Optisk Cross-Sectional muskel området fastsettelse av Drosophila Melanogaster voksen indirekte flygingen musklene

Summary

Vi rapporterer en metode å kvantifisere muskelområdet, som er en indirekte metode for å bestemme muskelmasse i Drosophila voksne. Viser vi anvendelsen av vår metode ved å analysere indirekte flyturen muskler i Drosophila modell av Myotonic Dystrophy sykdom.

Abstract

Muskelmasse herjer, er kjent som muskelatrofi, en vanlig fenotypen i Drosophila modeller av neuromuscular sykdommen. Vi har brukt indirekte flygingen musklene (IFMs) flyr, spesielt dorso-langsgående musklene (DLM), som den eksperimentelle kan måle atrofier fenotypen forårsaket av forskjellige genetiske årsaker. I denne protokollen, beskriver vi hvordan du bygger inn fly thorax muskler semi tynn snitting, hvordan å få en god kontrast mellom muskler og de omkringliggende vev og hvordan å behandle optisk mikroskop bilder for halvautomatisk oppkjøpet av kvantifiserbare data og analyse. Vi beskriver tre spesifikke programmer av metodologiske rørledningen. Først viser vi hvordan metoden kan brukes for å kvantifisere muskel forverring av myotonic dystrophy fly modell; andre kan måling av muskel tverrsnitt bidra til å identifisere tilblivelse det fremme eller hindrer muskelatrofi og/eller muskel degenerasjon; tredje denne protokollen kan brukes for å fastslå om en kandidat sammensatt betydelig endre en gitt atrofier fenotypen indusert av en sykdom-forårsaker mutasjoneller en miljømessig utløse.

Introduction

Thorax frukt fly inneholder to forskjellige klasser av flygingen musklene, som er funksjonelt, fysiologisk og anatomisk distinkte. Disse musklene er: indirekte flygingen musklene (IFM), som består av en dorso-langsgående (DLM) og dorso-ventrale (DVM) muskler (figur 1) og synkrone flyturen kontrollere muskler^1,2. Disse musklene generere sammen opphøyet mekanisk kraft som kreves for fly. Størrelse, distribusjon og rostro-caudal disponeringen av IFMs tillater en enkel retning for tverrgående snitt³ (figur 2A). Derfor har vi valgt disse musklene å studere muskelatrofi i Drosophila melanogaster.

Figur 1. Diagram over thorax frukt fly viser indirekte flygingen musklene (IFMs) arrangement. (Til venstre) representerer en lateral visning og (høyre) representerer et tverrsnitt av pronotum. IFMs består av Dorso-langsgående (DLM) musklene (i rødt) og Dorso-ventrale (DVM) muskler (i grønt).

Vevet struktur og kontroll over dorso-ventrale aksen retning av histologiske deler er avgjørende for å sikre riktig vurdering av muskel tverrsnitt. Å bevare muskel vi brukte en fiksering blanding endret fra Tomlinson et al. ⁴ . Videre fordi musklene er interne vev, er varmeisolerende av Drosophilaexoskeleton et problem som fiksering blandinger ikke kan trenge gjennom på målet vev. For å omgå dette problemet, fjernet vi fly hodet, Ben, vinger og de to siste segmentene av magen til å lage hull som tillot fiksering blandingen inn. Som en del av fiksering protokollen vi inkludert behandling med osmium tetroxide (OsO₄)⁵, som er mye brukt fordi det er mulighet for å fikse fett, inkludert triglyserider. OsO₄ beholder de fleste strukturer svært godt spesielt på fargemaskin nivå og samtidig gir kontrast til bildet. Etter fiksering, var Drosophila thoraces innebygd i harpiks for tverrgående semi tynne snitt (1,5 µm). Økt kontrast, kan vev være i tillegg farget med toluidine blå. Bilder av komplett thoraces ble tatt i 10 X og muskelområdet ble kvantifisert ved binarizing bilder (av samme dimensjoner) og kvantifisere andelen bildepunkter som tilsvarer muskelvev (svart piksler) av totalt, med ImageJ programvare.

Endringer på vev forberedelse og fiksering blandinger, som økningen av konsentrasjonen av OsO₄ og glutaraldehyde løsning, introdusert i denne protokollen, tillatt unike bevaring av muskelvev. Dette er fordi protokollen unngår fornedrelse og deformasjon av vev, gjør bakre analyse av prøvene mer pålitelig selv i svært atrofier betingelsene knyttet nevromuskulær degenerative sykdommer som Myotonic Dystrophy (DM). I sin vanligste form, DM type 1, er denne sjeldne genetisk lidelse forårsaket av utvidet CUG gjentar i myotonic dystrophy protein kinase (DMPK) utskrifter. Mutant DMPK RNA samler skjemaet ribonuclear foci som beslaglegge Muscleblind-lignende kjernefysiske RNA-bindende proteiner (MBNL1-3; Muscleblind (Mbl) i Drosophila)⁶. Vi generert en Drosophila modell av Myotonic Dystrophy ved å uttrykke 250 CTG gjentas under muskel myosin tunge kjeden arrangøren (Mhc-Gal4). Modellen var fly med en typisk "opp-holdt wings' fenotypen og hadde alvorlige muskel atrofi i deres IFMs (figur 2B). Tidligere studier utført i vårt laboratorium har vist at fastsetting av muskel IFMs er en pålitelig metode å kvantifisere effekten av ulike kjemiske eller genetisk modifikatorer av muskelatrofi i disse modellen flyr⁷. Som et eksempel oppnådd overuttrykte Mbl isoformen C i fluer uttrykke den 250 CTG gjentar i muskler, en redning av muskel som Mbl uttømming av lagring er den utløsende faktoren i DM1 patogenesen⁸ (figur 2C). Muskelområdet ble også reddet etter fôring DM modellen flyr med Abp1, en hexapeptid med påvist anti-DM1 aktivitet⁹ (figur 2D).

Figur 2. Kvantifisering av dorsoventral deler av harpiks-embedded voksen thoraces. (A-D) indirekte flygingen musklene Drosophila melanogaster med de angitte relevante genotyper. (A) kontroll flyr (yw). (B) uttrykk for 250 ikke-koding CTG gjentar i muskel (UAS-CTG(250)x) forårsaket en reduksjon av muskelområdet i DLMs i forhold til kontrollen fluer. (C) denne muskelen atrofi fenotypen ble reddet av overuttrykte Muscleblind (MblC) (UAS-CTG (250) x UAS-MblC) og (D) modell fluer med hexapeptid Abp1 (UAS-CTG (250) x Abp1). Alle bilder er dorsal side på toppen. Effekter av transgener ble kjørt til muskel ved hjelp av en Myosin tunge-kjeden promoter (Mhc)-Gal4. (E) kvantifisering av muskelområdet i forhold til kontrollen fluene bekreftet at forskjellene var betydelig. Histogrammet viser betyr ± S.E.M. **p< 0,01 og * p < 0,05 (Student´s t-test). Skala bar: 200 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Metoden her rapportert vil være av interesse for forskere muskelutvikling, vedlikehold og aldring, sykdom patologi og narkotikatesting som det gir pålitelig informasjon om hvordan muskelvev reagerer på både endogene og eksterne faktorer.

Protocol

1. fiksering og harpiks innebygging

1. Bedøve fluene med karbondioksid (CO₂) eller via nedkjøling med en isblokk. Bruk en dissecting mikroskopet (med lav forstørrelse å se hele fly) og saks for å fjerne bena, vinger, hode og den terminal delen av magen til rette utbredelsen av bindemiddel. Forsiktig håndtering av skrottene kreves på dette trinnet å unngå deformasjon av pronotum.
   Merk: Start med minst 12 fluer per genotype å sikre et tilstrekkelig antall riktig behandlet individer på slutten av prosedyren.
2. Overføre skrottene til en 1,5 mL tube på isen (plassere maksimum 6 personer per tube) inneholder 200 µL av løsning 1.
   Merk: Skrottene kan ikke være i løsning 1 for mer enn 20 min.
   1. Løsning 1, blande komponenter i disse volum proporsjonene: ¼ 4% paraformaldehyde, ¼ 8% glutaraldehyde, ¼ 0,2 M Na₂HPO₄ og ¼ 0,2 M NaH₂PO₄.
3. Legg til 200 µL av løsning 2 og ruge på is 30 min.
   1. Løsning 2: Bland løsning 1 og OsO₄ i en 1:1 (v/v) andel.
      FORSIKTIG: OsO₄ er svært giftig. Manipulere den i avtrekksvifte med passende tiltak for sikkerhet og disposisjon.
4. Fjern alle flytende. Legg til 200 µL av løsning 2 og ruge på is 1-2 h.
5. Fjern løsningen og tørke prøvene gjennom en gradert etanol serie som følger: etter 30%, 50%, 70%, 90% og to ganger, i absolutte etanol; 5 minutter hver. Legg 1 mL av etanol å dekke prøvene.
   Merk: Når vev er plassert i 90% etanol, de påfølgende trinnene kan utføres ved romtemperatur.
6. Inkuber eksemplene to ganger i propylen oksid i 10 min hver inkubasjon.
   FORSIKTIG: Propylen oksid er giftig, bruke den i avtrekksvifte.
7. Erstatt propylen oksid av en 1:1 (v/v) blanding av epoxy harpiks og propylen oksid og ruge ved romtemperatur over natten.
   FORSIKTIG: Harpiks er svært giftig i flytende form. Harpiksen er tilgjengelig som et sett med fire komponenter (A, B, C og D).
   1. Epoxy harpiks, legge til i et engangs beaker 54 g harpiks (A), 44,5 g Herder (B), 2.5 g akseleratoren (C) og 10 g plasticizer (D). Kombiner alle harpiks komponentene i avtrekksvifte. Lagre harpiks i dele på 20 ° C (for opptil 6 måneder) eller på-80 ° C (i flere år).
   2. Hvis du vil forkaste harpiks, bake den ved 70 ° C i 24 timer fordi solid harpiksen ikke er giftig. Forkaste alle tidligere løsningene i gruppen tungmetaller etter passende internasjonale prosedyrer, fordi løsninger kan inneholde spor av OsO_4.
8. Erstatt tidligere blandingen med 100% harpiks, og ruge prøvene 4 h.
9. Overføre skrottene til plast former som inneholder nye harpiks (en carcass i hver brønn av mold). Bruk en skjerpet trestav eller p å overføre og orientere skrottene i brønnene og la skal danner over natten i Pasteur ovn på 70 ° C.
   Merk: For å sikre riktig retning skrottene til bakre trimming og snitting, skrottene bør ligge på lenge siden, med den fremre delen av carcass svært nær kanten av brønnen.

2. trimming og snitting av blokker

1. Fjerne polymerized harpiks blokker fra formene. Bruk barberblad til å klippe bort harpiksen danner en trapesform rundt carcass og gi riktig retning i mikrotomen. Starte snitting alle skrottene etter det tverrgående suture å oppnå sammenlignbare resultater.
   Merk: Delen må vinkelrett på den anteroposterior aksen DLMs trimme prøven riktig ( Figur 3).

Figur 3 . Dorsoventral deler av harpiks-embedded voksen thoraces av det Myotonic Dystrophy modell flyr. I (A) var trimmingen av prøven ikke riktig delen i dorsal høyre del av bildet ikke var helt tverrgående til musklene. Som en konsekvens, virke tre muskel buntene til øvre høyre større enn de av til venstre. Denne feilen vil føre til en overvurdering av muskelområdet. (B) delen av en korrekt trimmet harpiks. Skala bar: 200 µm.

1. Skjær 1.5-µm tykke snitt med en ultramicrotome og overføre delene til vanndråper over gelatinized lysbilder.
   1. Få delene fra mesothorax-segmentet alle prøvene å oppnå sammenlignbare resultater.
2. Plass lysbildene inneholder delene på oppvarming blokk på 70-80 ° C til H₂O fordamper. På dette punktet, kan prøvene observeres med OsO₄ kontrast (figur 4A).

3. farging IFM deler

1. Dekke avsnittene med nok toluidine blå for ca 30 s på oppvarming blokk.
   1. Toluidine blå løsning oppløse 1% av toluidine blå og 1% av boraks i H₂O.
2. Skyll med H₂O og la lysbildene på en varm plate for å fordampe vannet. Gjenta den flekker med toluidine blå hvis kontrasten må være forbedret (figur 4B).

Figur 4 . Dorsoventral deler av harpiks-embedded voksen thoraces med forskjellige kontrast stainings. Både panelene viser bilder av DM1 modellen flyr med Abp1 som figur 2D. (A) bilde av en del med OsO₄ kontrasten. (B) delen farget med toluidine blå kan bedre visualisering av muskel bunter. Skala bar: 200 µm.

4. montering IFM deler

1. Tørr lysbildene med oppvarming blokk til H₂O fordamper.
2. Sett 1 eller 2 dråper montering medium på delene og sette på en dekkglassvæske.
   Forsiktig: Utføre dette trinnet i avtrekksvifte fordi montering mediet er giftig.

5. kjøp av bilder og kvantifisering av muskelområdet

1. Ta bilder på lav forstørrelsen slik at hele settet med DLM musklene er i fokus. Vi bruker vanligvis 10 X.
   1. Ta minst 5 serielle bilder per fly for statistisk analyse og analysere minst 5 fluer per forsøksgruppen.
2. Velg bildet som inneholder hele musklene (figur 5A). Sjekk akse- eller retningen for avsnittet og forkaste prøvene med upassende orientering, som vil forvrenge resultatene (sammenligne tallene 3A / 3B skille mellom dårlig og godt orientert deler, henholdsvis).
3. Bruk ImageJ programvare for å velge et område (i piksler) som inneholder bare DLMs (figur 5A/5B). Til sammenligning mellom ulike eksperimentelle grupper vil referanseområdet brukes alltid være fly med største musklene. I alle bildene av de ulike genotyper å sammenligne, velger du et område som inneholder DLMs av samme dimensjonene til referanseområdet (figur 5B).
4. Binarize bildene med kommandoen bilde-J: Prosessen/binær/gjøre binære og slette områder eller piksler som ikke samsvarer med musklene rundt (figur 5C).
   1. I tilfelle som artefactual svarte flekker vises i andre områder enn muskel sletter dem med kommandoen tegneverktøy og velge viskelær symbol.

Figur 5 . Bilde analyse prosedyre for muskel området besluttsomhet. (A) tverrgående delen av Myotonic Dystrophy 1 modellen flyr syn med et rektangel som inneholder DLM. (B) merket område med bare indirekte flygingen musklene og tarmen (*). (C) Binarized bildet. De svarte områdene tilsvarer musklene rundt. Tarmen er slettet for en nøyaktig kvantifisering av muskelområdet. Skala bar: 200 µm.

5. Kvantifisere andelen bildepunkter som tilsvarer muskelvev (svart piksler) av totalt med kommandoen: Analyser/måling og velg alternativet området brøkdel. Dette området er en vurdering av DLM muskel masse hvert fly.

Representative Results

Å kvantifisere om overuttrykte MblC eller av Abp1 hadde noen effekt i atrofier fenotypen av Myotonic Dystrophy fly modellen vi fokusert på DLMs, som en del av IFMs (figur 1). Vi bestemt at modellen flyr, som express 250 ikke-koding CTG gjentar hele muskulaturen drives av Myosin tunge-kjeden arrangøren (Mhc)-Gal4, hadde en 50% reduksjon av muskelområdet forhold for å kontrollere fluer. Derimot co uttrykk for MblC og utvidet CTG gjentar samme driveren, undertrykt sterkt slik fenotypen og crossectional muskelområdet var 70% av kontroll (normal) fluer. Administrasjon av Abp1 hexapeptid i nutritive media tilsvarende undertrykt atrofier fenotype, og modellen flyr som hadde tatt sammensatt viste ca 60% av normal muskelområdet (i stedet for 50% som er typisk for DM1 fluer; Figur 2E). For kvantifisering av disse prøvene brukte vi deler farget med toluidine blå for å forbedre kontrasten (tall 4 og 5).

Vi oppmerksom på at under prosedyren en rekke tekniske glitches betydelig forstyrre den endelige kvantifiseringen. En felles er at harpiks blokker ikke er riktig beskåret, som kan misorient prøven og føre til skrå snitting av DLMs. Som en konsekvens, noen DLM muskler ser kanskje større på den ene siden i forhold til kontralateral en (se for eksempel Figur 3), som introduserer en alvorlig feil i den siste kvantifiseringen. En annen feil som kan oppstå er utilstrekkelig penetrasjon av bindemiddel i muskelvev (figur 6), som ser degradert og deformert gjør den nøyaktig kvantifiseringen av muskelområdet umulig.

Discussion

Det har blitt demonstrert at Drosophila melanogaster er en nyttig modell å studere human neuromuscular sykdommen^7,10,11, inkludert Myotonic Dystrophies, som er preget av utseendet på muskel atrofi. Protokollen presenteres her er et nyttig verktøy for å kvantifisere muskel degenerering forårsaket av utbruddet eller progresjon av sykdommen i en fly modell. For eksempel er det også mulig å følge og kvantifisere degenerasjon av muskel fiber ved å utføre denne analysen i fluer i ulike aldre.

Det er viktige skritt i protokollen. Tiden det tar å dissekere fluene før deres fiksering minimeres for å unngå nedbrytning av vev. For penetrasjon av etappe, den stabiliserende løsningen i musklene (figur 6) er det viktig å fjerne hodet, vinger og Ben Fluenes å sikre tilgang av løsninger til indre av fly. Det er viktig å få tverrgående delene hvor musklene rundt er helt synlige. Binarization av prøvene for kvantifiseringen er kritisk så Merk at de merkede bildepunktene (svart piksler) tilsvarer vevet rundt og hele området rundt er valgt.

Figur 6. Voksen Drosophila syn med utilstrekkelig penetrasjon av bindemiddel i musklene (*), som forårsaker nedbrytning og deformasjon av vev under behandlingen av prøven. Skala bar: 200 µm.

En av reagensene i denne protokollen er OsO₄, som bevarer de fleste strukturer svært godt spesielt på fargemaskin nivå, og samtidig gir kontrast til bilde⁵. En viktig ulempe metoden er imidlertid toksisitet av OsO₄, som alltid må brukes i avtrekksvifte og krever sikker håndtering og avhending. Denne protokollen ikke bare lar nøyaktig kvantifisering av muskelvev fastsetting og innebygging prosedyre, det kan også brukes til et annet program som elektronmikroskop (EM) forberedelse. Men lider den en iboende begrensninger fordi de resulterende histologiske delene ikke kan brukes i påfølgende analyser, som immunohistochemistry.

Til slutt, denne metoden er også optimalisert for å oppdage små muskel området forskjeller dermed gir pålitelig identifikasjon av modifikatorer i genetisk eller kjemiske skjerm^8,9. Likevel siden økt muskelområdet ikke betyr nødvendigvis bedre muskel funksjon, skal cross-sectional muskel området vilje være ideelt korrelert med funksjonell analyser som flight søk¹².

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Image-J software	National Institutes of Health		https://imagej.nih.gov/ij/
Ultramicrotome	Leica	Leica UC6
Microscope	Leica	Leica MZ6	Bright field technique.
Razor blades	Electron Microscopy Sciences	71970	Several alternative providers exist.
Scissors	World Precision World	14003	Several alternative providers exist.
Embedding molds	Electron Microscopy Sciences	70900	Several alternative providers exist.
Glutaraldehyde	Fluka (Sigma)	49624	Toxic.
OsO4	Polyscience	0972A	Extremely toxic.
Propylene oxide	Sigma Aldrich	82320-250ML	Extremely toxic.
resin (Durcupan)	Sigma Aldrich	44611-44614	Carcinogenic when it is unpolymerized.
Toluidine blue	Panreac	251176	Toxic.
Mountant Medium (DPX)	Sigma Aldrich	44581	Dangerous.
Paraformaldehyde	Sigma Aldrich	P6148-500G	Harmful.
Na2HPO4	Panreac	122507	0.2 M dilution.
NaH2PO4	Panreac	121677	0.2 M dilution.
Borax	Panreac	3052	Toxic.