Summary
Segnaliamo un metodo per quantificare l'area del muscolo, che è un metodo indiretto per determinare la massa muscolare in Drosophila adulti. Dimostriamo che l'applicazione della nostra metodologia analizzando il volo indiretto i muscoli in un modello di Drosophila di malattia di Steinert.
Abstract
Massa del muscolo che spreca, conosciuta come atrofia muscolare, è un fenotipo comune in Drosophila modelli di malattie neuromuscolari. Abbiamo usato i muscoli di volo indiretto (IFM) di mosche, in particolare i muscoli dorso-longitudinale (DLM), come lo sperimentale oggetto di misura il fenotipo atrofico causato da diverse cause genetiche. In questo protocollo, descriviamo come incorporare i muscoli del torace volare per il taglio sottile di semi, come ottenere un buon contrasto fra il muscolo ed il tessuto circostante e come elaborare immagini al microscopio ottico per acquisizione semiautomatica di dati quantificabili e analisi. Descriviamo tre applicazioni specifiche della pipeline metodologica. In primo luogo, ci mostra come il metodo può essere applicato per quantificare la degenerazione muscolare in un modello di distrofia myotonic fly; in secondo luogo, la misurazione della sezione trasversale del muscolo può aiutare a identificare i geni che possono promuovono o impediscono l'atrofia del muscolo e/o degenerazione del muscolo; in terzo luogo, questo protocollo può essere applicato per determinare se un candidato composto è in grado di modificare in modo significativo un determinato fenotipo atrofico indotto da una mutazione malattia-causanteo da un innesco ambientale.
Introduction
Il torace del moscerino della frutta contiene due diverse classi di muscoli di volo, che sono funzionalmente, fisiologicamente e anatomicamente distinti. Questi muscoli sono: i muscoli di volo indiretto (IFM), che sono composte di dorso-longitudinale (DLM) e muscoli del dorso-ventrale (DVM) (Figura 1) e il volo sincrono controllano muscoli1,2. Questi muscoli generano insieme l'elevata potenza meccanica necessaria per il volo. La dimensione, la distribuzione e la disposizione rostro-caudale dell'IFMs permettono un agevole orientamento per sezionamento trasversale3 (Figura 2A). Per questo motivo, abbiamo selezionato questi muscoli per studiare l'atrofia del muscolo in Drosophila melanogaster.
Figura 1. Diagramma del torace del moscerino della frutta che mostra i muscoli di volo indiretto (IFM) disposizione. (A sinistra) rappresenta una vista laterale e (a destra) rappresenta una sezione trasversale del torace. L'IFM sono composti da dei muscoli del Dorso-longitudinale (DLM) (in rosso) e il Dorso-ventrale (DVM) muscoli (in verde).
Conservazione della struttura del tessuto e il controllo sull'orientamento dell'asse dorso-ventrale delle sezioni istologiche sono fondamentali per garantire la corretta valutazione della sezione trasversale del muscolo. Per preservare la struttura del muscolo, che abbiamo usato una miscela di fissazione per l'ultima volta da Tomlinson et al. 4 . Inoltre, perché i muscoli sono tessuti interni, l'impermeabilità dell'esoscheletro di Drosophilaè un problema come fissazione miscele non possono penetrare i tessuti di destinazione. Per aggirare questo problema, abbiamo rimosso la testa di Mosca, gambe, ali e gli ultimi due segmenti dell'addome per creare fori che ha permesso la miscela di fissazione entrare. Come parte del protocollo fissazione che abbiamo incluso trattamento con tetrossido di osmio (OsO4)5, che è ampiamente utilizzato per la sua capacità di fissare i grassi, compreso i trigliceridi. OsO4 conserva la maggior parte delle strutture estremamente bene, soprattutto a livello citologico e allo stesso tempo fornisce il contrasto dell'immagine. Dopo la fissazione, thoraces di Drosophila sono stati incorporati in resina per trasversale semi-sottile taglio (1,5 µm). Per migliorare il contrasto, il tessuto può essere inoltre macchiato con toluidina blu. Immagini di thoraces completo sono state scattate a 10x e area del muscolo è stato quantificato dal binarizing immagini (di uguali dimensioni) e quantificare la percentuale di pixel corrispondenti al tessuto muscolare (pixel neri) su totale, con il software ImageJ.
Le modifiche sulle miscele preparazione e la fissazione di tessuto, come l'aumento della concentrazione della soluzione4 e glutaraldeide OsO, introdotto nel presente protocollo, hanno permesso unico di conservazione del tessuto muscolare. Questo è perché il protocollo evita la degradazione e la deformazione del tessuto, rendendo l'analisi posteriore dei campioni più affidabile anche in condizioni altamente atrofiche associate a malattie degenerative neuromuscolari come la distrofia miotonica (DM). Nella sua forma più comune, DM di tipo 1, questo raro disordine genetico è causato da ripetizioni CUG ampliate in trascrizioni di chinasi di proteina di distrofia myotonic (DMPK). Mutante DMPK RNA aggrega i fuochi di ribonuclear forma che sequestrano le proteine nucleari di RNA-binding Muscleblind-come (MBNL1-3; Muscleblind (Mbl) in Drosophila)6. Abbiamo generato un modello di Drosophila della distrofia Myotonic esprimendo 250 ripetizioni CTG sotto il promotore di catena pesante della miosina muscolare (Mhc-Gal4). Modello mosche erano incapaci di volare con un fenotipo tipico 'tenuto fino ali' e muscolare grave atrofia nella loro IFMs (Figura 2B). Precedenti studi condotti nel nostro laboratorio hanno dimostrato che la determinazione dell'area muscolare di IFM è un metodo affidabile per quantificare gli effetti di diversi modificatori chimici o genetici dell'atrofia muscolare in queste mosche modello7. Ad esempio, sovraespressione di Mbl isoforma C in mosche esprimendo il CTG 250 si ripete nel muscolo, raggiunto un salvataggio di area del muscolo, come lo svuotamento di Mbl dal sequestro è il fattore scatenante nella DM1 patogenesi8 (Figura 2). Area del muscolo è stato anche salvato dopo il modello DM d'alimentazione Vola con Abp1, un esapeptide con anti-DM1 comprovata attività9 (Figura 2D).
Figura 2. Quantificazione delle sezioni dorsoventral di resina-incastonato thoraces adulto. i muscoli di volo indiretto (A-D) di Drosophila melanogaster con i genotipi pertinenti indicati. (A) controllo vola (yw). (B) espressione di 250 non codificante CTG si ripete nel muscolo (UAS-CTG(250)x) ha causato una riduzione dell'area di muscolo DLMs rispetto al controllo mosche. (C) questo fenotipo di atrofia del muscolo è stato salvato da sovraespressione di Muscleblind (MblC) (UAS-CTG (250) x UAS-MblC) e (D) alimentazione le mosche di modello con l'esapeptide Abp1 (UAS-CTG (250) x Abp1). In tutte le immagini la parte dorsale è sulla parte superiore. Transgeni sono stati guidati al muscolo utilizzando un promotore di catene pesanti della miosina (Mhc)-Gal4. (E) quantificazione della percentuale di area muscolare rispetto le mosche di controllo ha confermato che le differenze erano significative. L'istogramma mostra mezzi ± s.e.m. * *p< 0.01 e * p < 0.05 (test t dello studente). Barra della scala: 200 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Il metodo qui segnalato sarà di interesse per i ricercatori concentrandosi sullo sviluppo muscolare, manutenzione e invecchiamento, patologia di malattia e test anti-droga in quanto fornisce informazioni affidabili sulla risposta ai fattori sia endogeni che esterni tessuto muscolare.
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Protocol
1. la fissazione e l'incorporamento di resina
- Anestetizzare le mosche con anidride carbonica (CO2) o tramite l'ipotermia utilizzando un blocco di ghiaccio. Utilizzare un microscopio da dissezione (con basso ingrandimento per vedere al volo tutto) e le forbici per rimuovere le gambe, Ali, testa e la parte terminale dell'addome per facilitare la penetrazione del fissativo. Un'attenta gestione delle carcasse è necessaria in questa fase per evitare la deformazione del torace.
Nota: Iniziare con almeno 12 mosche al genotipo per assicurare un numero sufficiente di individui correttamente elaborati alla fine della procedura. - Trasferire le carcasse in una provetta da 1,5 mL su ghiaccio (ponendo un massimo di 6 individui per provetta) contenente 200 µ l di soluzione 1.
Nota: Le carcasse non possono rimanere nella soluzione 1 per più di 20 min.- Per la soluzione 1, miscelare i componenti in queste proporzioni di volume: ¼ paraformaldeide al 4%, ¼ 8% glutaraldeide, ¼ 0,2 M Na2HPO4 e ¼ 0,2 M NaH2PO4.
- Aggiungere 200 µ l di soluzione 2 e incubare in ghiaccio per 30 min.
- Soluzione 2: Soluzione Mix 1 e OsO4 in una proporzione di 1:1 (v/v).
Attenzione: OsO4 è estremamente tossico. Manipolarla in una cappa aspirante con adeguate misure di sicurezza e smaltimento.
- Soluzione 2: Soluzione Mix 1 e OsO4 in una proporzione di 1:1 (v/v).
- Rimuovere tutto il liquido. Aggiungere 200 µ l di soluzione 2 e incubare in ghiaccio per 1-2 h.
- Rimuovere la soluzione e disidratare i campioni attraverso una serie di etanolo classificati come segue: una volta in 30%, 50%, 70%, 90% e due volte in etanolo assoluto; 5 minuti ciascuno. Aggiungere 1 mL di etanolo per coprire i campioni.
Nota: Una volta che il tessuto è disposto in 90% etanolo, i passaggi successivi possono essere eseguiti a temperatura ambiente. - Incubare i campioni due volte in ossido di propilene per 10 min ciascuna incubazione.
Attenzione: L'ossido di propilene è tossico, utilizzarlo in una cappa aspirante. - Sostituire l'ossido di propilene da una miscela di 1:1 (v/v) di resina e propilene ossido di resina epossidica e incubare a temperatura ambiente per una notte.
Attenzione: La resina è estremamente tossica allo stato liquido. La resina è disponibile come un insieme di quattro componenti (A, B, C e D).- Per resina epossidica, aggiungere in un bicchiere monouso 54 g di resina (A), 44,5 g di catalizzatore (B), 2,5 g di acceleratore (C) e 10 g di plastificante (D). Combinare tutti i componenti di resina in una cappa aspirante. Conservare la resina in aliquote a-20 ° C (per fino a 6 mesi) o a-80 ° C (per diversi anni).
- Per annullare la resina, infornate a 70 ° C per 24 h perché resina solida non è tossica. Scartare tutte le soluzioni precedenti nel gruppo di metalli pesanti secondo procedure internazionali appropriate, perché le soluzioni possono contenere tracce di OsO4.
- Sostituire la miscela precedente con 100% resina e incubare i campioni per 4 h.
- Trasferire le carcasse in stampi di plastica contenente la nuova resina (una carcassa in ciascun pozzetto dello stampo). Utilizzare un bastone di legno affilata o un ago per trasferire e orientare le carcasse nei pozzetti e lasciare la resina per polimerizzare durante la notte in un forno di Pasteur a 70 ° C.
Nota: Per garantire orientamento appropriato delle carcasse per posteriore sgrossatura e il sezionamento, le carcasse devono essere sdraiato sul loro lato lungo, con la parte anteriore della carcassa molto vicino al bordo del pozzo.
2. taglio e di sezionamento dei blocchi
- Rimuovere i blocchi di resina polimerizzata dagli stampi. Utilizzare lame di rasoio per tagliare via la resina, una forma trapezoidale che circonda la carcassa e dare orientamento appropriato nel microtomo. Avviare il sezionamento di tutte le carcasse dopo la sutura trasversa per ottenere risultati comparabili.
Nota: La sezione deve essere perpendicolare all'asse anteroposteriore del DLMs a sgrossare il campione correttamente ( Figura 3).
Figura 3 . Mosche di modello dorsoventral sezioni di resina-incastonato thoraces adulto della distrofia Myotonic. In (A), l'operazione di taglio del campione non era corretta, come la sezione nella parte dorsale a destra dell'immagine non era completamente trasversale ai muscoli. Di conseguenza, i fasci tre muscolari sul lato destro superiore sembrano più grandi di quelli del lato sinistro. Questo errore si tradurrebbe in una sovrastima della zona muscolare. (B) sezione da un blocco di resina correttamente profilati. Barra della scala: 200 µm.
- Tagliare 1,5 µm sezioni spesse con un ultramicrotomo e trasferire le sezioni in gocce d'acqua su diapositive gelatinizzati.
- Ottenere le sezioni dal segmento mesotorace per tutti i campioni ottenere risultati comparabili.
- Porre i vetrini contenenti le sezioni su un blocco di riscaldamento a 70-80 ° C fino a quando l' H2O evapora. A questo punto, i campioni possono essere osservati con il contrasto di4 OsO (Figura 4A).
3. colorazione di sezioni IFM
- Coprire le sezioni con abbastanza toluidina blu per circa 30 s del blocco di riscaldamento.
- Per la soluzione di blu di toluidina, sciogliere 1% di blu di toluidina e 1% di borace in H2O.
- Sciacquare con H2O e lasciare le diapositive su un piatto caldo per far evaporare l'acqua. Ripetere la colorazione con toluidina blu se il contrasto deve essere migliorata (Figura 4B).
Figura 4 . Dorsoventral sezioni di resina-incastonato thoraces adulto con differenti di contrasto stainings. Entrambi i pannelli mostrano immagini di mosche modello DM1 alimentati con Abp1 come in Figura 2D. (A) immagine di una sezione con il contrasto di4 OsO. (B) sezione colorati con toluidina blu permette una migliore visualizzazione dei pacchi del muscolo. Barra della scala: 200 µm.
4. montaggio sezioni IFM
- Asciugare i vetrini con il blocco di riscaldamento fino a quando l' H2O evapora.
- Mettere 1 o 2 gocce di mezzo di montaggio sulle sezioni e mettere su un vetrino coprioggetti.
Attenzione: Eseguire questo passaggio in una cappa perché il mezzo di montaggio è tossico.
5. acquisizione di immagini e la quantificazione dell'area muscolare
- Prendere le immagini a basso ingrandimento in modo che l'intera serie di muscoli DLM è a fuoco. Normalmente utilizziamo 10 X.
- Per l'analisi statistica prendere almeno 5 immagini seriali per volare e analizzare almeno 5 mosche per ogni gruppo sperimentale.
- Selezionare l'immagine che contiene i muscoli interi (Figura 5A). Controllare l'asse o l'orientamento della sezione e scartare i campioni con orientamento inappropriato, che falserebbe i risultati (confrontare figure 3A / 3B per distinguere tra male e sezioni ben orientate, rispettivamente).
- Utilizzare software ImageJ per selezionare un'area (in pixel) che contiene solo la DLMs (Figura 5A/5B). Per il confronto tra differenti gruppi sperimentali, l'area di riferimento da utilizzare sarebbe sempre al volo con i muscoli più grandi. In tutte le immagini dei diversi genotipi di confrontare, selezionare un'area contenente DLMs di uguali dimensioni per l'area di riferimento (figura 5B).
- Binarize le immagini con il comando immagine-J: Processo/binario/fare binario ed eliminare le zone o i pixel che non corrispondono ai muscoli di interesse (Figura 5).
- Nel caso in cui artefactual macchie nere appaiono in zone diverse del muscolo, eliminarli con il comando strumenti di disegno e selezionare il simbolo di gomma.
Figura 5 . Procedura di analisi per la determinazione di zona del muscolo di immagine. (A) trasversale sezione del modello di distrofia miotonica tipo 1 volare torace con un rettangolo contenente il DLM. (B) area selezionata con solo i muscoli di volo indiretto e l'intestino (*). Immagine (C) Binarized. Le aree nere corrispondono ai muscoli di interesse. L'intestino è stato cancellato per una quantificazione accurata della zona muscolare. Barra della scala: 200 µm.
- Quantificare la percentuale di pixel corrispondenti al tessuto muscolare (pixel neri) su totale con il comando: Analyze/misura e selezionare l' opzione frazione di zona. Questa percentuale di area è una stima della massa muscolare DLM di ogni volo.
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Representative Results
Da quantificare se la sovraespressione di MblC o la somministrazione di Abp1 avuto alcun effetto nel fenotipo atrofico del modello fly distrofia Myotonic che ci siamo concentrati sulla DLMs, facenti parte delle IFM (Figura 1). Abbiamo determinato che il modello vola, che esprimono 250 ripetizioni CTG non codificanti in tutta la muscolatura guidato dal promotore catene pesanti della miosina (Mhc)-Gal4, ha avuto una riduzione del 50% dell'area di muscolo rispetto per controllare vola. Al contrario, co-espressione di MblC e ripetizioni CTG ampliate con lo stesso driver, fortemente soppressa tale fenotipo e crossectional muscolare zona era 70% di mosche (normale) di controllo. Amministrazione dell'esapeptide Abp1 nei mezzi nutritivi similmente ha soppresso il fenotipo atrofica e mosche di modello che avevano preso il composto ha mostrato circa il 60% della superficie del muscolo normale (invece di 50% che è tipico di DM1 mosche; Figura 2E). Per la quantificazione di questi campioni, abbiamo usato sezioni colorate con toluidina blu per migliorare il contrasto (figure 4 e 5).
Notiamo che, durante la procedura, un certo numero di difetti tecnici può interferisce in modo significativo con la quantificazione finale. Un comune è che blocchi in resina non vengono correttamente eliminati, che può misorient il campione e portare a taglio obliquo della DLMs. Di conseguenza, alcuni muscoli DLM possono sembrare più grande su un lato rispetto a quello controlaterale (Vedi ad esempio Figura 3), che introduce un errore significativo nella quantificazione finale. Un altro errore che può verificarsi è insufficiente penetrazione del fissativo nel tessuto muscolare (Figura 6), che sembra degradata e deforme, rendendo impossibile la quantificazione accurata della zona muscolare.
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Discussion
È stato dimostrato che la Drosophila melanogaster è un modello utile per studiare le malattie neuromuscolari umano7,10,11, compreso Distrofie Miotoniche, che sono caratterizzate dalla comparsa di atrofia muscolare. Il protocollo presentato qui è un utile strumento per quantificare la degenerazione muscolare causata dall'insorgenza o la progressione di una particolare malattia in un modello fly. Ad esempio, è anche possibile seguire e quantificare la degenerazione delle fibre muscolari eseguendo questa analisi in mosche di età diverse.
Ci sono passaggi critici nel protocollo. Il tempo necessario per sezionare le mosche prima della loro fissazione deve essere minimizzato per evitare la degradazione del tessuto. Per la penetrazione della soluzione fissante nei muscoli (Figura 6), è importante rimuovere la testa, ali e zampe delle mosche per garantire l'accesso delle soluzioni all'interno della Mosca. È essenziale per ottenere sezioni trasversali in cui i muscoli di interesse sono completamente visibili. La binarizzazione dei campioni per la quantificazione è fondamentale così nota che i pixel selezionati (pixel neri) corrispondono a tessuto di interesse e tutta l'area di interesse è selezionata.
Nella figura 6. Torace di Drosophila adulti con insufficiente penetrazione del fissativo nei muscoli (*), che provoca la degradazione e la deformazione del tessuto durante l'elaborazione del campione. Barra della scala: 200 µm.
Uno dei reagenti utilizzati in questo protocollo è OsO4, che conserva la maggior parte delle strutture estremamente bene, specialmente a livello citologico e allo stesso tempo fornisce il contrasto con l' immagine5. Tuttavia, uno svantaggio importante del metodo è la tossicità del OsO4, che deve sempre essere utilizzato in una cappa aspirante e richiede lo smaltimento e la manipolazione sicura. Questo protocollo non solo permette la quantificazione accurata del tessuto del muscolo dovuto la fissazione e l'incorporamento di procedura, può essere utilizzato anche per un'altra applicazione come preparazione di microscopia elettronica (EM). Tuttavia, subisce una limitazione intrinseca perché le sezioni istologiche risultante non possono essere utilizzate nelle analisi successive, ad esempio immunohistochemistry.
Infine, questo metodo è anche ottimizzato per rilevare le differenze di zona piccolo muscolo permettendo così l'identificazione affidabile dei modificatori in genetica o chimico schermi8,9. Tuttavia, poiché la zona aumentata del muscolo non implica necessariamente la funzione muscolare migliore, determinazione area della sezione trasversale del muscolo dovrebbe essere idealmente correlati con saggi funzionali come volo saggi12.
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Disclosures
Conflitti di interesse non dichiarati.
Acknowledgments
Gli autori vorrei ringraziare i membri del gruppo di genomica traslazionale e Kathryn J Hanson per il feed-back e i miglioramenti su questo protocollo. Questo progetto è stato effettuato con assegno di ricerca SAF2015-64500-R, che comprende fondi europei di sviluppo regionale, assegnato a r. a dal Ministerio de Economia y Competitividad.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Image-J software | National Institutes of Health | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Ultramicrotome | Leica | Leica UC6 | |
| Microscope | Leica | Leica MZ6 | Bright field technique. |
| Razor blades | Electron Microscopy Sciences | 71970 | Several alternative providers exist. |
| Scissors | World Precision World | 14003 | Several alternative providers exist. |
| Embedding molds | Electron Microscopy Sciences | 70900 | Several alternative providers exist. |
| Glutaraldehyde | Fluka (Sigma) | 49624 | Toxic. |
| OsO4 | Polyscience | 0972A | Extremely toxic. |
| Propylene oxide | Sigma Aldrich | 82320-250ML | Extremely toxic. |
| resin (Durcupan) | Sigma Aldrich | 44611-44614 | Carcinogenic when it is unpolymerized. |
| Toluidine blue | Panreac | 251176 | Toxic. |
| Mountant Medium (DPX) | Sigma Aldrich | 44581 | Dangerous. |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148-500G | Harmful. |
| Na2HPO4 | Panreac | 122507 | 0.2 M dilution. |
| NaH2PO4 | Panreac | 121677 | 0.2 M dilution. |
| Borax | Panreac | 3052 | Toxic. |
References
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