Optische Cross-sectional Muskel Bereich Bestimmung von Drosophila Melanogaster Erwachsenen indirekten Flugmuskeln

Zusammenfassung

Wir berichten über eine Methode, um Muskelgebiet, zu quantifizieren, ist eine indirekte Methode Muskelmasse bei Drosophila Erwachsenen bestimmen. Wir demonstrieren die Anwendung unserer Methode durch die Analyse des indirekten Flugs in einem Drosophila -Modell myotonische Dystrophie Krankheit Muskeln.

Zusammenfassung

Muskelmasse zu verlieren, ist bekannt als Muskelatrophie, einen gemeinsamen Phänotyp in Drosophila -Modellen der neuromuskulären Erkrankungen. Wir haben die indirekten Flugmuskeln (Schnittstellenmodule) fliegen, speziell der dorsal-Längsmuskeln (DLM), als die experimentelle gegen die verwendet, die atrophische Phänotyp durch unterschiedliche genetische Ursachen herbeigeführt. In diesem Protokoll beschreiben wir fliegen Thorax Muskeln für halb dünn schneiden einbetten, das einen guten Kontrast zwischen Muskel und das umgebende Gewebe zu erhalten und das optische Mikroskopbilder für halbautomatische Erfassung von quantifizierbaren Daten verarbeiten und Analyse. Wir beschreiben drei spezifische Anwendungen der methodischen Pipeline. Zunächst zeigen wir, wie die Methode angewendet werden kann, um Muskeldegeneration in einem myotonische Dystrophie Fly Modell zu quantifizieren; Zweitens helfen Messung der Muskel Querschnittsfläche, um Gene zu identifizieren, die entweder zu fördern oder zu, Muskelatrophie und/oder Muskeldegeneration verhindern; Drittens kann dieses Protokoll angewendet werden, um festzustellen, ob eine Kandidatenverbindung in der Lage, einen bestimmten atrophischen Phänotyp, induziert durch eine ursächliche Mutation wesentlich zu ändern istoder durch ein Umwelt-Trigger.

Einleitung

Der Thorax der Fruchtfliege enthält zwei verschiedene Klassen von Flugmuskeln, die funktionell, physiologisch und anatomisch unterscheiden. Diese Muskeln sind: die indirekten Flugmuskeln (IFM), die von dorsal längs (DLM) und dorsal-Ventral (DVM) Muskeln (Abbildung 1) und die synchrone Flug bestehen Steuern Muskeln^1,2. Diese Muskeln erzeugen zusammen die erhöhte mechanische Leistung für Flug benötigt. Die Größe, Verteilung und Rostro-kaudalen Disposition der die Schnittstellenmodule ermöglichen eine einfache Orientierung für transversale Stationspunkte³ (Abbildun....

Protokoll

(1) Fixierung und Harz einbetten

1. Die fliegen mit Kohlendioxid (CO₂) oder via Hypothermie mit einem Eisblock zu betäuben. Verwenden Sie einen sezierenden Mikroskop (mit geringer Vergrößerung zu sehen, die ganze Fliege) und Schere um zu entfernen, die Beine, Flügel, Kopf und terminal Teil des Abdomens, das Eindringen der Fixativ zu erleichtern. Schonung der Kadaver ist erforderlich bei diesem Schritt um die Verformung des Brustkorbs zu vermeiden.
   Hinweis: Starten Sie mit mindestens 12 fliegen pro Genotyp um eine ausreichende Anzahl von richtig verarbeitete Individuen am Ende des Verfahrens.
2. Übertragen Sie die Kadaver auf eine 1,5 mL-Tub....

Ergebnisse

Um zu bestimmen ob die Überexpression von MblC oder die Verwaltung von Abp1 keine Wirkung in der atrophischen Phänotyp des Modells myotonische Dystrophie fliegen hatte konzentrierten wir uns auf die DLMs, die Schnittstellenmodule (Abbildung 1) gehören. Wir festgestellt, dass das Modell fliegt die express 250 nicht-kodierenden CTG Wiederholungen in der Muskulatur, angetrieben durch den Projektträger Myosin Heavy Chain (Mhc),-Gal4, hatte eine Ermäßigun.......

Diskussion

Es hat sich gezeigt, dass Drosophila Melanogaster eine nützliche Modell zur menschlichen neuromuskulären Erkrankungen^7,10,11, einschließlich myotonische Dystrophien, charakterisiert durch das Auftreten von Muskelatrophie. Das Protokoll hier vorgestellten ist ein nützliches Instrument zur Quantifizierung der Muskeldegeneration durch das auftreten oder Fortschreiten einer bestimmten Krankheit in einem Fly Modell verursach.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Image-J Software	National Institutes of Health		https://imagej.nih.gov/ij/
Ultramikrotom	Leica	Leica UC6
Mikroskop	Leica	Leica MZ6	Hellfeldtechnik.
Rasierklingen	Elektronenmikroskopie Wissenschaften	71970	Es gibt mehrere alternative Anbieter.
Schere	World Precision World	14003	Es gibt mehrere alternative Anbieter.
Einbettformen	Elektronenmikroskopie Wissenschaften	70900	Es gibt mehrere alternative Anbieter.
Glutaraldehyd	Fluka (Sigma)	49624	Giftig.
OsO4	Polyscience	0972A	Extrem giftig.
Propylenoxid	Sigma Aldrich	82320-250ML	Extrem giftig.
Harz (Durcupan)	Sigma Aldrich	44611-44614	Karzinogen, wenn es nicht polymerisiert ist.
Toluidinblau	Panreac	251176	Giftig.
Eindeckmittel (DPX)	Sigma Aldrich	44581	Gefährlich.
Paraformaldehyd	Sigma Aldrich	P6148-500G	gesundheitsschädlich.
Na2HPO4	Panreac	122507	0,2 M Verdünnung.
NaH2PO4	Panreac	121677	0,2 M Verdünnung.
Borax	Panreac	3052	Giftig.