Определение области оптических поперечных мышц Drosophila Melanogaster взрослых косвенные рейса мышц

Summary

Мы приводим метод количественного определения мышц области, которая является косвенным методом для определения мышечной массы у дрозофилы взрослых. Мы демонстрируем применение нашей методологии путем анализа косвенных полет мышцы в модели дрозофилы Миотонической дистрофии болезни.

Abstract

Мышечной массы тратить, известный как атрофия мышц, является общим фенотип в моделях дрозофилы нервно-мышечных заболеваний. Мы использовали косвенные полет мышцы (IFMs) мух, специально dorso продольные мышцы (DLM), как экспериментальная при условии меру, атрофический фенотип, вызванные различными генетическими причинами. В этом протоколе, мы описываем, как вставлять летать грудной мышцы для полу тонкой секционирование, как получить хороший контраст между мышц и окружающих тканей и как обрабатывать изображения оптический микроскоп для полуавтоматического приобретение количественных данных и анализ. Мы опишем три конкретных приложений методологических трубопровода. Во-первых мы покажем, как метод может быть применен для количественного определения дегенерации мышц в Миотонической дистрофии летать модели; Во-вторых измерение площади поперечного сечения мышцы может помочь выявить гены, которые либо способствовать, либо предотвращения атрофии мышц и/или мышечной дегенерацией; в-третьих, этот протокол может применяться для определения, является ли соединение кандидат сможет значительно изменить заданный атрофический фенотип, индуцированные мутации заболевани причиняяили экологических триггер.

Introduction

Грудная клетка плодовая муха содержит две различные классы полета мышц, которые функционально, физиологически и анатомически отличаются. Эти мышцы являются: косвенные полет мышцы (IFM), которые состоят из dorso продольная (DLM) и dorso вентральный (DVM) мышцы (рис. 1) и синхронных полета контролировать мышцы^1,2. Вместе эти мышцы генерировать повышенной механической энергии, необходимые для полета. Размер, распределение и rostro хвостового распоряжения IFMs позволяют легко ориентации для поперечной секущей³ (рис. 2A). По этой причине мы выбрали эти мышцы для изучения атрофии мышц в Drosophila melanogaster.

Рисунок 1. Диаграмма грудной клетки плодовой мушки, показаны косвенные полет мышцы (IFMs) соглашения. (Слева) представляет собой вид сбоку и (справа) представляет собой сечения грудной клетки. IFMs состоят из Dorso продольная (DLM) мышц (в красном) и Dorso вентральный (DVM) мышцы (в зеленом).

Сохранение структуры ткани и контроль над ориентации оси dorso вентральной Гистологические срезы решающее значение для обеспечения надлежащей оценки площади поперечного сечения мышцы. Чтобы сохранить структуру мышц мы использовали смесь фиксации изменения от Томлинсон и др. ⁴ . Кроме того потому что мышцы внутренних тканей, непроницаемости дрозофилыэкзоскелет представляет собой проблему как фиксации, что смеси не может проникнуть в тканях-мишенях. Чтобы обойти эту проблему, мы удалили летать голова, ноги, крылья и две последние сегменты живота для создания отверстия, которые позволили фиксации смесь ввести. В рамках протокола фиксации, мы включили лечения с осмия тетраоксид (₄OsO)⁵, который широко используется из-за его способности исправить жиров, в том числе триглицеридов. OsO₄ сохраняет большинство структур чрезвычайно хорошо, особенно на уровне цитологического и в то же время обеспечивает контраст изображения. После фиксации дрозофила thoraces были внедрены в смолы для поперечной полутонкая резания (1,5 мкм). Для повышения контраста ткань может быть дополнительно окрашенных толуидиновый синий. Изображения полного thoraces были взяты на 10 X и мышц области был количественно binarizing изображения (равных размеров) и количественного определения процент пикселей, соответствующий мышечной ткани (черных точек) из всего, с ImageJ программного обеспечения.

Изменения на ткани подготовки и фиксации смеси, как увеличение концентрации раствора OsO₄ и глютаральдегид, представил в настоящем Протоколе, позволило уникальный сохранение мышечной ткани. Это потому, что протокол позволяет избежать деградации и деформации ткани, делая задняя анализ образцов более надежным даже в весьма атрофический условий, связанных с нервно-дегенеративные заболевания такие как Миотонической дистрофии (DM). В своей более общей форме, DM типа 1, это редкое генетическое заболевание вызвано расширенной заг повторяется в стенограммы протеинкиназы Миотонической дистрофии (DMPK). Мутант DMPK РНК агрегатов очагов ribonuclear формы, которые секвестр Muscleblind как ядерные RNA-связывая протеинов (MBNL1-3; Muscleblind (Mbl) у дрозофилы)⁶. Мы создали модель дрозофилы Миотонической дистрофии выразить 250 CTG-повторов в мышечной миозин тяжелые цепи промоутер (Mhc-Gal4). Модели мух были нелетающих с типичной «провел вверх крылья» фенотип и серьезный мышечные атрофии в их IFMs (рис. 2B). Предыдущие исследования выполняются в нашей лаборатории показали, что определение области мышц IFMs является надежным методом для количественной оценки воздействия различных химических или генетических модификаторы атрофии мышц в этих мух модель⁷. Как, например гиперэкспрессия изоформы Mbl, которую C в мух, выражая 250 КТГ повторяется в мышцу, достичь спасения мышц области, как истощение Mbl путем поглощения является пусковым фактором DM1 патогенеза⁸ (рис. 2 c). Мышц области также был спасен после кормления модель DM летит с Abp1, гексапептида с проверенной анти DM1 деятельность⁹ (Рисунок 2D).

Рисунок 2. Количественная оценка dorsoventral слоев смолы встроенный взрослых thoraces. (A-D) косвенные полет мышцы Drosophila melanogaster с указанной соответствующих генотипов. (A) управления мухи (yw). (Б) выражение 250 некодирующих КТГ повторяется в мышцах (UAS-CTG(250)x) вызвало сокращение мышц области в DLMs по сравнению с контролем мух. (C) этот фенотип атрофия мышц был спасен Сверхэкспрессия Muscleblind (MblC) (UAS-КТГ (250) x бла-MblC) и (D) кормления модель мух с гексапептида Abp1 (бас-КТГ (250) x Abp1). Во всех изображениях спинной стороне находится на вершине. Трансгенов были вынуждены мышц с помощью промоутера тяжелой цепи миозина (Mhc)-Gal4. (E) количественной оценки доли мышц области относительно мух управления подтвердил, что различия были значительными. Гистограмма показывает средства ± S.E.M. **p< 0.01 и * p < 0,05 (Student´s t тест). Линейки: 200 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Метод здесь сообщили будет представлять интерес для исследователей, упором на развитие мышц, обслуживания и старения, болезни патологии и наркологическая экспертиза как она обеспечивает надежную информацию о как мышечная ткань реагирует как внутреннего, так и внешних факторов.

Protocol

1. Фиксация и встраивание смолы

1. Анестезировать мух с углекислым газом (CO₂) или с помощью гипотермии, с помощью блока льда. Используйте ножницы и рассечения микроскоп (с низким увеличением увидеть весь Муха) для удаления ноги, крылья, голова и терминала частью живота для упрощения пенетрации фиксатором. На этот шаг, чтобы избежать деформации грудной клетки, требуется тщательное обработка туши.
   Примечание: Начните с по крайней мере 12 мух на генотип обеспечить достаточное количество правильно обработанные лиц в конце процедуры.
2. Передача туши до 1,5 мл на льда (размещение максимум 6 человек в трубку) содержащий 200 мкл раствора 1.
   Примечание: Туши не может оставаться в решении 1 для более чем 20 мин.
   1. Для решения 1, смешать компоненты в эти тома пропорции: ¼ параформальдегида 4%, ¼ 8% глютаральдегид, ¼ 0,2 М Na₂HPO₄ и ¼ 0,2 М NaH₂PO₄.
3. Добавить 200 мкл раствора 2 и инкубировать на льду за 30 мин.
   1. Решение 2: Смешать раствор 1 и₄ OsO в пропорции 1:1 (v/v).
      Предупреждение: OsO₄ является чрезвычайно токсичным. Управлять Зонта с надлежащие меры безопасности и утилизации.
4. Удалите все жидкости. Добавить 200 мкл раствора 2 и инкубировать на льду для 1-2 ч.
5. Удаление решения и обезвоживанию образцы через серию градуированных этанола следующим: один раз в 30%, 50%, 70%, 90% и дважды в абсолютного этанола; 5 мин. Добавьте 1 mL этанола для покрытия образцы.
   Примечание: После того как ткань помещается в 90% этанола, последующие шаги может производиться при комнатной температуре.
6. Проинкубируйте образцы дважды в окись пропилена на 10 минут каждый инкубации.
   Предупреждение: Оксид пропилена является токсичным, использовать его в зонта.
7. Заменить окись пропилена смесь 1:1 (v/v) эпоксидной смолы и пропилена оксида и инкубировать на ночь при комнатной температуре.
   Предупреждение: Смола является чрезвычайно токсичным в жидком состоянии. Смола доступен набор из четырех компонентов (A, B, C и D).
   1. Для эпоксидных смол добавьте в одноразовый стакан 54 g смолы (A), 44,5 g отвердителя (B), 2,5 g ускорителя (C) и 10 g пластификатора (D). Объединить все смолы компоненты зонта. Храните смолы в аликвоты при-20 ° C (на срок до 6 месяцев) или при температуре-80 ° C (за несколько лет).
   2. Отказаться от смолы, выпекайте при 70 ° C для 24 h потому что твердые смолы не является токсичным. Отменить все предыдущие решения в группе тяжелых металлов согласно соответствующих международных процедур, так как решения могут содержать следы OsO_4.
8. Заменить предыдущий смесь 100% смолы и Проинкубируйте образцы для 4 ч.
9. Передать туши пластиковые формы, содержащие новой смолы (один каркас в каждой скважине плесень). Используйте заточенной деревянной палочкой или иглы для передачи и ориентировать туши в скважинах и оставить смолы для полимеризации на ночь в духовке Пастера в 70 ° C.
   Примечание: Для обеспечения соответствующей ориентации туш для задней обрезки и секционирование, туши должна лежать на их длинной стороне, с передней частью туши очень близко к краю колодца.

2. Обрезка и разрезания блоков

1. Удалите блоки полимеризованная смола из формы. Используйте лезвия для обрезки от смолы, трапециевидную форму окружающих каркаса и дать соответствующую ориентацию в микротома. Начало, секционирование всех туш после поперечных швов для получения сопоставимых результатов.
   Примечание: Секция должно быть перпендикулярно оси переднезаднем DLMs правильно обрезать образца ( рис. 3).

Рисунок 3 . Dorsoventral разделы смолы встроенный взрослых thoraces Миотонической дистрофии модель мух. (A) обрезки образца не был правильно как раздел в спинной правой части изображения не был полностью поперечные мышцы. Как следствие три мышечных пучков в верхней правой части кажется больше чем те, с левой стороны. Эта ошибка приведет к завышению области мышц. (B) раздела из блока правильно обрезать смолы. Линейки: 200 мкм.

1. Cut 1,5 мкм толщиной секции с ultramicrotome и передачи gelatinized слайды разделы в капли воды.
   1. Получите разделы из сегмента mesothorax для всех образцов получать сопоставимые результаты.
2. Место слайды, содержащий разделы на Отопление блока на 70-80 ° C до тех пор, пока H₂O испаряется. На данный момент образцы можно наблюдать с контрастом₄ OsO (рис. 4A).

3. Окрашивание IFM секций

1. Охватывают разделы с достаточно толуидиновый синий для примерно 30 s на Отопление блока.
   1. Для решения толуидиновый синий Растворите 1% толуидиновый синий и 1% буры в H₂O.
2. Промойте с H₂O и оставить слайды на теплой плите для выпаривания воды. Повторить окрашивание с толуидиновый синий Если контраст необходимо укрепить (рис. 4В).

Рисунок 4 . Dorsoventral разделы смолы встроенный взрослых thoraces с различными контраст stainings. Обе панели показывают изображения DM1 модель мух кормили с Abp1 как в 2D фигура. (A) изображение раздела с контрастом₄ OsO. (B) раздела, окрашенных с толуидиновый синий позволяет лучше визуализация мышечных пучков. Линейки: 200 мкм.

4. Монтаж IFM разделы

1. Сухие слайды с блоком Отопление до тех пор, пока H₂O испаряется.
2. Положите 1 или 2 капли среднего монтажа на участках и поставить на coverslip.
   Предупреждение: Выполнять этот шаг в вытяжной шкаф, поскольку монтаж среднего является токсичным.

5. приобретение изображений и количественной оценки мышц области

1. Возьмите изображения при низком увеличении, так что весь набор DLM мышц находится в фокусе. Мы обычно применяем 10 X.
   1. Для статистического анализа принять по крайней мере 5 последовательных изображений на лету и анализировать по крайней мере 5 мух в экспериментальной группе.
2. Выберите изображение, содержащее весь мышцы (рис. 5A). Проверьте оси или ориентации секции и отмена образцах с неуместным ориентации, который бы исказить результаты (сравнить цифры 3A / 3B различать плохо и хорошо ориентированных на секции, соответственно).
3. ImageJ программное обеспечение используйте для выбора области (в пикселях), содержащий только DLMs (Рисунок 5A/5B). Для сравнения между различными группами экспериментальный область ссылки, чтобы использоваться всегда будет лететь с больших мышц. Во всех изображениях различных генотипов для сравнения, выберите область, содержащую DLMs равных размеров в область ссылки (Рисунок 5B).
4. Бинаризация изображения с помощью команды Image-J: Процесс/двоичный/сделать бинарный и удаление областей или пикселы, которые не соответствуют мышцы интерес (рис. 5 c).
   1. В случае артефакта черные пятна появляются в других областях, помимо мышц удалить их с помощью команды инструменты рисования и выберите символ ластика.

Рисунок 5 . Изображения процедуры анализа для определения области мышц. (A) поперечном разрезе Миотоническая Дистрофия типа 1 модели летать грудной клетки с прямоугольник, содержащий DLM. (B) выделенную область с помощью только косвенные полет мышцы и ЖКТ (*). (C) Binarized изображения. Черные области соответствуют мышцы интерес. Для точного количественного определения мышц области была стерта кишечника. Линейки: 200 мкм.

5. Подсчитать количество пикселей, соответствующий мышечной ткани (черных точек) из общей с командой: Анализ Измерение и выберите параметр области дроби. Этот процент площади является оценка DLM мышечной массы каждого летать.

Representative Results

Поддается ли Сверхэкспрессия MblC или администрации Abp1 никакого эффекта в атрофический фенотип Миотонической дистрофии летать модели мы сосредоточились на DLMs, которые являются частью IFMs (рис. 1). Мы определили, что модель летит, который Экспресс 250-кодирования КТГ повторяется по всей мускулатуры, движимый тяжелой цепи миозина промоутер (Mhc)-Gal4, имел 50% сокращение мышц области по сравнению с контролировать мух. В противоположность этому, Сопредседатель выражение MblC и расширенной CTG-повторов с тот же драйвер, сильно подавлены такой фенотип и crossectional мышц области было 70% (нормальный) мух управления. Администрация Abp1 гексапептида в питательный СМИ аналогично подавлены атрофический фенотип и модель мух, которые имели соединение, показали примерно 60% нормальной мышечной области (вместо 50%, что является типичным DM1 мухи; Рисунок 2E). Для количественной оценки этих образцов мы использовали секций, окрашенных с толуидиновый синий для повышения контраста (рисунки 4 и 5).

Мы отмечаем, что во время процедуры ряд технических сбоев может значительно мешают окончательной количественной оценки. Один общий является, что смола блоков, не усекаются правильно, который может misorient образца и привести к косой секционирование DLMs. Как следствие, некоторые мышцы DLM может выглядеть больше, с одной стороны, по сравнению с контралатеральной (см. например рис. 3), который вводит значительные ошибки в окончательной количественной оценки. Еще одна ошибка, которая может возникнуть, является недостаточное проникновение фиксатором в мышечной ткани (рис. 6), который выглядит деградированных и деформируется, делает невозможным точное количественное определение области мышц.

Discussion

Было продемонстрировано, что дрозофилы является полезной моделью для изучения нервно-мышечных заболеваний человека^7,10,11, включая Миотонической дистрофии, которые характеризуются внешний вид мышечной атрофии. Протокол, представленные здесь является полезным инструментом для количественной оценки дегенерации мышц, вызванные наступлением или прогрессирование заболевания определенной в модели летать. Например это также можно следовать и количественно перерождение мышечных волокон, выполняя этот анализ в мух разных возрастов.

В протоколе есть важные шаги. Время, необходимое для рассечения мух, прежде чем их крепления должны быть сведены к минимуму, чтобы избежать деградации ткани. Для проникновения фиксирующие решения в мышцах (рис. 6) важно удалить голову, крылья и ноги мух для обеспечения доступа решения для интерьера лету. Это важно для получения поперечных разделы, в которых полностью видны мышцы интерес. Бинаризации образцов для количественной оценки имеет решающее значение, так что обратите внимание, что выделенных пикселов (черных точек) соответствуют ткани интерес и вся область интереса выбран.

Рисунок 6. Взрослый дрозофилы грудной клетки с недостаточным проникновением фиксатором в мышцах (*), которая приводит к деградации и деформации ткани во время обработки образца. Линейки: 200 мкм.

Один из реактивы, используемые в настоящем Протоколе является OsO₄, который сохраняет большинство структур чрезвычайно хорошо, особенно на уровне цитологическим и в то же время обеспечивает контраст изображения⁵. Однако важным недостатком метода является токсичность OsO₄, который всегда должен использоваться в зонта и требует безопасного обращения и утилизации. Этот протокол позволяет не только точная количественная оценка мышечной ткани за счет установления и внедрения процедуры, он может также использоваться для другого приложения, например подготовка электронной микроскопии (EM). Однако он страдает внутреннее ограничение, потому что результирующий Гистологические срезы не может использоваться в последующих анализов, например иммуногистохимия.

Наконец этот метод также оптимизирован для обнаружения мелких мышц области различия, таким образом позволяя надежной идентификации модификаторов в генетических или химического экраны^8,9. Тем не менее поскольку увеличение мышечной области не обязательно подразумевает лучше функции мышц, определения площади поперечных мышц следует быть идеально коррелирует с функциональных анализов такие, как полет assays¹².

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Image-J software	National Institutes of Health		https://imagej.nih.gov/ij/
Ultramicrotome	Leica	Leica UC6
Microscope	Leica	Leica MZ6	Bright field technique.
Razor blades	Electron Microscopy Sciences	71970	Several alternative providers exist.
Scissors	World Precision World	14003	Several alternative providers exist.
Embedding molds	Electron Microscopy Sciences	70900	Several alternative providers exist.
Glutaraldehyde	Fluka (Sigma)	49624	Toxic.
OsO4	Polyscience	0972A	Extremely toxic.
Propylene oxide	Sigma Aldrich	82320-250ML	Extremely toxic.
resin (Durcupan)	Sigma Aldrich	44611-44614	Carcinogenic when it is unpolymerized.
Toluidine blue	Panreac	251176	Toxic.
Mountant Medium (DPX)	Sigma Aldrich	44581	Dangerous.
Paraformaldehyde	Sigma Aldrich	P6148-500G	Harmful.
Na2HPO4	Panreac	122507	0.2 M dilution.
NaH2PO4	Panreac	121677	0.2 M dilution.
Borax	Panreac	3052	Toxic.