De grootte, de distributie en de rostro-caudal vervreemding van de IFMs toestaan een gemakkelijke oriëntatie voor transversale vectorafbeeldingsbestanden³ (figuur 2A). Om deze reden hebben wij deze spieren te bestuderen spieratrofie bij Drosophila melanogastergeselecteerd.

Figuur 1. Diagram van de thorax van de fruitvlieg tonen de indirecte vlucht spieren (IFMs) regeling. (Links) geeft een laterale weergave en (rechts) geeft een dwarsdoorsnede van de thorax. De IFMs zijn samengesteld uit de Dorso-longitudinaal (DLM) spieren (in rood) en de (DVM) Dorso-ventrale spieren (in groen).

Behoud van weefsel structuur en de controle over dorso-ventrale as oriëntatie van histologische secties zijn cruciaal voor het garanderen van adequate beoordeling van de oppervlakte van de dwarsdoorsnede van de spier. Voor het behoud van de bespiering die we een mengeling van de fixatie van Tomlinson et al. gewijzigd gebruikt ⁴ . Bovendien, omdat de spieren zijn interne weefsels, de ondoordringbaarheid van Drosophilaexoskelet is een probleem als fixatie mengsels niet kunnen tot de doel-weefsels doordringen. Om te omzeilen van dit probleem, verwijderd we het vliegen hoofd, benen, vleugels en de laatste twee segmenten van de buik maken van gaten waardoor de fixatie mengsel in te voeren. Als onderdeel van het protocol van de fixatie dat we behandeling met osmium tetroxide (OsO₄)⁵, waarin uitvoerig wordt gebruikt vanwege de mogelijkheid om op te lossen van vetten opgenomen, met inbegrip van triglyceriden. OsO₄ behoudt de meeste structuren zeer goed, met name op de cytologische niveau en tegelijkertijd geeft contrast aan de afbeelding. Na fixatie, werden Drosophila thoraces ingesloten in hars voor transversale semi-dun vectorafbeeldingsbestanden (1,5 µm). Voor verbeterd contrast, kan weefsel worden bovendien gekleurd met toluïdine blauw. Beelden van de volledige thoraces werden genomen op 10 X en spier gebied werd gekwantificeerd door de binarizing van beelden (van gelijke afmetingen) en kwantificeren van percentage van pixels overeenkomt met spierweefsel (zwarte pixels) uit totaal, met ImageJ software.

Wijzigingen op het weefsel voorbereiding en fixatie mengsels, als de stijging van de concentratie van OsO₄ en Glutaaraldehyde oplossing, geïntroduceerd in dit protocol toegestaan unieke behoud van spierweefsel. Dit is omdat het protocol vermijdt de afbraak en vervorming van het weefsel, waardoor de achterste analyseresultaten van de monsters betrouwbaarder zelfs in hoogst atrofische voorwaarden in verband met neuromusculaire degeneratieve ziekten zoals myotone dystrofie (DM). In zijn meest voorkomende vorm, DM type 1, wordt deze zeldzame genetische aandoening veroorzaakt door uitgebreide CUG herhalingen in Transcripten myotone dystrofie proteïne kinase (DMPK). Mutant DMPK RNA aggregaten formulier ribonuclear foci die sekwestreren van de Muscleblind-achtige nucleaire RNA-bindende proteïnen (MBNL1-3; Muscleblind (Mbl) in Drosophila)⁶. We genereerden een Drosophila model van myotone dystrofie met het uitspreken van 250 CTG herhalingen onder de gespierde myosin zware ketting promotor (Mhc-Gal4). Model vliegen werden loopvogel met een typische 'up-gehouden wings' fenotype en had ernstige spier atrofie in hun IFMs (figuur 2B). Eerdere studies uitgevoerd in ons laboratorium hebben aangetoond dat de bepaling van het oppervlak van de spier van IFMs is een betrouwbare methode om te kwantificeren van de effecten van verschillende chemische of genetische parameters van de spieratrofie in deze model vliegen⁷. Als voorbeeld bereikt overexpressie van Mbl isovorm C in vliegen uitdrukken van de 250 CTG in de spier herhaalt, een redding van spier gebied, zoals Mbl uitputting door sekwester is de activerende factor in DM1 pathogenese⁸ (figuur 2C). Spier gebied werd ook gered na het voeden van de DM-model vliegt met Abp1, een hexapeptide met bewezen anti-DM1 activiteit⁹ (figuur 2D).

Figuur 2. Kwantificering van dorsoventral secties van volwassen thoraces hars ingesloten. (A-D) indirecte vlucht spieren van Drosophila melanogaster met de aangegeven relevante genotypen. (A) controle vliegt (yw). (B) uitdrukking van 250 niet-coderende CTG herhaalt in de spier (UAS-CTG(250)x) veroorzaakt een vermindering van de spier gebied in DLMs in vergelijking met controle vliegen. (C) deze spier atrofie fenotype werd gered door overexpressie van Muscleblind (MblC) (UAS-CTG (250) x UAS-MblC) en (D) voeden de model vliegen met de hexapeptide Abp1 (UAS-CTG (250) x Abp1). In alle afbeeldingen is de dorsale zijde op bovenkant. Transgenen werden verdreven naar de spier met behulp van een Myosin zware-keten promotor (Mhc)-Gal4. (E) de kwantificering van percentage van de spier ten opzichte van de controle vliegen bevestigd dat de verschillen significant waren. Het histogram geeft middelen ± S.E.M. **p< 0.01 en * p < 0.05 (Student´s t-test). Schaal bar: 200 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

De methode die hier gemeld zullen van belang aan onderzoekers zich te concentreren op de spierontwikkeling, onderhoud en veroudering, ziekte pathologie en drug testen want het biedt betrouwbare informatie over hoe spierweefsel op zowel de externe als de endogene factoren reageert.

Protocol

1. fixatie en hars inbedding

1. Anesthetize de vliegen met kooldioxide (CO₂) of via hypothermie met behulp van een ijsblok. Gebruik een ontleden Microscoop (met lage vergroting te zien de hele vlieg) en schaar de poten, vleugels, hoofd en de terminal deel van buik om de penetratie van de fixeerspray te verwijderen. Voorzichtige behandeling van de karkassen is vereist bij deze stap om te voorkomen dat de vervorming van de thorax.
   Opmerking: Starten met ten minste 12 vliegen per genotype om een voldoende aantal goed verwerkte personen aan het einde van de procedure.
2. De karkassen overbrengen in een 1,5 mL-buis op ijs (het plaatsen van een maximum van 6 personen per buis) met 200 µL van oplossing 1.
   Opmerking: De karkassen niet blijven in de oplossing 1 voor meer dan 20 min.
   1. Oplossing 1, het mengen van de componenten in deze volume verhoudingen: ¼ 4% paraformaldehyde, ¼ 8% Glutaaraldehyde, ¼ 0,2 M Na₂HPO₄ en ¼ 0,2 M NaH-₂PO₄.
3. Voeg 200 µL van oplossing 2 en incubeer op ijs gedurende 30 minuten.
   1. Oplossing 2: Meng oplossing 1 en OsO₄ in een verhouding van 1:1 (v/v).
      Let op: OsO₄ is uiterst giftig. Manipuleren in een zuurkast met passende maatregelen voor veiligheid en verwijdering.
4. Alle de vloeistof afzuigen. Voeg 200 µL van oplossing 2 en incubeer op ijs gedurende 1-2 uur.
5. Verwijderen van de oplossing en uitdrogen van de monsters door een reeks graded ethanol als volgt: eens in de 30%, 50%, 70%, 90% en tweemaal in absolute ethanol; elke 5 min. Voeg 1 mL ethanol ter dekking van de monsters.
   Opmerking: Zodra het weefsel in ethanol 90% wordt geplaatst, de volgende stappen kunnen worden uitgevoerd bij kamertemperatuur.
6. Incubeer de monsters tweemaal in propyleenoxide gedurende 10 minuten elk incubatie.
   Let op: Propyleenoxide is giftig, gebruiken in een zuurkast.
7. De propyleenoxide vervangen door een 1:1 (v/v) mengsel van epoxy hars en propyleen oxide en na een nacht bebroeden bij kamertemperatuur.
   Let op: De hars is uiterst giftig in een vloeibare staat. De hars is beschikbaar als een set van vier componenten (A, B, C en D).
   1. Voor epoxyhars, Voeg in een wegwerp bekerglas 54 g van hars (A), 44,5 g verharder (B), 2,5 g van accelerator (C) en 10 g weekmaker (D). Alle onderdelen van de hars in een zuurkast te combineren. Bewaar de hars in aliquots bij-20 ° C (voor maximaal 6 maanden) of bij-80 ° C (voor meerdere jaren).
   2. Als u wilt negeren de hars, bak het bij 70 ° C gedurende 24 uur omdat solide hars niet giftig is. Negeren van alle eerdere oplossingen in de groep van de zware metalen volgens passende internationale procedures, omdat oplossingen sporen van OsO bevatten kunnen_4.
8. Het voorgaande mengsel vervangen door 100% hars, en de monsters gedurende 4 uur uit te broeden.
9. De karkassen overbrengen in plastic mallen met nieuwe hars (een karkas in elk putje van de schimmel). Gebruik een scherp houten stok of naald om te dragen en oriënteren van de karkassen in de putjes en laat de hars te polymeriseren 's nachts in een oven van Pasteur bij 70 ° C.
   Opmerking: Om ervoor te zorgen de juiste oriëntatie van de karkassen voor posterieure trimmen en segmenteren, de karkassen moeten liegen op hun lange kant, met het voorste deel van het karkas zeer dicht bij de rand van de put.

2. trimmen en segmenteren van blokken

1. De gepolymeriseerde hars blokken uit de mallen te verwijderen. Scheermesjes trim weg het hars, een trapeziumvormige vorm rondom het karkas en passende afdrukrichting geven in de microtoom gebruiken Start alle de karkassen afdelen na de dwarse hechtdraad om vergelijkbare resultaten te verkrijgen.
   Opmerking: De sectie moet loodrecht op de as van de anteroposterior van het DLMs trim het monster correct ( Figuur 3).

Figuur 3 . Dorsoventral delen van hars-embedded volwassen thoraces van de myotone dystrofie model vliegen. In (A) was het wegsnijden van de steekproef niet correct als de sectie in het dorsale-recht gedeelte van de afbeelding niet volledig transversale naar de spieren was. Dientengevolge, lijken de drie spier-bundels op de hogere rechterkant groter dan die van de linkerzijde. Deze fout zou resulteren in een overschatting van het spier gebied. (B) gedeelte van een blok van de correct bijgesneden hars. Schaal bar: 200 µm.

1. Snijden 1.5-µm dik secties met een ultramicrotome en breng de secties in waterdruppels gelatinized dia's.
   1. Het verkrijgen van de secties uit het mesothorax segment voor alle monsters om vergelijkbare resultaten te verkrijgen.
2. Plaats de dia's met de secties op een blok van de verwarming bij 70-80 ° C, totdat de H₂O is verdampt. Op dit punt, kunnen de monsters worden waargenomen met het OsO₄ contrast (figuur 4A).

3. kleuring IFM secties

1. Dekking van de secties met genoeg toluïdine blauw voor ongeveer 30 s op het blok van de verwarming.
   1. Ontbinden voor toluïdine blauwe oplossing, 1% van toluïdine blauwe en 1% van borax in H₂O.
2. Spoel met H₂O en laat de dia's op een warme plaat te verdampen van het water. Herhaal de kleuring met toluïdine blauw als het contrast moet worden verbeterd (figuur 4B).

Figuur 4 . Dorsoventral delen van hars-embedded volwassen thoraces met verschillende contrast technieken. Beide panelen tonen beelden van DM1 model vliegen gevoed met Abp1 zoals in figuur 2D. (A) afbeelding van een sectie met de OsO₄ contrast. (B) gedeelte gekleurd met toluïdine blauwe kunt betere visualisatie van de spier-bundels. Schaal bar: 200 µm.

4. montage IFM secties

1. Droog de dia's met de verwarming blokkeren totdat de H₂O is verdampt.
2. Zet 1 of 2 druppels van montage medium op de secties en zet op een dekglaasje aan.
   Let op: Uit deze stap in een zuurkast te voeren omdat het medium montage giftig is.

5. verwerving van beelden en kwantificering van spier gebied

1. Neem de beelden bij lage vergroting zodat de hele reeks van DLM spieren in focus is. Wij gebruiken normaal 10 X.
   1. Voor statistische analyse ten minste 5 seriële beelden per fly nemen en analyseren van ten minste 5 vliegen per experimentele groep.
2. Selecteer de afbeelding met de hele spieren (figuur 5A). Controleren van de as of de richting van de sectie en het negeren van de monsters met ongepaste oriëntatie, die de resultaten zou verstoren (vergelijk cijfers 3A / 3B onderscheid maken tussen slecht en goed georiënteerd secties, respectievelijk).
3. ImageJ software gebruiken voor het selecteren van een gebied (in pixels) met alleen de DLM (figuur 5A/5B). Het referentie-gebied moet worden gebruikt voor de vergelijking tussen verschillende experimentele groepen, zou altijd de vlieg met de grootste spieren zijn. In alle afbeeldingen van de verschillende genotypen wilt vergelijken, selecteert u een gebied met DLMs van gelijke afmetingen aan de reference ruimte (figuur 5B).
4. De beelden met de opdracht afbeelding-J binarize: Proces/Binary/Make binaire en schrap de gebieden of pixels die niet overeenkomen met de spieren van belang (figuur 5C).
   1. In het geval dat artefactual zwarte vlekken op andere gebieden dan spier weergegeven, verwijderen met de opdracht hulpmiddelen voor tekenen en selecteert u het symbool van de gum.

Figuur 5 . Afbeelding van de analyseprocedure voor spier gebied bepaling. (A) transversale gedeelte van myotone dystrofie type 1 model vliegen thorax met een rechthoek bevattende de DLM. (B) het geselecteerde gebied met alleen de indirecte vlucht spieren en de darm (*). (C) Binarized de afbeelding. De zwarte gebieden komen overeen met de spieren van belang. De darm is voor een nauwkeurige kwantificering van spier gebied gewist. Schaal bar: 200 µm.

5. Kwantificeren van percentage van pixels overeenkomt met spierweefsel (zwarte pixels) uit totaal met het commando: Analyze/meting en selecteer de optie gebied breuk. Dit percentage van ruimte is een schatting van de DLM spiermassa van elke vliegen.

Representative Results

Te kwantificeren of de overexpressie van MblC of het beheer van Abp1 had geen effect in het atrofische fenotype van het myotone dystrofie vliegen model dat richtten we ons op de DLM, die deel van de IFMs (Figuur 1 uitmaken). Wij vastbesloten dat het model vliegt, die express 250 niet-coderende CTG herhaald gedurende de daaraan gehechte spiermassa, gedreven door de promotor Myosin zware-keten (Mhc)-Gal4, hadden een 50% vermindering van de spier gebied in vergelijking met controle vliegen. In tegenstelling, co uitdrukking van MblC en uitgebreide CTG herhalingen met hetzelfde stuurprogramma, sterk onderdrukt dergelijke fenotype en crossectional spier gebied was 70% van de (normale) vliegen controle. Beheer van de Abp1 hexapeptide in de voedselkwaliiteit media onderdrukt ook de atrofische fenotype en model vliegen die had genomen de compound bleek ongeveer 60% van de normale spier gebied (in plaats van 50% dat is een typisch voorbeeld van DM1 vliegen; Figuur 2E). Voor het kwantificeren van deze monsters gebruikten we secties gekleurd met toluïdine blauw om contrast (figuren 4 en 5).

Wij stellen vast dat een aantal technische storingen tijdens de procedure aanzienlijk met de definitieve kwantificering interfereren kan. Een gemeenschappelijk is dat hars blokken niet correct bijgesneden zijn, die kan het monster misorient en leiden tot schuine afdelen van het DLMs. Dientengevolge, sommige spieren DLM kunnen kijken groter aan de ene kant in vergelijking met de contralaterale (zie bijvoorbeeld Figuur 3), die een belangrijke fout in de definitieve kwantificering introduceert. Een andere fout die kan optreden is onvoldoende penetratie van de fixeerspray in het spierweefsel (Figuur 6), die ziet er aangetaste en misvormde de nauwkeurige kwantificering van het spier gebied niet onmogelijk maken.

Discussion

Het is aangetoond dat Drosophila melanogaster een nuttig model is te bestuderen van neuromusculaire ziekten bij de mens^7,10,11, met inbegrip van myotone dystrophie, die worden gekenmerkt door het verschijnen van musculaire atrofie. Het protocol hier gepresenteerd is een nuttig instrument voor het kwantificeren van de degeneratie van de spieren veroorzaakt door het ontstaan of de progressie van een bepaalde ziekte in een vlieg model. Bijvoorbeeld, is het ook mogelijk om te volgen en te kwantificeren van de degeneratie van spiervezels door het uitvoeren van deze analyse in vliegen van verschillende leeftijden.

Er zijn kritische stappen in het protocol. De tijd die nodig is om te ontleden de vliegen voor hun fixatie moet worden geminimaliseerd om te voorkomen dat de aantasting van het weefsel. Voor de penetratie van de kleefpoeders oplossing in de spieren (Figuur 6) is het belangrijk om het hoofd, de vleugels en de poten van de vliegen om toegang van de oplossingen voor het interieur van de vlieg. Het is noodzakelijk dat er transversale secties waarin de spieren van belang volledig zichtbaar zijn. De binarization van de monsters voor de kwantificering is kritisch, ja de opmerking dat de geselecteerde pixels (zwarte pixels) komen met het weefsel van belang en het hele gebied van belang overeen is geselecteerd.

Figuur 6. Volwassen Drosophila thorax met onvoldoende penetratie van de fixeerspray in de spieren (*), waardoor de afbraak en vervorming van het weefsel tijdens de verwerking van het monster. Schaal bar: 200 µm.

Een van de in dit protocol gebruikte reagentia is OsO₄, die behoudt de meeste structuren zeer goed, met name op de cytologische niveau, en op hetzelfde moment geeft contrast aan de afbeelding⁵. Een belangrijk nadeel van de methode is echter de toxiciteit van het OsO₄, die altijd moet worden gebruikt in een zuurkast en vereist, veilige hantering en verwijdering. Dit protocol niet alleen staat nauwkeurig kwantificering van spierweefsel als gevolg van de vaststelling en inbedding van de procedure, het kan ook worden gebruikt voor een andere toepassing zoals elektronenmicroscopie (EM) voorbereiding. Het lijdt echter een intrinsieke beperking omdat de resulterende histologische secties kunnen niet worden gebruikt in daaropvolgende testen, zoals immunohistochemie.

Ten slotte, deze methode is ook geoptimaliseerd voor het detecteren van kleine spier gebied verschillen waardoor een betrouwbare identificatie van modifiers in genetische of chemische schermen^8,9. Niettemin, aangezien verhoogde spier gebied betekent niet noodzakelijkerwijs betere functie van de spier, transversale spier gebied bepaling moet worden ideaal gecorreleerd met functionele testen zoals vlucht testen¹².

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Image-J software	National Institutes of Health		https://imagej.nih.gov/ij/
Ultramicrotome	Leica	Leica UC6
Microscope	Leica	Leica MZ6	Bright field technique.
Razor blades	Electron Microscopy Sciences	71970	Several alternative providers exist.
Scissors	World Precision World	14003	Several alternative providers exist.
Embedding molds	Electron Microscopy Sciences	70900	Several alternative providers exist.
Glutaraldehyde	Fluka (Sigma)	49624	Toxic.
OsO4	Polyscience	0972A	Extremely toxic.
Propylene oxide	Sigma Aldrich	82320-250ML	Extremely toxic.
resin (Durcupan)	Sigma Aldrich	44611-44614	Carcinogenic when it is unpolymerized.
Toluidine blue	Panreac	251176	Toxic.
Mountant Medium (DPX)	Sigma Aldrich	44581	Dangerous.
Paraformaldehyde	Sigma Aldrich	P6148-500G	Harmful.
Na2HPO4	Panreac	122507	0.2 M dilution.
NaH2PO4	Panreac	121677	0.2 M dilution.
Borax	Panreac	3052	Toxic.