초파리 Melanogaster 성인 간접 비행 근육의 광 단면 근육 면적 결정

Summary

우리는 초파리 성인 근육 질량을 결정 하는 간접적인 방법 근육 영역을 측정 하는 방법을 보고 합니다. 간접 비행을 분석 하 여 우리의 방법론의 응용 근육 Myotonic 영양 질병의 초파리 모델에서 설명 합니다.

Abstract

근육 질량을 낭비 하 고, 근육 위축으로 알려진 신경 근육 학 질병의 초파리 모델에 일반적인 표현 형 이다. 우리는 파리, 특히 dorso 경도 근육 (DLM), 위축 형 다른 유전적 원인에 의해 초래 하는 측정 대상 실험으로 간접 비행 근육 (IFMs)를 사용 했습니다. 이 프로토콜에서 우리 반 얇은 단면에 대 한 비행 흉부 근육을 포함 하는 방법, 근육과 주위 조직 사이 좋은 대조를 방법 및 반자동 수집 가능한 데이터의 광학 현미경 이미지를 처리 하는 방법을 설명 하 고 분석입니다. 우리는 방법론 파이프라인의 세 가지 특정 응용 프로그램을 설명합니다. 첫째, 우리가 어떻게 방법 myotonic 영양 플라이 모델; 근육 퇴보를 계량에 적용할 수 있는 표시 둘째, 근육 단면적의 측정 홍보 하거나 근육 위축 및 근육 퇴보; 방지 유전자를 식별 하는 데 도움이 수 있습니다. 셋째,이 프로토콜 후보 화합물은 크게 질병 유발 돌연변이 의해 유도 된 주어진된 위축 한 표현 형을 수정할 수 있는지 여부를 결정에 적용할 수 있는또는 환경 방 아 쇠.

Introduction

과일 파리의 흉부 비행 근육, 기능, 생리학 및 해부학 적 구분의 두 개의 서로 다른 클래스를 포함 합니다. 이 근육은: dorso 경도 (DLM)와 (DVM) dorso-복 부 근육 (그림 1), 및 동기 비행으로 구성 된 간접 비행 근육 (IFM), 제어 근육^1,2. 이 근육은 함께 비행에 필요한 높은 기계적인 힘을 생성 합니다. 크기, 분포 및 rostro 꼬리 처리는 IFMs의 횡단 단면³ (그림 2A)에 대 한 쉬운 방향을 허용. 이러한 이유로, 우리는 이러한 근육 근육 위축 초파리 melanogaster에서 공부 하를 선택 했습니다.

그림 1입니다. 보여주는 간접적인 비행 근육 (IFMs) 배열 하는 과일 파리의 흉부의 도표. (왼쪽) 측면 보기 나타내고 (오른쪽) 가슴의 크로스 섹션을 나타냅니다. IFMs (레드)에서 Dorso 경도 (DLM) 근육의 구성 그리고 Dorso-복 부 (DVM) (녹색)에 근육.

조직 구조 및 조직학 섹션의 dorso 복 부 축 방향 제어할 보존 근육 단면적의 적절 한 평가 위해 중요 하다. 근육 구조를 유지 하기 위해 사용 하는 톰 린 슨 외 에서 수정 고정 혼합물 ⁴ . 또한, 근육 내부 조직 이기 때문에, 초파리의 외 골격의 불 침투성 혼합물 대상 조직에 침투 수 없습니다 고정으로 문제를 이다. 이 문제를 회피, 비행 머리, 다리, 날개와 고정 혼합 입력을 허용 하는 구멍을 만드는 복 부의 마지막 2 개의 세그먼트를 제거 했습니다. 우리는 오스뮴 tetroxide (OsO₄)⁵, 광범위 하 게 사용 되는 기능 지방을 수정 하는 치료를 포함 하는 고정 프로토콜의 일환으로 트리 글리세라이드를 포함 하 여. OsO₄ cytological 수준에서 특히 매우 잘 대부분의 구조를 유지 하 고 동시에 이미지에 대 한 대비를 제공 합니다. 고정, 후 초파리 thoraces 횡단 반 얇은 단면 (1.5 µ m)에 대 한 수 지에 포함 했다. 향상 된 대비에 대 한 조직의 수 또한 얼룩이 질 톨루이와 블루. 완전 한 thoraces의 이미지 10 배에서 찍은 하 고 근육 지역 binarizing (같은 크기)의 이미지와 총 ImageJ 소프트웨어와 함께 근육 조직 (검은 픽셀)에 해당 하는 픽셀의 비율을 측정 하 여 계량 했다.

OsO₄ 와 솔루션 도입이 프로토콜의 농도의 증가 조직 준비 및 고정 혼합물에 수정 허용 근육 조직의 고유 보존. 이 프로토콜 저하 및 Myotonic 영양 장애 (DM) 등 신경 근육 퇴행 성 질환과 관련 된 매우 위축 한 조건에도 더 신뢰할 수 있는 샘플의 사후 분석을 만드는 조직의 변형 방지 때문입니다. 더 일반적인 형태로 DM 타입-1,이 희귀 한 유전적 장애 myotonic 영양 단백질 키 니 아 제 (DMPK) 성적표에 확장된 CUG 반복에 대 한 가져온입니다. 돌연변이 DMPK RNA 격리 Muscleblind 같은 핵 RNA 의무적인 단백질 (MBNL1-3; 폼 ribonuclear foci 집계 초파리에서 Muscleblind (Mbl))⁶. 근육 myosin 무거운 체인 발기인 (Mhc-Gal4)에서 250 CTG 반복 표현 하 여 Myotonic 영양의 초파리 모델을 생성 했습니다. 모델 파리 전형적인 최대 개최 '날개' 형으로 날지 되었고 심각한 근육 그들의 IFMs (그림 2B)에서 쇠 약 했다. 우리 연구실에서 수행 하는 이전 연구는 IFMs의 근육 영역의 결정이 모델 파리⁷근육 위축 증의 다른 화학 또는 유전 한정자의 효과 계량 하는 신뢰할 수 있는 방법을 나타났습니다. 예를 들어, C 250 CTG를 표현 하는 파리에는 근육에 반복 하는 Mbl isoform의 overexpression 격리 하 여 Mbl 고갈 DM1 pathogenesis⁸ (그림 2C) 트리거 요인으로, 근육의 구조를 달성. Abp1, 입증 된 안티-DM1 활동⁹ (그림 2D) hexapeptide와 파리 DM 모델 먹이 후에 근육 영역 구출 되었다.

그림 2입니다. 수 지 포함 성인 thoraces의 dorsoventral 섹션 부 량이 고 (A-D) 표시 관련 genotypes 초파리 melanogaster 의 간접 비행 근육. (A) 제어 (영웅) 난다. (B) 비 코딩 CTG 250의 표정 근육에 반복 (UAS-CTG(250)x) 제어 파리에 비해 DLMs에서 근육의 감소를 발생. (C)이 근육 위축 형 Muscleblind (MblC)의 overexpression에 의해 구출 되었다 (UAS-CTG (250) UAS MblC x) 및 (D) 먹이 (UAS-CTG (250) x Abp1)에 hexapeptide Abp1와 모델의 파리. 모든 이미지에 지 면 위에. Transgenes는 Myosin 중 연쇄 발기인 (Mhc)를 사용 하 여 근육을 주도 했다-Gal4. (E) 제어 파리에 상대적으로 근육의 비율의 정량화 차이가 상당한 했다 확인 했다. 히스토그램 표시 수단 ± S.E.M. * *p< 0.01와 * p < 0.05 (Student´s t-검정). 눈금 막대: 200 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

여기 보고 방법은 근육 개발, 유지 보수 및 노화, 질병 병 리 및 마약 테스트 근육 조직 내 생 및 외부 요인에 응답 하는 방법에 대 한 신뢰할 수 있는 정보를 제공 하기 때문에 연구원에 게 관심이 될 것입니다.

Protocol

1. 고정 및 수 지 포함

1. 이산화탄소 (CO₂) 또는 저체온증 얼음 블록을 사용 하 여 통해 파리 anesthetize (전체 비행을 보고 낮은 확대)와 함께 해 현미경과가 위를 사용 하 여 다리, 날개, 머리와 복 부는 정착 액의 침투를 촉진 하기 위하여의 터미널 부분을 제거 하. 시체의 신중한 처리는 흉부의 변형 방지 하려면이 단계에서 필요 합니다.
   참고: 프로시저의 끝에서 제대로 처리 된 개인의 충분 한 숫자를 보장 하기 위해 유전자 당 최소 12 파리와 시작.
2. 솔루션 1의 얼음 (관 당 6 개인의 최대 배치) 포함 200 µ L에 1.5 mL 튜브에 시체를 전송.
   참고: 시체 20 분 이상에 대 한 솔루션 1에에서 남아 있을 수 없습니다.
   1. 솔루션 1에 대 한 혼합이 볼륨 비율 구성 요소: ¼ 4 %paraformaldehyde, ¼ 8%도, ¼ 0.2 M 나₂HPO₄ 및 ¼ 0.2 M NaH₂포₄.
3. 솔루션 2의 200 µ L을 추가 하 고 30 분 동안 얼음에 품 어.
   1. 해결 방법 2: 솔루션 1과 1:1 (v/v) 비율에 OsO₄ 혼합.
      주의: OsO₄ 매우 독성이 있다. 적절 한 안전 및 폐기 조치 증기 두건에서 그것을 조작 합니다.
4. 모든 액체를 제거 합니다. 솔루션 2의 200 µ L을 추가 하 고 1-2 h에 대 한 얼음에 품 어.
5. 솔루션을 제거 하 고 다음과 같이 등급된 에탄올 시리즈를 통해 샘플을 탈수: 한 번에 30%, 50%, 70%, 90%, 그리고 두 번에 절대 에타 놀; 5 분 각입니다. 샘플을 커버 하는 에탄올의 1 mL를 추가 합니다.
   참고: 지금까지 조직 90% 에탄올에 배치 되 면에 후속 단계에서 수행할 수 있습니다.
6. 각 인큐베이션 10 분에 대 한 프로필 렌 산화물에 두 번 샘플을 품 어.
   주의: 프로필 렌 산화물 독성, 증기 두건에서 그것을 사용 하 여.
7. 1:1 (v/v) 혼합 에폭시 수 지 및 프로필 렌 산화물의 프로필 렌 산화물을 대체 하 고 하룻밤 실 온에서 품 어.
   주의: 수 지는 액체 상태에서 매우 독성이 있다. 수 지는 4 개의 구성 요소 (A, B, C, D)의 집합으로 사용할 수 있습니다.
   1. 에폭시 수 지에 대 한 추가 일회용 비 커의 수 지 (A), 경화제의 44.5 g 54 g (B), 가속기의 (C)와 가소제의 10 g 2.5 g (D). 증기 두건에 모든 수 지 구성 요소를 결합 합니다. Aliquots (최대 6 개월) 동안-20 ° C 또는-80 ° C에서 (몇 년)에 수 지를 저장 합니다.
   2. 수 지 폐기, 구워 그것 24 h 70 ° C에서 고체 수 지는 독성이 있기 때문에. 솔루션 OsO의 흔적을 포함 될 수 있으므로 적절 한 국제 절차에 따라 중 금속 그룹에 모든 이전 솔루션을 삭제_4.
8. 100% 수 지, 이전 혼합물을 장착 하 고 4 h에 대 한 샘플을 품 어.
9. 새로운 수 지 (금형의 각 우물에서 한 시체)를 포함 하는 플라스틱 금형에 시체를 전송. 날카롭게 나무 막대기 또는 바늘을 전송 하 고 우물에 시체를 방향을 두고 하룻밤 70 ° c.에 파스퇴르 오븐에 유해를 수 지 사용
   참고: 후부 트리밍 및 단면 시체의 적절 한 방향을 위해 시체 해야 거짓말 그들의 긴 측에 우물의 가장자리 가까이 매우 시체의 앞쪽 부분.

2. 정돈 하 고 블록의 단면

1. 금형에서 생산 수 지 블록을 제거 합니다. 면도날을 사용 하 여 수 지를 떨어져 트림 하 고 시체를 둘러싼 사다리꼴 모양을 형성 하 고는 톰에 적절 한 방향 제공. 비교 결과 얻으려면 가로 봉합 후 모든 시체를 단면 시작 합니다.
   참고: 섹션은 샘플을 제대로 트림 DLMs의 anteroposterior 축에 수직 해야 합니다. ( 그림 3).

그림 3 . Myotonic 영양 장애의 수 지 포함 성인 thoraces의 dorsoventral 섹션 모델 파리. (A), 샘플의 트리밍 섹션 이미지의 오른쪽 지 느 러 미 부분에는 근육을 완전히 횡단 잘못 되었습니다. 결과적으로, 오른쪽 상단에 3 개의 근육 뭉치는 왼쪽의 것 들 보다 더 큰 것. 이 실수 근육 영역의 귀 착될 것 이다. (B)는 제대로 트림된 수 지 블록에서 섹션. 눈금 막대: 200 µ m.

1. 1.5 µ m는 ultramicrotome 두꺼운 섹션 잘라내어 gelatinized 슬라이드 위에 물 방울으로 섹션을 전송.
   1. 비교 결과 얻기 위해 모든 샘플 mesothorax 세그먼트에서 섹션을 가져옵니다.
2. H₂O 증발 될 때까지 70-80 ° C에가 열 블록에 대 한 섹션을 포함 하는 슬라이드를 놓습니다. 이 시점에서, 샘플 OsO₄ 대조 (그림 4A)와 함께 관찰할 수 있습니다.

3. 얼룩 IFM 섹션

1. 충분 한 톨루이 약 30 블루와 섹션 커버 열 블록에 s.
   1. 톨루이 블루 솔루션에 대 한 해산 톨루이 블루의 1%와 1% 붕 사 H₂o.
2. H₂O 헹 구 고 물을 증발 하는 따뜻한 접시에 슬라이드를 두고. 반복 하는 얼룩 톨루이와 블루 대비 해야 하는 경우 향상 된 (그림 4B).

그림 4 . 다른 대비 stainings와 수 지 포함 성인 thoraces의 dorsoventral 섹션. 두 패널 그림 2D로 Abp1를 품고 DM1 모델의 이미지를 표시 합니다. (A) 섹션 OsO₄ 대조의 이미지. (B) 섹션 톨루이 블루 물 근육 번들의 더 나은 시각화 수 있습니다. 눈금 막대: 200 µ m.

4. 장착 IFM 섹션

1. H₂O 증발 될 때까지 난방 블록 슬라이드를 건조.
2. 섹션에 장착 매체의 1 또는 2 방울을 넣고는 coverslip에 넣어.
   주의: 설치 매체는 독성 때문에 증기 두건에서이 단계를 실시 합니다.

5. 이미지와 근육의 부 량 인수

1. DLM 근육의 전체 세트 초점에 되도록 낮은 확대에서 이미지를 받아. 우리는 일반적으로 10 배를 사용합니다.
   1. 통계 분석에 대 한 비행 당 적어도 5 직렬 이미지 하 고 분석 하는 실험 그룹 당 적어도 5 파리.
2. 전체 근육 (그림 5A)를 포함 하는 이미지를 선택 합니다. 축 또는 섹션의 방향을 확인 하 고 결과 왜곡할 것 이다 부적 절 한 방향으로 샘플을 삭제 (비교 그림 3A / 3B 심하게 구분 하 고 잘 지향된 섹션, 각각).
3. ImageJ 소프트웨어를 사용 하 여 선택 영역 (픽셀) DLMs (그림 5A/5B)를 포함 하. 다른 실험적인 그룹 간의 비교에 대 한 참조 영역을 사용할 수 항상 큰 근육과 비행 것입니다. 비교할 다른 genotypes의 모든 이미지에 DLMs 동일한 치수 참조 영역 (그림 5B)를의 포함 하는 영역을 선택 합니다.
4. 이미지-J 명령으로 이미지를 binarize: 프로세스/이진/확인 이진 분야 또는 관심 (그림 5C)의 근육에 일치 하지 않는 픽셀 삭제.
   1. Artefactual 검은 반점 근육 이외의 지역에 나타나는 경우, 명령 그리기 도구 와 그들을 삭제 하 고 지우개 기호를 선택 합니다.

그림 5 . 근육 지역 결정을 위한 분석 절차 이미지. (A) 횡단 부분의 Myotonic 영양 장애 유형 1 모델은 DLM을 포함 하는 사각형으로 흉부 비행. (만 간접 비행 근육과 내장 (*)와 B) 선택 된 영역입니다. (C) Binarized 이미지입니다. 검정 영역은 관심의 근육에 해당합니다. 소장이 근육의 정확한 정량화에 대 한 삭제 되었습니다. 눈금 막대: 200 µ m.

5. 근육 조직 (검은 픽셀) 명령으로 총 중에 해당 하는 픽셀의 비율 계량: 분석/측정 및 선택 옵션 영역 분수. 지역의이 비율은 각의 DLM 근육 질량의 추정 이다.

Representative Results

척도 MblC의 overexpression 또는 Abp1의 관리 Myotonic 영양 비행 모델의 위축 형에 어떤 영향을 미쳤다 여부를 우리가 IFMs (그림 1)의 일부인 DLMs에 집중 했다. 우리는 모델 파리는 Myosin 중 연쇄 발기인 (Mhc)에 의해 구동 하는 근육에 걸쳐 250 비 코딩 CTG 반복 표현 결정-Gal4, 파리 제어에 비해 근육의 50% 감소 했다. 반면, 동일한 드라이버 MblC 및 확장 된 CTG 반복의 공동 식 강력 하 게 억제 같은 표현 형 그리고 crossectional 근육 지역 제어 (일반)의 70%를 했다. 영양 미디어에서 Abp1 hexapeptide의 관리는 마찬가지로 위축 형, 그리고 화합물 DM1 파리;의 전형 50% (대신 정상적인 근육의 대략 60%를 보여준 찍은 모델 파리 억제 그림 2E)입니다. 이 샘플의 정량화, 톨루이 (그림 4 및 5) 대비 향상 파란색 물 섹션 사용 했습니다.

우리는 절차 동안 다양 한 기술적인 고장이 크게 방해할 수 최종 정량화 주의. 일반적인 것은 그 수 지 블록 되지 올바르게 잘립니다, 샘플 misorient 고 경사는 DLMs의 단면으로 이어질 수 있습니다. 결과적으로, 일부 DLM 근육 contralateral 하나에 비해 1 개의 측에 더 큰 보일 수 있습니다 (예를 들어 그림 3참조)는 최종 정량화에 상당한 오류를 소개. 발생할 수 있는 또 다른 실수는 저하 고 변형 근육 영역의 정확한 정량화 불가능해 보이는 근육 조직 (그림 6)에 정착 액의 부적당 한 침투.

Discussion

초파리 melanogaster 인간의 신경 근육 학 질병^7,,1011, Myotonic Dystrophies의 모양으로 특징을 포함 하 여 연구에 유용한 모델 임을 입증 되었습니다. 근육 위축입니다. 여기에 제시 된 프로토콜 발병 또는 플라이 모델에서 특정 질병의 진행으로 인 한 근육 퇴보를 측정을 위한 유용한 도구입니다. 예를 들어 따라 다양 한 연령대의 파리에서이 분석을 수행 하 여 근육 섬유의 변성을 계량 하 이기도 합니다.

프로토콜에 중요 한 단계가 있습니다. 그들의 고정 하기 전에 파리를 해 부 하는 데 필요한 시간이 조직의 저하를 방지를 최소화 시켜야 한다. (그림 6) 근육에서 통 솔루션의 침투에 대 한 제거 머리, 날개, 다리의 내부에 솔루션에 대 한 액세스를 보장 하기 위해 파리의 중요 하다. 횡단 섹션 있는 관심의 근육이 완전히 볼 수를 얻기 위해 필수적 이다. 정량화에 대 한 샘플의 이진화 참고 선택한 픽셀 (검은 픽셀)의 조직 그리고 관심의 모든 영역에 해당 선택은 그래서 중요 하다.

그림 6. 저하 고는 샘플의 처리 하는 동안 조직의 변형 원인이 근육 (*)에서 정착 액의 부적당 한 침투와 성인 초파리 가슴. 눈금 막대: 200 µ m.

이 프로토콜에 사용 된 시 약 중 하나는 OsO₄, cytological 수준 특히, 대부분의 구조를 매우 잘 유지 하 고 동시에 이미지⁵대조를 제공 합니다. 그러나, 방법의 중요 한 결점은 OsO₄, 항상 증기 두건에서 사용 해야 하며 안전한 취급 및 폐기는 독성. 이 프로토콜 뿐만 아니라 담합 및 절차를 포함 근육 조직의 정확한 정량화를 허용, 그것은 또한 전자 현미경 (EM) 준비 같은 다른 응용 프로그램에 사용할 수 있습니다. 그러나, 그것은 결과 조직학 섹션 immunohistochemistry 등 후속 분석 실험에 사용할 수 없습니다 때문에 본질적인 한계를 겪고 있다.

마지막으로,이 메서드는 또한 유전자에 한정자의 신뢰할 수 있는 식별 되므로 작은 근육 지역 차이 감지 하 최적화 또는 화학 스크린^8,9. 그럼에도 불구 하 고, 증가 근육 지역 더 나은 근육 기능을 반드시 의미 하지는 않습니다, 이후 근육 횡단면 지역 결정 해야 될 이상적으로 상관 기능 분석 실험 비행¹²분석 실험과 같은.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Image-J software	National Institutes of Health		https://imagej.nih.gov/ij/
Ultramicrotome	Leica	Leica UC6
Microscope	Leica	Leica MZ6	Bright field technique.
Razor blades	Electron Microscopy Sciences	71970	Several alternative providers exist.
Scissors	World Precision World	14003	Several alternative providers exist.
Embedding molds	Electron Microscopy Sciences	70900	Several alternative providers exist.
Glutaraldehyde	Fluka (Sigma)	49624	Toxic.
OsO4	Polyscience	0972A	Extremely toxic.
Propylene oxide	Sigma Aldrich	82320-250ML	Extremely toxic.
resin (Durcupan)	Sigma Aldrich	44611-44614	Carcinogenic when it is unpolymerized.
Toluidine blue	Panreac	251176	Toxic.
Mountant Medium (DPX)	Sigma Aldrich	44581	Dangerous.
Paraformaldehyde	Sigma Aldrich	P6148-500G	Harmful.
Na2HPO4	Panreac	122507	0.2 M dilution.
NaH2PO4	Panreac	121677	0.2 M dilution.
Borax	Panreac	3052	Toxic.