Optische Cross-sectional Muskel Bereich Bestimmung von Drosophila Melanogaster Erwachsenen indirekten Flugmuskeln

Summary

Wir berichten über eine Methode, um Muskelgebiet, zu quantifizieren, ist eine indirekte Methode Muskelmasse bei Drosophila Erwachsenen bestimmen. Wir demonstrieren die Anwendung unserer Methode durch die Analyse des indirekten Flugs in einem Drosophila -Modell myotonische Dystrophie Krankheit Muskeln.

Abstract

Muskelmasse zu verlieren, ist bekannt als Muskelatrophie, einen gemeinsamen Phänotyp in Drosophila -Modellen der neuromuskulären Erkrankungen. Wir haben die indirekten Flugmuskeln (Schnittstellenmodule) fliegen, speziell der dorsal-Längsmuskeln (DLM), als die experimentelle gegen die verwendet, die atrophische Phänotyp durch unterschiedliche genetische Ursachen herbeigeführt. In diesem Protokoll beschreiben wir fliegen Thorax Muskeln für halb dünn schneiden einbetten, das einen guten Kontrast zwischen Muskel und das umgebende Gewebe zu erhalten und das optische Mikroskopbilder für halbautomatische Erfassung von quantifizierbaren Daten verarbeiten und Analyse. Wir beschreiben drei spezifische Anwendungen der methodischen Pipeline. Zunächst zeigen wir, wie die Methode angewendet werden kann, um Muskeldegeneration in einem myotonische Dystrophie Fly Modell zu quantifizieren; Zweitens helfen Messung der Muskel Querschnittsfläche, um Gene zu identifizieren, die entweder zu fördern oder zu, Muskelatrophie und/oder Muskeldegeneration verhindern; Drittens kann dieses Protokoll angewendet werden, um festzustellen, ob eine Kandidatenverbindung in der Lage, einen bestimmten atrophischen Phänotyp, induziert durch eine ursächliche Mutation wesentlich zu ändern istoder durch ein Umwelt-Trigger.

Introduction

Der Thorax der Fruchtfliege enthält zwei verschiedene Klassen von Flugmuskeln, die funktionell, physiologisch und anatomisch unterscheiden. Diese Muskeln sind: die indirekten Flugmuskeln (IFM), die von dorsal längs (DLM) und dorsal-Ventral (DVM) Muskeln (Abbildung 1) und die synchrone Flug bestehen Steuern Muskeln^1,2. Diese Muskeln erzeugen zusammen die erhöhte mechanische Leistung für Flug benötigt. Die Größe, Verteilung und Rostro-kaudalen Disposition der die Schnittstellenmodule ermöglichen eine einfache Orientierung für transversale Stationspunkte³ (Abbildung 2A). Aus diesem Grund haben wir diese Muskeln, Muskelatrophie in Drosophila Melanogasterstudieren ausgewählt.

Abbildung 1: Diagramm des Thorax der Fruchtfliege zeigen die indirekten Flugmuskeln (Schnittstellenmodule) Anordnung. (Links) stellt eine seitliche Ansicht und (rechts) repräsentiert einen Querschnitt des Thorax. Die Schnittstellenmodule bestehen der dorsal längs (DLM) Muskeln (in rot) und dorsal-Ventral (DVM) Muskeln (in grün).

Erhaltung der Gewebestruktur und die Kontrolle über dorsal-Ventral Achsenausrichtung der histologischen Abschnitte sind entscheidend für die richtige Beurteilung der Muskel Querschnittsfläche gewährleisten zu können. Muskelstruktur erhalten wir eine Fixierung Mischung geändert von Tomlinson Et Al. verwendet ⁴ . Weil Muskeln inneren Geweben, ist die Dichtheit der DrosophilaExoskelett übrigens ein Problem als Fixierung, die Mischungen auf das Zielgewebe nicht durchdringen können. Um dieses Problem zu umgehen, entfernen wir fliegen Kopf, Beine, Flügel und die letzten beiden Segmente des Abdomens Bohrungen erstellen, die die Fixierung Mischung geben darf. Im Rahmen des Protokolls Fixierung wir Behandlung mit Osmium ausgefällt (OsO₄)⁵, die ausgiebig wegen seiner Fähigkeit verwendet wird enthalten, um Fette zu beheben, einschließlich der Triglyceride. OsO₄ bewahrt die meisten Strukturen sehr gut, vor allem auf die zytologische Ebene und zur gleichen Zeit bietet einen Kontrast zu dem Bild. Nach der Fixierung waren Drosophila Thoraces im Harz für transversale semi-dünne Stationspunkte (1,5 µm) eingebettet. Für verbesserten Kontrast kann Gewebe zusätzlich mit Toluidin blau gefärbt werden. Bilder der kompletten Thoraces wurden bei 10 X und Muskelgebiet wurde durch binarizing Bilder (mit gleichen Abmessungen) und Quantifizierung der Prozentsatz der Pixel, die Muskelgewebe (schwarze Pixel) von insgesamt, mit ImageJ Software quantifiziert.

Veränderungen auf die Gewebe Vorbereitung und Fixierung Mischungen, wie der Anstieg der Konzentration von OsO₄ und Glutaraldehyd-Lösung eingeführt, die in diesem Protokoll erlaubt einzigartige Erhaltung von Muskelgewebe. Und zwar deshalb, weil das Protokoll der Abbau und die Verformung des Gewebes, machen die hintere Analyse der Proben selbst in stark atrophischen Bedingungen im Zusammenhang mit neuromuskulären degenerativen Erkrankungen wie z. B. myotonische Dystrophie (DM) zuverlässiger vermeidet. In seiner häufigsten Form, DM Typ 1, ist diese seltene genetische Erkrankung durch erweiterte CUG Wiederholungen im myotonische Dystrophie Proteinkinase (DMPK) Abschriften herbeigeführt. Mutierte DMPK RNA Aggregate Form Ribonuclear Herde, die absondern Muscleblind-wie nukleare RNA-bindende Proteine (MBNL1-3; Muscleblind (Mbl) in Drosophila)⁶. Wir generiert eine Drosophila -Modell myotonische Dystrophie 250 CTG Wiederholungen unter den muskulösen Myosin schwere Kette Projektträger (Mhc-Gal4) zum Ausdruck zu bringen. Modell fliegen waren flugunfähige mit einem typischen "Up statt Flügel" Phänotyp und schweren Muskel Atrophie in ihre Schnittstellenmodule (Abb. 2 b). Frühere Studien, die in unserem Labor durchgeführt haben gezeigt, dass die Bestimmung des Gebiets Muskel Schnittstellenmodule ist eine zuverlässige Methode zur Quantifizierung der Auswirkungen von verschiedenen chemischen oder genetische Modifikatoren der Muskelatrophie in diese Modell fliegen⁷. Als Beispiel erreicht Überexpression des Mbl-Isoform C fliegen mit dem Ausdruck der 250 CTG im Muskel, Wiederholungen eine Rettung Muskelgebiet, Mbl Erschöpfung durch Sequestrierung ist der auslösende Faktor in DM1 Pathogenese⁸ (Abbildung 2). Muskelgebiet wurde auch gerettet, nach Fütterung der DM-Modell mit Abp1, ein Hexapeptid mit bewährten Anti-DM1 Aktivität⁹ (Abb. 2D) fliegt.

Abbildung 2: Quantifizierung der dorsoventral Abschnitte des Erwachsenen Thoraces Harz eingebettet. (A-D) indirekten Flugmuskeln von Drosophila Melanogaster mit der angegebenen relevanten Genotypen. (A) Kontrolle fliegt (Yw). (B) Ausdruck von 250 nicht-kodierenden CTG wiederholt in der Muskulatur (UAS-CTG(250)x) verursacht eine Verringerung der Muskelgebiet im DLMs im Vergleich zur Kontrolle fliegen. (C) diese Muskel-Atrophie-Phänotyp wurde gerettet durch Überexpression des Muscleblind (MblC) (FH-CTG (250) x UAS-MblC) und (D) Fütterung die Modell-fliegen mit dem Hexapeptid Abp1 (FH-CTG (250) x Abp1). In allen Bildern ist die dorsale Seite oben. Transgene Muscle Myosin Heavy Chain Förderer (Mhc) mit vertrieben wurden-Gal4. (E) Quantifizierung der Prozentsatz der Muskelgebiet bezogen auf die Kontrolle fliegen bestätigt, dass die Unterschiede signifikant waren. Das Histogramm zeigt Mittel ± S.E.M **p< 0,01 und * p < 0,05 (Student t-Test). Maßstabsleiste: 200 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Die Methode, die hier berichtet wird von Interesse für Forscher mit Schwerpunkt auf Muskel-Entwicklung, Wartung und Altern, Krankheit Pathologie und Drogentests wie es zuverlässige Informationen liefert über wie Muskelgewebe auf endogene und externe Faktoren reagiert.

Protocol

(1) Fixierung und Harz einbetten

1. Die fliegen mit Kohlendioxid (CO₂) oder via Hypothermie mit einem Eisblock zu betäuben. Verwenden Sie einen sezierenden Mikroskop (mit geringer Vergrößerung zu sehen, die ganze Fliege) und Schere um zu entfernen, die Beine, Flügel, Kopf und terminal Teil des Abdomens, das Eindringen der Fixativ zu erleichtern. Schonung der Kadaver ist erforderlich bei diesem Schritt um die Verformung des Brustkorbs zu vermeiden.
   Hinweis: Starten Sie mit mindestens 12 fliegen pro Genotyp um eine ausreichende Anzahl von richtig verarbeitete Individuen am Ende des Verfahrens.
2. Übertragen Sie die Kadaver auf eine 1,5 mL-Tube auf Eis (Platzieren von maximal 6 Personen pro Röhre) mit 200 µL Lösung 1.
   Hinweis: Die Kadaver nicht in Lösung 1 für mehr als 20 min bleiben.
   1. Mix für Lösung 1, Komponenten in diesen Volumen Proportionen: ¼ 4 % Paraformaldehyd, ¼ 8 % Glutaraldehyd, ¼ 0,2 M Na₂HPO₄ und ¼ 0,2 M NaH₂PO₄.
3. Fügen Sie 200 µL Lösung 2 und inkubieren Sie für 30 min auf Eis.
   1. Lösung 2: Mix Lösung 1 und OsO₄ im Verhältnis 1:1 (V/V).
      Achtung: OsO₄ ist extrem giftig. In einer Abzugshaube mit geeigneten Maßnahmen für Sicherheit und Entsorgung zu manipulieren.
4. Die Flüssigkeit zu entfernen. Fügen Sie 200 µL Lösung 2 und inkubieren Sie für 1-2 h auf Eis.
5. Entfernen Sie die Lösung und entwässern die Proben durch eine abgestufte Ethanol-Reihe wie folgt: einmal in 30 %, 50 %, 70 %, 90 %, und zweimal in absoluten Ethanol; 5 min. Fügen Sie 1 mL Ethanol um die Proben zu decken.
   Hinweis: Wenn das Gewebe in 90 % Ethanol platziert ist, können die nachfolgenden Schritte bei Raumtemperatur durchgeführt werden.
6. Inkubieren Sie den Proben zweimal in Propylenoxid für 10 min jeden Inkubation.
   Achtung: Propylenoxid ist giftig, in einer Dampfhaube verwenden.
7. Ersetzen Sie die Propylenoxid durch ein 1:1 (V/V) Mischung aus Epoxy-Harz und Propylen Oxid und über Nacht bei Raumtemperatur inkubieren.
   Achtung: Das Harz ist im flüssigen Zustand extrem giftig. Das Harz ist als ein Satz von vier Komponenten (A, B, C und D) zur Verfügung.
   1. Fügen Sie für Epoxidharz in eine Einweg-Becher 54 g Harz (A), 44,5 g härter (B), 2,5 g des Beschleunigers (C) und 10 g Weichmacher (D). Kombinieren Sie die Harz-Komponenten unter einem Abzug. Speichern Sie das Harz in Aliquote bei-20 ° C (für bis zu 6 Monate) oder bei-80 ° C (für mehrere Jahre).
   2. Um das Harz zu verwerfen, Backen Sie bei 70 ° C für 24 h weil Festharz nicht toxisch ist. Alle bisherigen Lösungen in der Gruppe der Schwermetalle nach geeigneten internationalen Verfahren, zu verwerfen, da Lösungen können Spuren von OsO enthalten_4.
8. Ersetzen Sie die bisherigen Mischung mit 100 % Harz und inkubieren Sie die Proben für 4 h.
9. Übertragen Sie die Kadaver auf Kunststoffformen, enthält neue Harz (ein Kadaver in jede Vertiefung der Form). Verwenden Sie einen angespitzten Holzstab oder Nadel zu übertragen und die Kadaver in den Brunnen zu orientieren und das Harz über Nacht im Backofen bei 70 ° c Pasteur polymerisieren zu verlassen
   Hinweis: Um entsprechende Orientierung der Schlachtkörper für hintere trimmen und schneiden zu gewährleisten, sollten die Kadaver an ihrer Längsseite mit dem vorderen Teil des Korpus sehr nahe an den Rand des Brunnens liegen.

2. Trimmen und Schneiden von Blöcken

1. Entfernen Sie die polymerisierten Harz-Blöcke aus den Formen. Verwenden Sie Rasierklingen schneiden Sie das Harz, eine trapezförmige form rund um die Karkasse und geben entsprechende Orientierung im Mikrotom. Starten Sie schneiden die Kadaver nach der transversalen Naht um vergleichbare Ergebnisse zu erhalten.
   Hinweis: Der Schnitt muss senkrecht zur Achse des DLMs Probe richtig trimmen Anteroposterior sein ( Abbildung 3).

Abbildung 3 . Dorsoventral Abschnitte des Erwachsenen Thoraces Harz eingebettet, myotonische Dystrophie Modell fliegen. (A) war das Trimmen der Probe nicht richtig, da war der Teil im dorsalen rechten Teil des Bildes nicht vollständig transversalen zu den Muskeln. Folglich scheinen die drei Muskelbündel auf der oberen rechten Seite größer als die der linken Seite. Dieser Fehler führt zu einer Überschätzung des Bereichs Muskel. (B) Abschnitt aus einem Block korrekt getrimmte Harz. Maßstabsleiste: 200 µm.

1. Schnitt 1,5 µm dicke Schichten mit einer regungsloses und übertragen Sie die Abschnitte in Wassertropfen über verkleisterte Folien.
   1. Erhalten Sie die Abschnitte aus dem Mesothorax Segment für alle Proben um vergleichbare Ergebnisse zu erhalten.
2. Legen Sie die Folien mit den Abschnitten auf einem Heizblock bei 70-80 ° C bis H₂O verdampft. An dieser Stelle können die Proben mit dem OsO₄ Kontrast (Abb. 4A) beobachtet werden.

3. Färbung IFM Abschnitte

1. Sollte in den Kapiteln mit genügend Toluidin blau für ca. 30 s auf dem Heizblock.
   1. Toluidin blauer Lösung lösen Sie auf, 1 % der Toluidin blau und 1 % Borax in H₂O.
2. Spülen mit H₂O und lassen Sie die Folien auf einem warmen Teller um das Wasser zu verdampfen. Wiederholen Sie die Färbung mit Toluidin blau wenn der Kontrast sein muss (Abbildung 4 b) erweitert.

Abbildung 4 . Dorsoventral Abschnitte der Harz eingebettet adult Thoraces mit verschiedenen Kontrast Keramikschalen. Beide Platten zeigen Bilder der DM1 Modell fliegen mit Abp1 wie in Abb. 2Dgefüttert. (A) Bild eines Abschnitts mit dem OsO₄ Kontrast. (B) Abschnitt gebeizt mit Toluidin Blau ermöglicht bessere Visualisierung der Muskelbündel. Maßstabsleiste: 200 µm.

4. Montage IFM Abschnitte

1. Trocknen Sie die Folien mit den Heizblock bis H₂O verdampft.
2. 1 oder 2 Tropfen Eindeckmittel auf den Abschnitten und einem Deckgläschen auflegen.
   Achtung: Führen Sie diesen Schritt in einer Dampfhaube weil das Eindeckmittel giftig ist.

5. Erwerb von Bildern und Quantifizierung der Muskelgebiet

1. Nehmen Sie die Bilder bei kleiner Vergrößerung, so dass das ganze Set der DLM Muskeln im Fokus ist. Wir verwenden normalerweise 10 X.
   1. Für die statistische Analyse mindestens 5 serielle Bilder pro Fliege nehmen und mindestens 5 fliegen pro Versuchsgruppe zu analysieren.
2. Wählen Sie das Bild mit der gesamten Muskulatur (Abb. 5A). Überprüfen Sie die Achse oder die Ausrichtung des Abschnitts und entsorgen Sie die Proben mit unangemessenen Orientierung, die die Ergebnisse verfälschen würde (Vergleiche Abbildungen 3A / 3 b zu stark unterscheiden und gut orientierte Abschnitte bzw.).
3. Verwenden Sie ImageJ-Software, um einen Bereich (in Pixel), enthält nur die DLMs (Abbildung 5A/5B) auswählen. Für den Vergleich zwischen verschiedenen Versuchsgruppen wäre der Referenzbereich zu verwendenden immer die Fliege mit den größten Muskeln. In den Bildern der verschiedenen Genotypen zu vergleichen, wählen einen Bereich mit DLMs gleichen Abmessungen zu den Referenzbereich (Abb. 5 b).
4. Vollständig die Bilder mit dem Befehl Bild-J: Prozess/Binary/Make binäre und löschen Sie die Bereiche oder Pixel, die nicht zu den Muskeln des Interesses (Abbildung 5) entsprechen.
   1. Löschen Sie in dem Fall, den artifizielle schwarze Flecken in anderen Bereichen als Muskel angezeigt werden sie mit dem Befehl Zeichenwerkzeuge und wählen Sie das Radiergummi-Symbol.

Abbildung 5 . Analyseverfahren für Muskel Bereich Bestimmung Bild. (A) transversaler Abschnitt myotonische Dystrophie Typ 1 Modell fliegen Thorax mit ein Rechteck mit der DLM. (B) ausgewählte Bereich mit nur die indirekten Flugmuskeln und den Darm (*). (C) Binarized Bild. Die schwarzen Bereiche entsprechen den Muskeln von Interesse. Der Darm ist für eine genaue Quantifizierung der Muskelgebiet gelöscht. Maßstabsleiste: 200 µm.

5. Prozentsatz der Pixel, die Muskelgewebe (schwarze Pixel) von insgesamt mit dem Befehl zu quantifizieren: Analyse/Messung und wählen Sie die Option Bereich Bruchteil. Dieser Prozentsatz des Bereichs ist eine Abschätzung der DLM Muskelmasse jede Fliege.

Representative Results

Um zu bestimmen ob die Überexpression von MblC oder die Verwaltung von Abp1 keine Wirkung in der atrophischen Phänotyp des Modells myotonische Dystrophie fliegen hatte konzentrierten wir uns auf die DLMs, die Schnittstellenmodule (Abbildung 1) gehören. Wir festgestellt, dass das Modell fliegt die express 250 nicht-kodierenden CTG Wiederholungen in der Muskulatur, angetrieben durch den Projektträger Myosin Heavy Chain (Mhc),-Gal4, hatte eine Ermäßigung von 50 % der Muskelgebiet verglichen, um fliegen zu kontrollieren. Im Gegensatz dazu Co Ausdruck MblC und erweiterte CTG wiederholt mit dem gleichen Fahrer stark unterdrückt diese Phänotyp und Crossectional Muskelgebiet war 70 % der Kontrolle (normalen) fliegen. Verwaltung von Abp1 Hexapeptid in den nahrhaften Medien unterdrückt ebenso die atrophische Phänotyp und Modell fliegen, die hätte die Verbindung zeigte etwa 60 % der normalen Muskelgebiet (statt 50 % das ist typisch für DM1 fliegen; Abb. 2E). Für die Quantifizierung dieser Proben benutzten wir Abschnitte gebeizt mit Toluidin blau Kontrast (Abbildungen 4 und 5) zu erhöhen.

Wir stellen fest, dass während des Verfahrens eine Reihe von technischen Pannen der letzten Quantifizierung erheblich stören kann. Eine gemeinsame ist, dass Harz Blöcke nicht richtig getrimmt sind, die misorient der Probenmaterials und zum schrägen Schnitt von der DLMs führen kann. Infolgedessen können einige DLM Muskeln auf der einen Seite im Vergleich zur kontralateralen größer aussehen (siehe z.B. Abbildung 3), das stellt eines erheblichen Fehlers in der endgültigen Quantifizierung. Ein weiterer Fehler, der auftreten können ist unzureichend Durchdringung von das Fixiermittel im Muskelgewebe (Abbildung 6), das degradierten und verformt, so dass die genaue Quantifizierung der Muskelgebiet unmöglich aussieht.

Discussion

Es hat sich gezeigt, dass Drosophila Melanogaster eine nützliche Modell zur menschlichen neuromuskulären Erkrankungen^7,10,11, einschließlich myotonische Dystrophien, charakterisiert durch das Auftreten von Muskelatrophie. Das Protokoll hier vorgestellten ist ein nützliches Instrument zur Quantifizierung der Muskeldegeneration durch das auftreten oder Fortschreiten einer bestimmten Krankheit in einem Fly Modell verursacht. Beispielsweise ist es auch möglich, zu folgen und die Degeneration der Muskelfasern durch die Durchführung dieser Analyse in fliegen unterschiedlichen Alters zu quantifizieren.

Es gibt wichtige Schritte im Protokoll. Der Zeitaufwand für die fliegen vor ihrer Fixierung zu sezieren muss minimiert werden, um den Abbau des Gewebes zu vermeiden. Für die Penetration der Fixativ Lösung in den Muskeln (Abbildung 6) ist es wichtig, den Kopf, Flügeln und Beinen der Zugang der Lösungen, um das Innere der Fliege fliegen zu entfernen. Es ist für transversale Sektionen zu erhalten, in denen die Muskeln von Interesse völlig sichtbar sind. Die Binarisierung der Proben für die Quantifizierung ist wichtig, so beachten Sie, dass die ausgewählten Pixel (schwarze Pixel) das Gewebe des Interesses und der gesamte Bereich des Interesses entspricht ausgewählt ist.

Abbildung 6. Erwachsenen Drosophila Thorax mit unzureichender Durchdringung der das Fixiermittel in den Muskeln (*), das Zerstörung und Verformung des Gewebes während der Verarbeitung der Probe verursacht. Maßstabsleiste: 200 µm.

In diesem Protokoll verwendeten Reagenzien gehört OsO₄, die meisten Strukturen sehr gut, vor allem auf die zytologische Ebene bewahrt und gleichzeitig bietet Kontrast zu Bild⁵. Ein großer Nachteil der Methode ist jedoch die Toxizität der OsO₄, die müssen immer in einer Dampfhaube verwendet werden und erfordert eine sichere Handhabung und Entsorgung. Dieses Protokoll ermöglicht nicht nur genaue Quantifizierung von Muskelgewebe wegen der Befestigung und Verankerung Verfahren, es kann auch für eine andere Anwendung wie z. B. Elektronenmikroskopie (EM) Vorbereitung verwendet werden. Allerdings leidet es eine intrinsische Einschränkung, da die daraus resultierende histologischen Abschnitte in nachfolgenden Tests, wie z. B. Immunohistochemistry verwendet werden können.

Schließlich, diese Methode ist auch optimiert für kleine Muskel Bereich Unterschiede damit die zuverlässige Identifizierung von Modifikatoren in genetischen oder chemische Bildschirme^8,9. Dennoch da erhöhte Muskelmasse Bereich nicht unbedingt bessere Muskelfunktion bedeutet, sollte Cross-sectional Muskel Bereich Entschlossenheit im Idealfall mit funktionellen Assays korreliert werden wie Flug¹²Proben.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Image-J software	National Institutes of Health		https://imagej.nih.gov/ij/
Ultramicrotome	Leica	Leica UC6
Microscope	Leica	Leica MZ6	Bright field technique.
Razor blades	Electron Microscopy Sciences	71970	Several alternative providers exist.
Scissors	World Precision World	14003	Several alternative providers exist.
Embedding molds	Electron Microscopy Sciences	70900	Several alternative providers exist.
Glutaraldehyde	Fluka (Sigma)	49624	Toxic.
OsO4	Polyscience	0972A	Extremely toxic.
Propylene oxide	Sigma Aldrich	82320-250ML	Extremely toxic.
resin (Durcupan)	Sigma Aldrich	44611-44614	Carcinogenic when it is unpolymerized.
Toluidine blue	Panreac	251176	Toxic.
Mountant Medium (DPX)	Sigma Aldrich	44581	Dangerous.
Paraformaldehyde	Sigma Aldrich	P6148-500G	Harmful.
Na2HPO4	Panreac	122507	0.2 M dilution.
NaH2PO4	Panreac	121677	0.2 M dilution.
Borax	Panreac	3052	Toxic.