Summary
हम एक विधि की रिपोर्ट करने के लिए मांसपेशियों क्षेत्र है, जो एक अप्रत्यक्ष विधि के लिए Drosophila वयस्कों में मांसपेशियों का निर्धारण है । हम Myotonic Dystrophy रोग के एक Drosophila मॉडल में अप्रत्यक्ष उड़ान मांसपेशियों का विश्लेषण करके हमारी कार्यप्रणाली के अनुप्रयोग का प्रदर्शन करते हैं ।
Abstract
स्नायु द्रव्यमान बर्बाद कर, मांसपेशी शोष के रूप में जाना जाता है, neuromuscular रोगों के Drosophila मॉडल में एक आम phenotype है । हम अप्रत्यक्ष उड़ान की मांसपेशियों (IFMs) मक्खियों का इस्तेमाल किया है, विशेष रूप से dorso-अनुदैर्ध्य मांसपेशियों (DLM), के रूप में प्रयोगात्मक एट्रोफिक phenotype को मापने के विषय के रूप में विभिंन आनुवंशिक कारणों से लाया । इस प्रोटोकॉल में, हम कैसे अर्द्ध पतली अनुभाग, मांसपेशियों और आसपास के ऊतकों के बीच एक अच्छा विपरीत प्राप्त करने के लिए उड़ना छाती मांसपेशियों को एंबेड करने के लिए का वर्णन है, और कैसे quantifiable डेटा के semiautomatic अधिग्रहण के लिए ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप छवियों को संसाधित करने के लिए और विश्लेषण. हम methodological पाइपलाइन के तीन विशिष्ट अनुप्रयोगों का वर्णन । सबसे पहले, हम बताते हैं कि कैसे विधि एक myotonic dystrophy मक्खी मॉडल में मांसपेशियों के अध-पतन के लिए लागू किया जा सकता; दूसरा, मांसपेशी पार अनुभागीय क्षेत्र के माप जीन की पहचान करने में मदद कर सकते है कि या तो को बढ़ावा देने या मांसपेशी शोष और/ तीसरे, इस प्रोटोकॉल निर्धारित करने के लिए कि एक उंमीदवार यौगिक काफी एक दिया एट्रोफिक एक रोग द्वारा प्रेरित phenotype-उत्परिवर्तन के कारण या एक पर्यावरण ट्रिगर द्वारा संशोधित करने में सक्षम है लागू किया जा सकता है ।
Introduction
फल मक्खी के छाती उड़ान मांसपेशियों, जो कार्यात्मक, शारीरिक और anatomically अलग कर रहे हैं की दो अलग वर्गों में शामिल हैं । इन मांसपेशियों रहे हैं: अप्रत्यक्ष उड़ान की मांसपेशियों (IFM), जो dorso-अनुदैर्ध्य (DLM) और dorso-ventral (DVM) की मांसपेशियों (चित्रा 1), और तुल्यकालिक उड़ान नियंत्रण मांसपेशियों1,2से बना रहे हैं । इन मांसपेशियों को एक साथ ऊंचा यांत्रिक उड़ान के लिए आवश्यक शक्ति उत्पन्न करते हैं । IFMs के आकार, वितरण और rostro-caudal स्वभाव आड़ा के लिए एक आसान उन्मुखीकरण की अनुमति देते हैं3 (चित्रा 2a). इस कारण से, हम Drosophila melanogasterमें मांसपेशी शोष का अध्ययन करने के लिए इन मांसपेशियों का चयन किया है ।
चित्र 1. अप्रत्यक्ष उड़ान मांसपेशियों (IFMs) व्यवस्था दिखा फल मक्खी के छाती के आरेख । (बाएँ) एक पार्श्व दृश्य का प्रतिनिधित्व करता है और (दाएँ) छाती के एक पार अनुभाग का प्रतिनिधित्व करता है. IFMs Dorso-अनुदैर्ध्य (DLM) की मांसपेशियों (लाल में) और Dorso-ventral (DVM) की मांसपेशियों (हरे रंग में) से बना रहे हैं ।
ऊतक संरचना के संरक्षण और ऊतकवैज्ञानिक वर्गों के dorso-ventral अक्ष अभिविन्यास पर नियंत्रण मांसपेशी पार अनुभागीय क्षेत्र का उचित आकलन सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण हैं. मांसपेशी संरचना हम एक निर्धारण Tomlinson एट अल से संशोधित मिश्रण का इस्तेमाल किया संरक्षण । 4 . इसके अलावा, क्योंकि मांसपेशियों आंतरिक ऊतकों हैं, Drosophilaके exoskeleton की पारगम्यता निर्धारण मिश्रण लक्ष्य ऊतकों में प्रवेश नहीं कर सकते के रूप में एक समस्या है । इस समस्या को दरकिनार, हम मक्खी सिर, पैर, पंख और पेट के अंतिम दो क्षेत्रों छेद है कि निर्धारण मिश्रण में प्रवेश करने की अनुमति बनाने के लिए हटा दिया । निर्धारण प्रोटोकॉल के भाग के रूप में हम आज़मियम tetroxide (OsO4)5है, जो बड़े पैमाने पर वसा को ठीक करने की क्षमता की वजह से प्रयोग किया जाता है के साथ उपचार शामिल ट्राइग्लिसराइड्स सहित । OsO4 सबसे संरचनाओं बहुत अच्छी तरह से बरकरार रखता है, विशेष रूप से कोशिकाविज्ञान स्तर पर और एक ही समय में छवि के विपरीत प्रदान करता है । निर्धारण के बाद, Drosophila thoraces आड़ा अर्द्ध पतली खोदी (1.5 µm) के लिए राल में एंबेडेड थे । सुधार इसके विपरीत के लिए, ऊतक इसके अतिरिक्त toluidine नीले रंग के साथ दाग हो सकता है । पूरी thoraces की छवियाँ 10x और मांसपेशी क्षेत्र में लिया गया था binarizing छवियों (समान आयामों के) द्वारा quantified गया था और कुल से बाहर मांसपेशी ऊतक (ब्लैक पिक्सल) के लिए इसी पिक्सल के प्रतिशत को बढ़ाता है, ImageJ सॉफ्टवेयर के साथ.
ऊतक तैयारी और निर्धारण मिश्रण पर संशोधन, OsO की एकाग्रता की वृद्धि के रूप में4 और glutaraldehyde समाधान, इस प्रोटोकॉल में शुरू की मांसपेशी ऊतक के अद्वितीय संरक्षण की अनुमति दी । यह इसलिए है क्योंकि प्रोटोकॉल क्षरण और ऊतक के विकृति से बचा जाता है, नमूने के पीछे विश्लेषण और भी उच्च एट्रोफिक Myotonic Dystrophy (डीएम) जैसे neuromuscular अपक्षयी रोगों से संबंधित स्थितियों में विश्वसनीय बना । इसके अधिक सामांय रूप में, डीएम प्रकार 1, इस दुर्लभ आनुवंशिक विकार के बारे में विस्तार से सीयूजी दोहराता द्वारा लाया जाता है myotonic dystrophy प्रोटीन कळेनासे (DMPK) टेप । उत्परिवर्ती DMPK आरएनए समुच्चय फार्म ribonuclear घावों कि एकांत Muscleblind-like नाभिकीय आरएनए-बाइंडिंग प्रोटीन (MBNL1-3; Muscleblind (Mbl) मे Drosophila)6. हमने दमदार मायोसिन हैवी चेन प्रमोटर (Mhc-Gal4) के तहत 250 CTG को दोहराता व्यक्त करते हुए Myotonic Dystrophy का Drosophila मॉडल जेनरेट किया । मॉडल मक्खियों एक ठेठ ' ऊपर आयोजित ' पंख phenotype के साथ उड़ान भरी थी और उनके IFMs में गंभीर मांसपेशी शोष था (चित्रा बी) । हमारे प्रयोगशाला में प्रदर्शन पिछले अध्ययनों से पता चला है कि IFMs की मांसपेशी क्षेत्र का निर्धारण एक विश्वसनीय तरीका है इन मॉडल में मांसपेशी शोष के विभिन्न रासायनिक या आनुवंशिक संशोधक के प्रभाव को बढ़ाता है7मक्खियों । एक उदाहरण के रूप में, Mbl isoform सी के व्यक्त मक्खियों में 250 CTG दोहराता व्यक्त की मांसपेशी में, मांसपेशी क्षेत्र का बचाव हासिल किया, ज़ब्ती द्वारा Mbl कमी के रूप में DM1 रोगजनन में ट्रिगर कारक है8 (चित्रा 2c). पेशी क्षेत्र भी डीएम को खिलाने के बाद बचाया गया था मॉडल Abp1 के साथ मक्खियों, सिद्ध विरोधी DM1 गतिविधि के साथ एक hexapeptide9 (चित्रा 2d) ।
चित्र 2. राल के dorsoventral वर्गों के ठहराव-एंबेडेड वयस्क thoraces । (A-D) संकेत संगत पादी के साथ Drosophila melanogaster की अप्रत्यक्ष उड़ान मांसपेशियां । (क) नियंत्रण मक्खियों (yw) । (ख) की अभिव्यक्ति 250 गैर कोडिंग मांसपेशी में CTG दोहराता (यूएएस-CTG (250) x) नियंत्रण मक्खियों की तुलना में DLMs में मांसपेशियों के क्षेत्र की कमी हुई । (ग) इस मांसपेशी शोष phenotype Muscleblind (MblC) (यूएएस-CTG (250) एक्स यूएएस-MblC) और (घ) मॉडल hexapeptide Abp1 (यूएएस-CTG (250) एक्स Abp1) के साथ मक्खियों खिला द्वारा बचाया गया था । सभी छवियों में पृष्ठीय पक्ष शीर्ष पर है । Transgenes एक मायोसिन भारी चेन प्रमोटर (Mhc)-Gal4 का उपयोग कर मांसपेशियों को प्रेरित किया गया । (ङ) ठहराव नियंत्रण मक्खियों के सापेक्ष मांसपेशी क्षेत्र के प्रतिशत की पुष्टि की है कि मतभेद महत्वपूर्ण थे । हिस्टोग्राम शो का अर्थ है ± S.E.M. * *p< 0.01 और * p < 0.05 (छात्र ´ S t-test) । स्केल बार: 200 µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.
यहां विधि की रिपोर्ट ब्याज की मांसपेशियों के विकास, रखरखाव और उंर बढ़ने, रोग विकृति और दवा परीक्षण पर ध्यान केंद्रित के रूप में यह कैसे मांसपेशी ऊतक दोनों अंतर्जात और बाह्य कारकों का जवाब के बारे में विश्वसनीय जानकारी प्रदान करता है होगा ।
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Protocol
1. निर्धारण और राल embedding
- Anesthetize के साथ मक्खियों को कार्बन डाइऑक्साइड (CO2) या एक आइस ब्लॉक का उपयोग कर हाइपोथर्मिया के माध्यम से । एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप का प्रयोग करें (पूरी मक्खी को देखने के लिए कम आवर्धन के साथ) और कैंची पैर, पंख, सिर और पेट के टर्मिनल भाग को हटाने के लिए निर्धारण के प्रवेश की सुविधा । लावे के सावधान हैंडलिंग छाती की विकृति से बचने के लिए इस कदम पर आवश्यक है ।
नोट: प्रक्रिया के अंत में उचित रूप से संसाधित व्यक्तियों की पर्याप्त संख्या सुनिश्चित करने के लिए प्रति जीनोटाइप कम से कम 12 मक्खियों के साथ प्रारंभ करें । - एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब पर बर्फ (ट्यूब प्रति 6 व्यक्तियों की एक अधिकतम रखने के लिए) का स्थानांतरण 1 समाधान के 200 µ l युक्त ।
नोट: लावे 20 से अधिक मिनट के लिए समाधान 1 में नहीं रह सकता ।- समाधान 1 के लिए, इन वॉल्यूम अनुपात में घटक मिक्स करें: ¼ ४% paraformaldehyde, ¼ ८% glutaraldehyde, ¼ ०.२ m ना२HPO४ र ¼ ०.२ m णः२पो४।
- 30 मिनट के लिए 2 समाधान के 200 µ एल जोड़ें और बर्फ पर मशीन ।
- समाधान 2: एक 1:1 (v/v) अनुपात में समाधान 1 और OsO4 मिश्रण ।
चेतावनी: OsO4 अत्यंत विषाक्त है । यह उचित सुरक्षा और निपटान के उपायों के साथ एक धुएं डाकू में हेरफेर ।
- समाधान 2: एक 1:1 (v/v) अनुपात में समाधान 1 और OsO4 मिश्रण ।
- सभी तरल निकालें । समाधान 2 के 200 µ एल जोड़ें और 1-2 एच के लिए बर्फ पर मशीन ।
- समाधान निकालें और निर्जलीकरण के माध्यम से एक वर्गीकृत इथेनॉल श्रृंखला के माध्यम से नमूने इस प्रकार है: एक बार में 30%, 50%, 70%, 90%, और दो बार निरपेक्ष इथेनॉल में; 5 मिन प्रत्येक । नमूनों को कवर करने के लिए इथेनॉल के 1 मिलीलीटर जोड़ें ।
नोट: एक बार ऊतक 90% इथेनॉल में रखा गया है, बाद में कदम कमरे के तापमान पर किया जा सकता है । - 10 मिनट प्रत्येक मशीन के लिए propylene ऑक्साइड में दो बार नमूनों की मशीन ।
चेतावनी: Propylene ऑक्साइड विषाक्त है, यह एक धुएं डाकू में उपयोग करें । - एक 1:1 (v/v) epoxy राल और propylene ऑक्साइड का मिश्रण और कमरे के तापमान पर रात भर में गर्मी से propylene ऑक्साइड बदलें ।
चेतावनी: राल अत्यंत एक तरल राज्य में विषाक्त है । राल चार घटकों का एक सेट के रूप में उपलब्ध है (ए, बी, सी और डी).- epoxy राल के लिए, एक डिस्पोजेबल चोंच में जोड़ें 54 राल के जी (एक), ४४.५ कठोर के जी (ख), त्वरक के 2.5 जी (सी) और plasticizer के 10 जी (डी) । एक धुएं डाकू में सभी राल घटकों का मिश्रण । aliquots में राल स्टोर-20 ° c (6 महीनों के लिए) या पर-80 ° c (कई वर्षों के लिए) ।
- राल को त्यागने के लिए, 70 डिग्री सेल्सियस पर यह 24 घंटे के लिए सेंकना क्योंकि ठोस राल विषाक्त नहीं है । उचित अंतरराष्ट्रीय प्रक्रियाओं के अनुसार भारी धातुओं समूह में सभी पिछले समाधान त्यागें, क्योंकि समाधान OsO 4 के निशान शामिल कर सकते हैं।
- 100% राल के साथ पिछले मिश्रण बदलें, और 4 एच के लिए नमूनों की मशीन ।
- नए राल युक्त प्लास्टिक मोल्ड को लावे हस्तांतरण (मोल्ड के प्रत्येक कुआं में एक लोथ) । एक तेज लकड़ी के छड़ी या सुई का प्रयोग करें हस्तांतरण और कुओं में लावे को ओरिएंट और 70 डिग्री सेल्सियस पर एक पाश्चर ओवन में रात भर polymerize राल छोड़ दें ।
नोट: ट्रिमिंग और अनुभाग के पीछे के लिए लावे के उचित अभिविंयास सुनिश्चित करने के लिए, लावे अपने लंबे पक्ष पर झूठ बोलना चाहिए, लोथ के पूर्वकाल भाग के साथ बहुत अच्छी तरह से किनारे के पास ।
2. ट्रिमिंग और ब्लॉक के अनुभाग
- molds से बहुलक राल ब्लॉकों को हटा दें । दूर राल ट्रिम करने के लिए उस्तरा ब्लेड का प्रयोग करें, एक trapezoidal लोथ आसपास के आकार के फार्म और microtome में उचित अभिविंयास दे । तुलनीय परिणाम प्राप्त करने के लिए अनुप्रस्थ सीवन के बाद सभी लावे खोदी शुरू करो ।
नोट: खंड DLMs के anteroposterior अक्ष के लिए सीधा नमूना सही रूप से ट्रिम करने के लिए होना चाहिए ( चित्र 3) ।
चित्र 3 . राल के Dorsoventral वर्गों-एंबेडेड वयस्क thoraces के Myotonic Dystrophy मॉडल मक्खियों । (क) में, नमूने की ट्रिमिंग सही नहीं थी जैसा कि छवि के पृष्ठीय-दाएँ भाग में अनुभाग पूरी तरह से मांसपेशियों को आड़ा नहीं था. एक परिणाम के रूप में, ऊपरी दाईं ओर तीन मांसपेशी बंडलों बाईं ओर के लोगों से भी बड़ा लगता है । इस गलती की मांसपेशी क्षेत्र के एक अनुमान में परिणाम होगा । (ख) एक सही ढंग से छंटनी राल ब्लॉक से अनुभाग । स्केल बार: 200 µm ।
- एक ultramicrotome के साथ 1.5-µm मोटी वर्गों में कटौती और जिलेटिन की स्लाइड पर पानी की बूंदों में वर्गों हस्तांतरण ।
- तुलनीय परिणाम प्राप्त करने के लिए सभी नमूनों के लिए mesothorax खंड से वर्गों प्राप्त करें ।
- एच2O वाष्पीकरण तक 70-80 डिग्री सेल्सियस पर एक हीटिंग ब्लॉक पर वर्गों युक्त स्लाइड रखें । इस बिंदु पर, नमूने OsO4 कंट्रास्ट (चित्र 4a) के साथ मनाया जा सकता है ।
3. धुंधला IFM वर्गों
- हीटिंग ब्लॉक पर लगभग 30 एस के लिए पर्याप्त toluidine नीले रंग के साथ वर्गों को कवर ।
- toluidine नीले समाधान के लिए, 1% toluidine नीला और बोरेक्रस का 1% H2O में भंग करें ।
- एच2O से कुल्ला करें और पानी को वाष्पित करने के लिए गर्म प्लेट पर स्लाइड छोड़ें । दोहराएं toluidine नीले रंग के साथ धुंधला अगर इसके विपरीत (चित्रा 4B) को बढ़ाया जाना चाहिए ।
चित्र 4 . राल के Dorsoventral वर्गों-अलग विपरीत दाग के साथ वयस्क thoraces एंबेडेड । दोनों पैनलों DM1 मॉडल की छवियों को दिखाने के चित्र 2dमें के रूप में Abp1 के साथ खिलाया मक्खियों । (a) OsO4 कंट्रास्ट के साथ एक अनुभाग की छवि । (ख) धारा toluidine नीले रंग के साथ दाग मांसपेशी बंडलों के बेहतर दृश्य की अनुमति देता है । स्केल बार: 200 µm ।
4. बढ़ते IFM वर्गों
- जब तक एच2O वाष्पीकरण न हो जाए तब तक हीटिंग ब्लॉक के साथ स्लाइड को सुखाएं ।
- वर्गों पर बढ़ते माध्यम के 1 या 2 बूंदें रखो और एक coverslip पर डाल दिया ।
सावधानी: एक धुएं डाकू में इस कदम बाहर ले क्योंकि बढ़ते मध्यम विषाक्त है ।
5. छवियों और मांसपेशी क्षेत्र के ठहराव का अधिग्रहण
- कम आवर्धन पर छवियों को ले ताकि DLM मांसपेशियों के पूरे सेट ध्यान में है । हम आम तौर पर 10x का उपयोग करें ।
- सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए उड़ान भरने के प्रति कम से कम 5 धारावाहिक छवियों को ले और प्रयोगात्मक समूह प्रति कम से कम 5 मक्खियों का विश्लेषण ।
- पूरी मांसपेशियों वाली छवि का चयन करें (चित्र 5) । अक्ष या अनुभाग के उन्मुखीकरण की जाँच करें और अनुचित अभिविन्यास के साथ नमूनों को त्यागें, जो परिणामों को विकृत करेगा (3 ए के आंकड़े की तुलना करें/
- केवल DLMs (चित्र 5/5B) वाले किसी क्षेत्र (पिक्सेल में) का चयन करने के लिए ImageJ सॉफ़्टवेयर का उपयोग करें । विभिंन प्रायोगिक समूहों के बीच तुलना के लिए, संदर्भ क्षेत्र में इस्तेमाल किया जा हमेशा सबसे बड़ी मांसपेशियों के साथ उड़ जाएगा । भिन्न पादी की सभी छवियों में तुलना करने के लिए, संदर्भ क्षेत्र (चित्र 5B) को समान आयामों के DLMs वाले क्षेत्र का चयन करें ।
- छवि के साथ छवियों Binarize-जंमू कमान: प्रक्रिया/द्विआधारी/बाइनरी बनाने के लिए और क्षेत्रों या पिक्सल है कि ब्याज की मांसपेशियों (चित्रा 5C) के अनुरूप नहीं है हटा दें ।
- इस स्थिति में कि artefactual काले धब्बे मांसपेशी के अलावा अन्य क्षेत्रों में दिखाई देते हैं, उन्हें आदेश आरेखण उपकरण के साथ हटाएं और इरेज़र प्रतीक का चयन करें ।
चित्र 5 . मांसपेशी क्षेत्र निर्धारण के लिए छवि विश्लेषण प्रक्रिया । (क) आड़ा खंड के Myotonic Dystrophy टाइप 1 मॉडल फ्लाई छाती युक्त आयत के साथ DLM । (ख) केवल अप्रत्यक्ष उड़ान मांसपेशियों और आंत (*) के साथ चयनित क्षेत्र । (C) बायनेरिज़ छवि । काले क्षेत्रों ब्याज की मांसपेशियों के अनुरूप हैं । आंत मांसपेशी क्षेत्र के एक सटीक ठहराव के लिए मिट गया है । स्केल बार: 200 µm ।
- आदेश के साथ कुल से बाहर मांसपेशी ऊतक (ब्लैक पिक्सल) के लिए इसी पिक्सेल का प्रतिशत बढ़ाता है: विश्लेषण/माप और विकल्प क्षेत्र अंशका चयन करें । क्षेत्र का यह प्रतिशत प्रत्येक मक्खी के DLM मांसल जन का एक अनुमान है.
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Representative Results
यह यों तो है कि MblC या Abp1 के प्रशासन के व्यक्त Myotonic Dystrophy मक्खी मॉडल हम DLMs, जो IFMs का हिस्सा है पर ध्यान केंद्रित की एट्रोफिक phenotype में कोई प्रभाव था (चित्रा 1) । हम निर्धारित किया है कि मॉडल मक्खियों, जो 250 गैर कोडिंग एक्सप्रेस मायोसिन भारी श्रृंखला प्रमोटर (Mhc)-Gal4 द्वारा संचालित पेशियां भर में CTG दोहराता है, पर नियंत्रण मक्खियों की तुलना में मांसपेशी क्षेत्र के एक 50% कमी थी । इसके विपरीत, MblC की सह अभिव्यक्ति और विस्तारित CTG एक ही ड्राइवर के साथ दोहराता है, दृढ़ता से ऐसे phenotype और crossectional मांसपेशी क्षेत्र दबा नियंत्रण का 70% (सामांय) मक्खियों था । पोषक मीडिया में Abp1 hexapeptide के प्रशासन इसी तरह एट्रोफिक phenotype दबा दिया, और मॉडल मक्खियों कि यौगिक लिया था सामांय मांसपेशी क्षेत्र के लगभग 60% दिखाया (के बजाय 50% है कि DM1 मक्खियों की खासियत है; चित्रा 2E). इन नमूनों की ठहराव के लिए, हम विपरीत बढ़ाने के लिए toluidine नीले रंग के साथ सना हुआ वर्गों का इस्तेमाल किया (आंकड़े 4 और 5).
हम ध्यान दें कि प्रक्रिया के दौरान तकनीकी glitches के एक नंबर महत्वपूर्ण अंतिम ठहराव के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं । एक आम एक है कि राल ब्लॉकों सही ढंग से छंटनी नहीं कर रहे हैं, जो नमूना को गुमराह करने और DLMs के टेढ़ा अनुभाग के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । एक परिणाम के रूप में, कुछ DLM की मांसपेशियों को एक तरफ contralateral एक की तुलना में बड़ा लग सकता है (उदाहरण के लिए चित्रा 3देखें), जो अंतिम ठहराव में एक महत्वपूर्ण त्रुटि परिचय. एक और गलती है कि मांसपेशियों के ऊतकों (चित्रा 6), जो नीचा और असंभव मांसपेशी क्षेत्र के सटीक ठहराव बनाने लग रहा है में निर्धारण के अपर्याप्त पैठ है हो सकता है ।
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Discussion
यह प्रदर्शित किया गया है कि Drosophila melanogaster मानव neuromuscular रोगों का अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी मॉडल है7,10,11, सहित Myotonic Dystrophies, जो की उपस्थिति की विशेषता है पेशी शोष । यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल एक मक्खी मॉडल में एक विशेष रोग की शुरुआत या प्रगति की वजह से मांसपेशी अध..... उदाहरण के लिए, यह भी पालन करने के लिए संभव है और विभिन्न उम्र के मक्खियों में इस विश्लेषण प्रदर्शन से मांसपेशी फाइबर के अध...
प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण चरण हैं । अपने निर्धारण से पहले मक्खियों को काटना करने के लिए आवश्यक समय ऊतक के क्षरण से बचने के लिए कम किया जाना चाहिए । मांसपेशियों (चित्रा 6) में निर्धारण समाधान के प्रवेश के लिए, यह सिर, पंख और मक्खियों के पैर को दूर करने के लिए उड़ान के इंटीरियर के लिए समाधान की पहुंच सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है । यह आड़ा वर्गों है जिसमें ब्याज की मांसपेशियों को पूरी तरह से दिखाई दे रहे है प्राप्त करने के लिए आवश्यक है । ठहराव के लिए नमूनों की binarization महत्वपूर्ण है इसलिए ध्यान रखें कि चयनित पिक्सेल्स (ब्लैक पिक्सल) ब्याज के ऊतकों के अनुरूप हों और ब्याज के पूरे क्षेत्र का चयन किया जाता है ।
चित्र 6। (*) मांसपेशियों में निर्धारण के अपर्याप्त प्रवेश के साथ वयस्क Drosophila छाती, जो नमूने के प्रसंस्करण के दौरान गिरावट और ऊतक के विकृति का कारण बनता है । स्केल बार: 200 µm ।
एक इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया एजेंट के OsO है4, जो सबसे संरचनाओं बहुत अच्छी तरह से बरकरार रखता है, विशेष रूप से कोशिकाविज्ञान स्तर पर, और एक ही समय में छवि5के विपरीत प्रदान करता है । हालांकि, विधि का एक महत्वपूर्ण दोष OsO4की विषाक्तता है, जो हमेशा एक धुएं हुड में इस्तेमाल किया जाना चाहिए और सुरक्षित हैंडलिंग और निपटान की आवश्यकता है । इस प्रोटोकॉल न केवल मांसपेशी ऊतक फिक्सिंग और embedding प्रक्रिया की वजह से सटीक ठहराव की अनुमति देता है, यह भी इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (EM) की तैयारी के रूप में एक और आवेदन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । हालांकि, यह एक आंतरिक सीमा ग्रस्त है क्योंकि परिणामी ऊतकवैज्ञानिक अनुभागों अनुवर्ती परख, जैसे immunohistochemistry में उपयोग नहीं किया जा सकता ।
अंत में, इस विधि भी इस प्रकार आनुवंशिक या रासायनिक स्क्रीन8,9में संशोधक की विश्वसनीय पहचान की अनुमति छोटे मांसपेशियों क्षेत्र मतभेदों का पता लगाने के लिए अनुकूलित है । फिर भी, के बाद से वृद्धि की मांसपेशी क्षेत्र जरूरी बेहतर मांसपेशी समारोह संकेत नहीं करता है, पार अनुभागीय मांसपेशी क्षेत्र निर्धारण आदर्श ऐसे उड़ान परख12के रूप में कार्यात्मक परख के साथ संबंधित होना चाहिए ।
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Disclosures
ब्याज का कोई विरोध नहीं घोषित ।
Acknowledgments
लेखक इस प्रोटोकॉल पर फीड-बैक और सुधार के लिए शोधों जीनोमिक्स Group और कॅथ्रीन J Hanson के सदस्यों का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । इस परियोजना को अनुसंधान अनुदान SAF2015-64500-R के साथ किया गया, जिसमें यूरोपीय क्षेत्रीय विकास निधियां शामिल हैं, Ministerio de Economia y Competitividad द्वारा आर ए को संमानित किया गया ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Image-J software | National Institutes of Health | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Ultramicrotome | Leica | Leica UC6 | |
| Microscope | Leica | Leica MZ6 | Bright field technique. |
| Razor blades | Electron Microscopy Sciences | 71970 | Several alternative providers exist. |
| Scissors | World Precision World | 14003 | Several alternative providers exist. |
| Embedding molds | Electron Microscopy Sciences | 70900 | Several alternative providers exist. |
| Glutaraldehyde | Fluka (Sigma) | 49624 | Toxic. |
| OsO4 | Polyscience | 0972A | Extremely toxic. |
| Propylene oxide | Sigma Aldrich | 82320-250ML | Extremely toxic. |
| resin (Durcupan) | Sigma Aldrich | 44611-44614 | Carcinogenic when it is unpolymerized. |
| Toluidine blue | Panreac | 251176 | Toxic. |
| Mountant Medium (DPX) | Sigma Aldrich | 44581 | Dangerous. |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148-500G | Harmful. |
| Na2HPO4 | Panreac | 122507 | 0.2 M dilution. |
| NaH2PO4 | Panreac | 121677 | 0.2 M dilution. |
| Borax | Panreac | 3052 | Toxic. |
References
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