Summary
Se presenta un método para cuantificar el área del músculo, que es un método indirecto para determinar la masa muscular en adultos del Drosophila . Demostramos la aplicación de nuestra metodología, analizando el vuelo indirecto los músculos en un modelo de Drosophila de la enfermedad de la distrofia miotónica.
Abstract
Masa muscular atrofia, atrofia muscular, es un fenotipo común en modelos de Drosophila de enfermedades neuromusculares. Hemos utilizado los músculos de vuelo indirectos (IFMs) de las moscas, específicamente los músculos dorso-longitudinales (DLM), como el experimental sujeto a medida el fenotipo atrófico provocado por diferentes causas genéticas. En este protocolo, se describe cómo incrustar los músculos tórax mosca para seccionar fino semi, cómo obtener un buen contraste entre el músculo y el tejido circundante y cómo procesar imágenes de microscopio óptico para semiautomática adquisición de datos cuantificables y Análisis. Se describen tres aplicaciones específicas de la tubería metodológica. En primer lugar, mostramos cómo se puede aplicar el método para cuantificar la degeneración del músculo en un modelo de mosca de la distrofia miotónica; en segundo lugar, la medición del área transversal del músculo puede ayudar a identificar genes que promoverán o evitar la atrofia muscular o degeneración muscular; en tercer lugar, este protocolo puede ser aplicado para determinar si un compuesto candidato es capaz de modificar de manera significativa un determinado fenotipo atrófico inducido por una mutación enfermedad-que causano por un disparador ambiental.
Introduction
El tórax de la mosca de la fruta contiene dos clases diferentes de los músculos de vuelo, que son funcionalmente, fisiológicamente y anatómicamente distintas. Estos músculos son: controlan de los músculos de vuelo indirectos (IFM), que se componen de dorso-longitudinales (DLM) y los músculos dorso-ventral (DVM) (figura 1) y el vuelo síncrono músculos1,2. Juntos, estos músculos generan la elevada potencia mecánica requerida para el vuelo. El tamaño, distribución y disposición rostro caudal de las IFMs permiten una fácil orientación para seccionamiento transversal3 (figura 2A). Por esta razón, hemos seleccionado estos músculos para el estudio de la atrofia muscular en Drosophila melanogaster.
Figura 1. Diagrama del tórax de la mosca de la fruta que muestra los músculos de vuelo indirectos (IFMs) arreglo. (Izquierda) representa una visión lateral y (derecha) representa un corte transversal del tórax. El IFMs se componen de los músculos Dorso-longitudinales (DLM) (en rojo) y Dorso-ventral (DVM) de los músculos (en verde).
Preservación de la estructura del tejido y el control sobre la orientación del eje dorso-ventral de las secciones histológicas son críticos para garantizar la correcta evaluación de área transversal del músculo. Para preservar la estructura muscular se utilizó una mezcla de fijación modificada de Tomlinson et al. 4 . Por otra parte, porque los músculos son los tejidos internos, la impermeabilidad del exoesqueleto de Drosophilaes un problema como fijación mezclas no pueden penetrar a los tejidos de destino. Para evitar este problema, hemos eliminado la cabeza volar, patas, alas y los dos últimos segmentos del abdomen para crear agujeros que permiten la mezcla de fijación entrar. Como parte del Protocolo de fijación que se incluyeron tratamiento con tetróxido de osmio (OsO4)5, que utiliza extensivamente debido a su capacidad para fijar las grasas, incluyendo triglicéridos. OsO4 conserva la mayoría de las estructuras muy bien, especialmente a nivel citológico y al mismo tiempo proporciona contraste a la imagen. Después de la fijación, Drosophila toracico fueron embebida en resina para transversal semi-delgadas seccionamiento (1,5 μm). Para mejor contraste, tejido puede ser además teñido con toluidina azul. Imágenes de toracico completo se tomaron 10 X y área del músculo se cuantificó por binarizing imágenes (de dimensiones iguales) y cuantificar el porcentaje de píxeles correspondiente a tejido muscular (pixeles negros) de total, con el software ImageJ.
Modificaciones en las mezclas de preparación y fijación de tejidos, como el aumento de la concentración de OsO4 glutaraldehído solución, en este protocolo, permitieron la única preservación del tejido muscular. Esto es porque el protocolo evita la degradación y deformación del tejido, haciendo el análisis posterior de las muestras más confiable incluso en condiciones altamente atróficas asociadas a enfermedades degenerativas NEUROMUSCULARES como la distrofia miotónica (DM). En su forma más común, DM tipo 1, este trastorno genético poco común es provocada por repeticiones CUG ampliadas en las transcripciones de la proteína quinasa de distrofia miotónica (DMPK). Agregados de ARN mutante de DMPK focos de ribonuclear de forma que secuestran las proteínas de unión a RNA nucleares Muscleblind-como (MBNL1-3; Muscleblind (Mbl) en Drosophila)6. Hemos generado un modelo de Drosophila de la distrofia Myotonic expresando 250 repeticiones CTG en el promotor de la cadena pesada de miosina muscular (Mhc-Gal4). Moscas modelo eran incapaces de volar con un fenotipo típico 'celebró hasta las alas' y tenían graves musculares atrofia en sus IFMs (figura 2B). Estudios previos realizados en nuestro laboratorio han demostrado que la determinación de la zona muscular de IFMs es un método fiable para cuantificar los efectos de diferentes modificadores químicos o genéticos de la atrofia muscular en estas moscas modelo del7. Por ejemplo, la sobreexpresión de la isoforma de la Mbl C en moscas expresando la CTG 250 repeticiones en el músculo, consigue un rescate del área del músculo, como agotamiento de Mbl por secuestro es el factor desencadenante en la patogenesia de DM18 (figura 2). Área del músculo también fue rescatado después de alimentar el modelo DM vuela con Abp1, un hexapéptido con anti-DM1 probada actividad9 (Figura 2D).
Figura 2. Cuantificación de secciones dorsoventral de toracico adulto embebido en resina. Los músculos de vuelo indirectos (A-d) de Drosophila melanogaster con los genotipos correspondientes indicados. (A) control de moscas (PA). (B) expresión de 250 CTG no codificante se repite en el músculo (UAS-CTG(250)x) provocó una reducción del área del músculo en el DLMs en comparación con el control de moscas. (C) este fenotipo de atrofia muscular fue rescatado por la sobreexpresión de Muscleblind (MblC) (UAS-CTG (250) x UAS MblC) y (D) alimentación las moscas modelo con hexapéptido Abp1 (UAS-CTG (250) x Abp1). En todas las imágenes el lado dorsal es en la parte superior. Los transgenes fueron conducidos a los músculos mediante un promotor de la cadena pesada de miosina (Mhc)-Gal4. E cuantificación del porcentaje de área muscular en relación con las moscas de control confirma que las diferencias fueron significativas. El histograma muestra los medios ± SEM **p< 0.01 y * p < 0.05 (prueba de t de Student´s). Barra de escala: 200 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
El método aquí registrado serán de interés a los investigadores centrarse en desarrollo muscular, mantenimiento y envejecimiento, patología de la enfermedad y las pruebas de drogas ya que proporciona información confiable sobre cómo el tejido muscular responde a factores endógenos y externos.
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Protocol
1. fijación y embebido de resina
- Anestesiar las moscas con dióxido de carbono (CO2) o a través de hipotermia usando un bloque de hielo. Utilice un microscopio de disección (con ampliación baja para ver la marcha entera) y las tijeras para quitar las patas, alas, cabeza y la parte terminal del abdomen para facilitar la penetración del fijador. El tratamiento cuidadoso de los cadáveres es necesario en este paso para evitar la deformación del tórax.
Nota: Comience con al menos 12 moscas por genotipo para asegurar un número suficiente de individuos correctamente procesados al final del procedimiento. - Traslado de los cadáveres a un tubo de 1,5 mL en hielo (colocación de un máximo de 6 personas por tubo) que contiene 200 μL de solución 1.
Nota: Las canales no pueden permanecer en la solución 1 durante más de 20 minutos.- Solución 1, mezclar los componentes en las proporciones de volumen: ¼ paraformaldehído al 4%, glutaraldehído 8% ¼, ¼ 0,2 M de Na2HPO4 y ¼ 0,2 M NaH2PO4.
- Añadir 200 μL de solución 2 e incubar en hielo durante 30 minutos.
- Solución 2: Solución de mezcla 1 y OsO4 en una proporción de 1:1 (v/v).
PRECAUCIÓN: OsO4 es extremadamente tóxico. Manipular en una campana de humos con medidas adecuadas de seguridad y disposición.
- Solución 2: Solución de mezcla 1 y OsO4 en una proporción de 1:1 (v/v).
- Eliminar todo el líquido. Añadir 200 μL de solución 2 e incubar en hielo durante 1-2 h.
- Retirar la solución y deshidratan las muestras a través de una serie gradual de etanol como sigue: una vez en 30%, 50%, 70%, 90% y dos veces en etanol absoluto; 5 minutos cada uno. Añadir 1 mL de etanol para cubrir las muestras.
Nota: Una vez que el tejido se coloca en etanol al 90%, los pasos posteriores pueden realizarse a temperatura ambiente. - Incubar las muestras dos veces en óxido de propileno por 10 min cada incubación.
PRECAUCIÓN: El óxido de propileno es tóxico, utilizarlo en una campana de humos. - Sustituir el óxido de propileno por una mezcla de 1:1 (v/v) de epoxy resina y propileno óxido e incubar a temperatura ambiente durante la noche.
PRECAUCIÓN: La resina es extremadamente tóxica en estado líquido. La resina está disponible como un conjunto de cuatro componentes (A, B, C y D).- Para la resina de epoxy, agregue en un vaso desechable de 54 g de resina (A), 44,5 g de catalizador (B), 2,5 g de acelerador (C) y 10 g de plastificante (D). Combinar todos los componentes de la resina en una campana de humos. Almacenar la resina en alícuotas a-20 ° C (hasta 6 meses) o a-80 ° C (varios años).
- Para descartar la resina, la Hornee a 70 ° C por 24 h porque resina sólida no es tóxica. Deseche todas las soluciones anteriores en el grupo de los metales pesados según los procedimientos internacionales apropiados, porque las soluciones pueden contener rastros de OsO4.
- Vuelva a colocar la mezcla anterior con resina 100% e incubar las muestras durante 4 horas.
- Traslado de los cadáveres para moldes de plástico conteniendo resina nuevo (un canal en cada pozo del molde). Utilizar un palo de madera afilado o una aguja de transferencia y orientar los cadáveres en los pozos y dejar la resina para polimerizar durante la noche en un horno de Pasteur a 70 ° C.
Nota: Para asegurar la orientación apropiada de los cadáveres para el posterior corte y seccionamiento, los cadáveres deben estar acostado sobre su lado largo, con la parte anterior de la canal muy cerca del borde del pozo.
2. corte y seccionamiento de bloques
- Retire los bloques de resina polimerizada de los moldes. Utilice hojas de afeitar recorte la resina, una forma trapezoidal que rodean el cadáver y dar orientación apropiada en el micrótomo. Inicio secciones todos los cadáveres después de la sutura transversal para obtener resultados comparables.
Nota: La sección debe ser perpendicular al eje anteroposterior de las DLMs para cortar correctamente la muestra ( figura 3).
Figura 3 . Secciones dorsoventral de toracico adulto embebido en resina de la distrofia Myotonic modelo moscas. En (A), el ajuste de la muestra no era correcto que la sección en la parte dorsal derecha de la imagen no era totalmente transversal a los músculos. Como consecuencia, los paquetes de tres del músculo en la parte superior derecha parecen más grandes que los de la izquierda. Este error daría lugar a una sobreestimación de la zona muscular. (B) sección de un bloque de resina correctamente ajustado. Barra de escala: 200 μm.
- Corte 1.5 μm secciones gruesas con un ultramicrótomo y transferir las secciones en gotas de agua sobre diapositivas gelatinizados.
- Obtener las secciones del segmento mesothorax para todas las muestras obtener resultados comparables.
- Coloque las diapositivas que contienen las secciones de un bloque de calentamiento a 70-80 ° C hasta que se evapore el H2O. En este punto, se observan las muestras con el OsO4 contraste (Figura 4A).
3. tinción de secciones IFM
- Cubrir las secciones con suficiente toluidina azul de aproximadamente 30 s en el bloque de calefacción.
- Solución de azul de toluidina, disolver el 1% de azul de toluidina y el 1% de borax en H2O.
- Enjuague con H2O y deja el portaobjetos sobre una placa caliente para evaporar el agua. Repetir la tinción con toluidina azul si el contraste debe ser mejorada (Figura 4B).
Figura 4 . Secciones dorsoventral de toracico adulto embebido en resina con diferente contraste los stainings. Ambos paneles muestran imágenes de DM1 modelo moscas alimentados con Abp1 como en la Figura 2D. (A) imagen de una sección del OsO4 contraste. (B) corte teñido con toluidina azul permite mejor visualización de los haces musculares. Barra de escala: 200 μm.
4. montaje de secciones IFM
- Seque el portaobjetos con el bloque calefactor hasta que se evapore el H2O.
- Poner 1 o 2 gotas de medio de montaje en las secciones y poner en un cubreobjetos.
PRECAUCIÓN: Realizar este paso en una campana de humos porque el medio de montaje es tóxico.
5. adquisición de imágenes y la cuantificación del área del músculo del
- Tomar las imágenes en baja magnificación para que todo el conjunto de músculos DLM está en foco. Normalmente usamos 10 X.
- Para el análisis estadístico de al menos 5 imágenes seriales por mosca y analizar por lo menos 5 moscas por grupo experimental.
- Seleccione la imagen que contiene los músculos enteros (figura 5A). Revise el eje o la orientación de la sección y deseche las muestras con orientación inadecuada, lo que distorsionaría los resultados (Comparar figuras 3A / 3B distinguir entre mal y bien orientada, respectivamente).
- Utilice el software ImageJ para seleccionar un área (en píxeles) que contiene sólo el DLMs (figura 5A/5B). Para la comparación entre los diferentes grupos experimentales, el área de referencia a utilizarse sería siempre la mosca con los músculos más grandes. En todas las imágenes de los diferentes genotipos para comparar, seleccione un área que contiene DLMs de iguales dimensiones a la zona de referencia (figura 5B).
- Binarize las imágenes con el comando Image-J: Proceso/binario/hace binario y eliminar las áreas o píxeles que no corresponden a los músculos de interés (figura 5).
- En el caso que artefactual puntos negros aparecen en áreas distintas de músculo, borrar con el comando herramientas de dibujo y seleccione el símbolo de la goma de borrar.
Figura 5 . Procedimiento de análisis para la determinación de área muscular de la imagen. (A) sección transversal del modelo de la distrofia miotónica tipo 1 volar el tórax con un rectángulo que contiene el DLM. (B) área seleccionada con sólo los músculos de vuelo indirectos y el intestino (*). (C) Binarized imagen. Las áreas negras corresponden a los músculos de interés. El intestino ha sido borrado para una cuantificación exacta del área del músculo. Barra de escala: 200 μm.
- Cuantificar el porcentaje de píxeles correspondiente a tejido muscular (pixeles negros) con el comando total: Análisis y medición y seleccione la opción fracción de área. Este porcentaje de la superficie es una estimación de la masa muscular de DLM de cada mosca.
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Representative Results
Cuantificar si la sobreexpresión de MblC o la administración de Abp1 tenía cualquier efecto en el fenotipo atrófico del modelo mosca distrofia miotónica que nos centramos en el DLMs, que forman parte de IFMs (figura 1). Se determinó que el modelo vuela, que expresan 250 repeticiones CTG no codificante en toda la musculatura por el promotor de la miosina de cadena pesada (Mhc)-Gal4, tuvieron una reducción del 50% del área del músculo en comparación con el control de moscas. En cambio, coexpresión de MblC y repeticiones CTG ampliadas con el mismo conductor, fuertemente reprimida tal fenotipo y área del músculo crossectional fue 70% de las moscas (normal) de control. Administración del hexapéptido Abp1 en los medios nutritivos igualmente suprime el fenotipo atrófica y las moscas modelo que habían tomado el compuesto demostrado aproximadamente el 60% del área del músculo normal (en lugar de 50% que es típico de las moscas de DM1; Figura 2E). Para la cuantificación de estas muestras, se utilizaron las secciones teñidas con toluidina azules para aumentar el contraste (figuras 4 y 5).
Observamos que durante el procedimiento de una serie de problemillas técnicos puede interferir significativamente con la cuantificación final. Común es que los bloques de resina no son correctamente ajustados, que puede misorient la muestra y llevar a corte oblicuo de las DLMs. Como consecuencia, algunos músculos DLM pueden lucir más grandes en un lado en comparación con la contralateral (ver por ejemplo figura 3), que introduce un error importante en la cuantificación final. Otro error que puede ocurrir es inadecuada penetración del fijador en el tejido muscular (figura 6), que se ve degradado y deformado haciendo imposible la cuantificación exacta de la zona muscular.
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Discussion
Se ha demostrado que la Drosophila melanogaster es un modelo útil para estudiar enfermedades neuromusculares humanas7,10,11, incluyendo distrofias miotónica, que se caracterizan por la aparición de atrofia muscular. El protocolo presentado aquí es una herramienta útil para la cuantificación de la degeneración muscular causada por la aparición o progresión de una enfermedad particular en un modelo de mosca. Por ejemplo, también es posible seguir y cuantificar la degeneración de las fibras musculares mediante la realización de este análisis en moscas de diferentes edades.
Hay pasos críticos en el protocolo. Debe reducirse al mínimo el tiempo necesario para diseccionar las moscas antes de su fijación para evitar la degradación del tejido. Para la penetración de la solución de fijación en los músculos (figura 6), es importante quitar de la cabeza, alas y patas de las moscas para garantizar el acceso de las soluciones al interior de la mosca. Es esencial para obtener secciones transversales en las que los músculos de interés son totalmente visibles. La binarización de las muestras para la cuantificación es esencial por lo que se selecciona la nota que los píxeles seleccionados (pixeles negros) corresponden a los tejidos de interés y toda la zona de interés.
Figura 6. Tórax adulto de Drosophila con inadecuada penetración del fijador en los músculos (*), que causa degradación y deformación del tejido durante el procesamiento de la muestra. Barra de escala: 200 μm.
Uno de los reactivos usados en este protocolo es OsO4, que conserva la mayoría de las estructuras extremadamente bien, particularmente a nivel citológico y al mismo tiempo proporciona contraste a la imagen5. Sin embargo, una desventaja importante del método es la toxicidad del OsO4, que debe usarse siempre en una campana de humos y requiere disposición y manipulación segura. Este protocolo no sólo permite la cuantificación exacta del tejido muscular debido a la fijación y embebido de procedimiento, también puede ser utilizado para otra aplicación como preparación de la microscopia electrónica (EM). Sin embargo, sufre una limitación intrínseca porque las secciones histológicas resultantes no pueden utilizarse en ensayos posteriores, como la inmunohistoquímica.
Finalmente, este método también está optimizado para detectar diferencias de área pequeño del músculo permitiendo la identificación confiable de modificadores en genética o química pantallas8,9. Sin embargo, puesto que el área del músculo aumento no implica necesariamente mejor función muscular, determinación de área de sección transversal muscular debe idealmente correlacionarse con ensayos funcionales tales como ensayos de vuelo12.
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Disclosures
No hay conflicto de interés declarado.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer a los miembros del grupo de genómica traslacional y Kathryn J Hanson para el feed-back y las mejoras de este protocolo. Este proyecto fue realizado con la beca de investigación SAF2015-64500-R, que incluye fondos europeos de Desarrollo Regional, otorgado a R.A por el Ministerio de Economia y Competitividad.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Image-J software | National Institutes of Health | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Ultramicrotome | Leica | Leica UC6 | |
| Microscope | Leica | Leica MZ6 | Bright field technique. |
| Razor blades | Electron Microscopy Sciences | 71970 | Several alternative providers exist. |
| Scissors | World Precision World | 14003 | Several alternative providers exist. |
| Embedding molds | Electron Microscopy Sciences | 70900 | Several alternative providers exist. |
| Glutaraldehyde | Fluka (Sigma) | 49624 | Toxic. |
| OsO4 | Polyscience | 0972A | Extremely toxic. |
| Propylene oxide | Sigma Aldrich | 82320-250ML | Extremely toxic. |
| resin (Durcupan) | Sigma Aldrich | 44611-44614 | Carcinogenic when it is unpolymerized. |
| Toluidine blue | Panreac | 251176 | Toxic. |
| Mountant Medium (DPX) | Sigma Aldrich | 44581 | Dangerous. |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148-500G | Harmful. |
| Na2HPO4 | Panreac | 122507 | 0.2 M dilution. |
| NaH2PO4 | Panreac | 121677 | 0.2 M dilution. |
| Borax | Panreac | 3052 | Toxic. |
References
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