Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Regenerering av plassert gull Microelectrodes utstyrt for en sanntid celle Analyzer

Published: March 12, 2018 doi: 10.3791/56250
Automatic Translation
*1, *1, 2, 3, 3, 1, 4
1School of Public Health, Nanjing Medical University, 2School of Pharmacy, Nanjing Medical University, 3State Key Laboratory of Materials-Oriented Chemical Engineering, College of Chemistry and Chemical Engineering, Nanjing Tech University, 4Department of Medical Oncology, Jiangsu Cancer Hospital, Jiangsu Institute of Cancer Research, The Affiliated Cancer Hospital of Nanjing Medical University
* These authors contributed equally

Summary

Denne protokollen beskriver en generell strategi for å regenerere kommersielle plassert gull microelectrodes utstyrt for en etikett-fri celle analysator å spare på høy løpende kostnader ofmicrochip-baserte analyser. Gjenfødelse prosessen inkluderer trypsin fordøyelsen, skylling med etanol og vann og en spinnende trinn, som gjør at gjentatt bruk av microchips.

Abstract

Etikett-fri cellebasert analysen er fordelaktig for biokjemiske studien fordi det ikke krever bruk av forsøksdyr. På grunn av sin evne til å gi mer dynamisk informasjon om cellene under fysiologiske forhold enn klassisk biokjemiske analyser, tiltrekker denne etiketten-gratis sanntid celle analysen basert på elektrisk impedans mer oppmerksomhet i løpet av siste tiår. Dens praktisk utnyttelse kan imidlertid være begrenset på grunn av relativt dyre kostnadene for måling, der dyre forbruksvarer disponible gull microchips brukes for den celle analysatoren. I denne protokollen, har vi utviklet en generelle strategi for å regenerere plassert gull microelectrodes utstyrt for en kommersiell etikett-fri celle analysator. Trypsin fordøyelsen, skylling med etanol og vann og en spinnende trinn omfatter prosessen med gjenfødelse. Den foreslåtte metoden er testet og vist seg å være effektive for regenerasjon og gjentatt bruk av kommersielle elektronisk plater minst tre ganger, som vil hjelpe forskere lagre på den høye kjørende kostnaden på sanntid celle analyser.

Introduction

På grunn av sin effektive og mindre arbeidskrevende eksperimentelle prosessen, etikett-fri cellen-basert teknologi har vært vitne til rask vekst det siste tiåret for analytisk samt sortering formål som i aspektet av Proteomikk1,2 , stoffet levering3, etc.4,5 forhold med tradisjonelle biokjemiske metoder rettet mot celle analyse, etikett-gratis sanntid celle analysen med prototypen utviklet av Giaever og kolleger tidligere6 er basert på prinsippet om innspillingen elektrisk signal endringer på overflaten av celle-vedlagt microchips, som tillater en kontinuerlig måling av cellevekst eller migrering i en kvantitativ måte. Etter denne strategien, en sanntids celle elektronisk sensing (RT-CES) systemet bruker elektrisk impedans-basert oppdagelsen prinsippet var introdusert7,8 , og mer nylig en kommersiell sanntid celle analyzer (RTCA) ble lansert for laboratorium forskning9.

De kommersielle sanntid celle analyserer hovedsakelig leser ut cellene vakte signaler av elektrisk impedans, som følge av fysiologiske endringer inkubert celleområde inkludert celle spredning, migrasjon, levedyktighet, morfologi og etterlevelse på den overflaten av microchips10,11. Slike elektriske signaler konverteres ytterligere av analyseringen til en dimensjonsløs parameter kalt celle indeks (CI) å vurdere celle status. Endring av impedans på microchips gjenspeiler hovedsakelig ioniske lokalmiljøet dekket celler på elektroden/løsning grensesnittet. Derfor stoler analytisk ytelsen av cellen analysator tungt på kjernen sensing enheten, de disponible microchips (dvs., såkalte elektronisk plater, f.eks, 96/16/8-vel), som er laget av plassert gull microelectrodes lithographically skrives ut nederst på inkubasjon brønner. De gull microelectrodes sammen i en sirkel-on-line format (figur 1) og dekker det meste av arealet av inkubering, som tillater dynamisk og følsom deteksjon av tilknyttede celler3,12,13 ,14. CI vil øke hvis flere dekning av celler på chip, og redusere når celler er utsatt for et toxicant som resulterer i apoptose. Selv om sanntid celle analysatoren er ofte brukt til å bestemme cytotoksisitet11 og nevrotoksisitet15 og gi kinetic mer enn klassisk endepunktene metoden, er disponibel elektronisk platene det costliest Forbruksvare.

Til nå, har det ikke vært noen metoder for fornyelse av den elektroniske platen, som er trolig på grunn av at harde gjenfødelse forhold, som piranha løsning eller eddiksyre er involvert16,17, 18, som kan endre elektrisk status for gull microchips. En mild og effektiv metode for å fjerne tilhenger cellene og andre stoffer fra overflaten av gull chips vil derfor være ønskelig for elektronisk plate gjenfødelse prosessen. Vi har nylig utviklet en protokoll rettet mot fornyelse av disponibel elektronisk plater ved hjelp av ikke-korroderende reagenser og gjenskapte chips var preget av elektrokjemiske samt optiske metoder19. Ved hjelp av lett tilgjengelige og moderat laboratorium reagenser inkludert trypsin og etanol, har vi etablert en generell metode for å regenerere den kommersielle elektroniske platen uten bivirkninger, som er brukt til å regenerere de to hovedtypene elektronisk plate (16 og L8) brukes for RTCA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Merk: vanligvis gjenfødelse prosessen inkluderer trypsin fordøyelsen og skyllingsprosess trinn med etanol og vann. Fordøyelsen tiden endres av antall celler som brukes, og type og antall celler brukes kan variere avhengig av de eksperimentelle formålene. Det anbefales å sjekke de gjenfødte microchips bruker optisk og elektrokjemiske metoder for å optimalisere gjenfødelse betingelsene. Under eksperimentet løselig og uløselig kjemikalier kan være involvert, og her disse to typiske tilfeller av gjenfødelse prosedyrer er detaljert.

1. forberedelse av gjenfødelse løsninger

Merk: Forberede og håndtere alle løsningene under sterile forhold.

  1. Forberede frisk 0,25% (g/v) trypsin løsning. Trypsin kan kjøpt eller nylagde som følger.
    1. Oppløse 0,25 g av trypsin i 100 mL pH 7.4 fosfat-bufret saltoppløsning (PBS).
    2. Rør løsningen til trypsin er fullstendig oppløst ved 4 oC. rør løsningen ved lav hastighet ta vare for å unngå noen boble dannes.
    3. Filtrere løsningen med filtere 0.22 µm i biosikkerhet panseret.
  2. Forberede 75% etanol ved hjelp absolutt etanol. Hell 75 mL absolutt etanol i en volumetriske kolbe og legge deionisert vann til volumet når 100 mL. Utføre ytterligere sterilisering om nødvendig.

2. inkubasjon og spredning av A549 celler i elektronisk plater

Merk: Elektronisk plate typer 16 og L8 er begge laget av plassert gull microelectrodes lithographically skrives ut nederst på inkubasjon brønner. Elektronisk plate 16 har 16 brønner mens elektronisk plate L8 har 8 brønner. Brønnene elektronisk plate 16 er rundt mens brønnene elektronisk plate L8 avrundede rektangler. Volumet av hver elektronisk plate 8 er også om 830 µL hver elektronisk plate 16 er vel ca 270 µL.

  1. A549 cellekultur
    1. Kultur A549 celler i Roswell Park Memorial Institute-1640 medium (RPMI-1640) med 10% fosterets bovin serum (FBS) og 1% Penicillin-streptomycin i cellekultur parabol.
    2. Passasje cellene når cellen tetthet når ~ 75% og vaske tilhenger celle laget med 1 × PBS og trypsinize med 0,25% trypsin løsning 1 min på 37 oC. sentrifuge cellene på 179 × g i 5 min fjerne trypsin. Resuspend cellene i 10 mL medium for videre kultur eller andre eksperimenter.
      Merk: Løsning av celler resuspended i medium angis her som cellen suspensjon bufferen.
    3. Ta ut 10 µL og beregne cellen ved hjelp av en hemocytometer. Bruk RPMI-1640 medium å ytterligere fortynne celle suspensjon bufferen for å forberede 30.000-80000 celler/mL celle suspensjon buffer eksperimenter.
  2. Spredning/cytotoksisitet eksperiment og datafangst
    1. Legge til 50 µL (150 µL for elektronisk tallerken L8) cellen medium hver inkubering også av den elektroniske plate 16 og la det i 30 min i fravær av smittefarlige stoffer hette for balanse. Sette inn elektronisk platen 16 manuelt i sanntid celle analyzer i CO2 inkubator på 37 oC.
    2. Starte programmet sanntid celle analyzer operasjon på datamaskinen. På standard eksperimentere mønster konfigurasjonssiden, velg "Eksperiment modell" og navn kjører analysen.
    3. Velg tilsvarende brønnene som er inkludert i eksperimentet og angi informasjonen som celle type, nummer og narkotika navn i redigeringsboksene på sin oppsett-siden. I sin tidsplan side, legge til eksperimentelle trinnene og deretter kjøretiden (f.eks 12, 24 eller 48 h) av hvert trinn og intervall av sanntidsdata oppkjøpet.
      Merk: Her tidsintervallet trinn 1 og 2 er 1 minutt og 15 minutter etterpå.
    4. Lagre filen og klikk "Start" for å måle bakgrunn impedans på media på sin celle indeksside; Resultatdataene trekkes automatisk. På en godt graf side, kan alle godt kurver besøkes. Legg brønner og grafen til tid-celle indeksen vil bli vist på siden dens Plot.
    5. Hvis celle spredning eksperimentet, først Klikk på "Pause"-knappen for å stanse programmet. Så ta ut elektronisk platen og legge 100 µL A549 celle suspensjon buffer per brønn ved romtemperatur. La platen i 30 min i biosikkerhet panseret la cellene bosette til bunnen av inkubasjon.
    6. Sette inn elektronisk platen manuelt i sanntid celle analyzer stasjonen. Klikk "Start" for å fortsette eksperimentet.
      Merk: På siden tomten analysatoren registrerer kontinuerlig celle indeksverdier eller kurver gjennom hele eksperimentet.
    7. Når eksperimentet er fullført, gå inn på Plot-siden og åpne filen eksperiment. Velg alle testet inkubasjon brønnene og resulterende celle indeks kurver som kan gjennomsnitt eller normalisert for siste gang før du legger til legemidler eller endrer medium for å redusere variasjoner mellom analyser. EC50 eller IC50 kan beregnes ut på siden dataanalyse

3. regenerering av elektroniske plater

Merk: For hvert skyllingsprosess trinn løsningen i elektronisk platen ble blandet grundig (5 - 10 ganger) bruker en pipette.

  1. Tilfelle 1: For cytotoksisitet evaluering av anti -kreft narkotika
    1. Frø A549 celler i elektronisk platen som beskrevet i § 2.
    2. Oppløse anti-kreft stoffet doksorubicin hydroklorid (DOX) i celle medium først. Sakte legge DOX til cellene (siste konsentrasjon av DOX er 30 µg/mL) bruker en pipette. Registrere CI som beskrevet i del 2.
      Merk: Elektronisk platen brukes ble regenerert umiddelbart etter eksperimentet var ferdig. I dette tilfellet, som DOX er et vannløselig kjemisk, fornyelse av elektroniske plate følger protokollen er relativt enkel å håndtere og ingen flere trinn er nødvendig.
    3. Gjenfødelse
      1. Ta ut elektronisk platen inneholder celler fra sanntid celle analyzer stasjonen. Sett brukt elektronisk platen i sterilt biosikkerhet hette i romtemperatur og bland kultur medium grundig med en pipette. Pipetter ut alle medium.
      2. Skyll elektronisk platene med 200 µL vaskebuffer vann for 3 timene ved romtemperatur.
      3. Fordøye de gjenværende cellene på elektronisk plater med 0,25% nylagde trypsin 1-2 h (200 µL/vel) i en inkubator på 37 oC. Når fordøyelsen er fullført, bland inkubasjon løsningen 5 - 10 ganger bruker en pipette og pipette alle løsningen i biosikkerhet panseret ved romtemperatur.
      4. Skyll elektronisk platene med 200 µL etanol og 200 µL vann, henholdsvis, som følger: deionisert vann 2 ganger, 100% etanol 2 ganger; 75% etanol 2 ganger; vaskebuffer vann 2 ganger. Invertere elektronisk plate et sterilt gasbind eller papir Dekanter det samme vannet ved romtemperatur.
      5. Ultrafiolett sterilisere Spartments elektronisk platen i 1-2 h i biosikkerhet panseret ved romtemperatur.
        Merk: Doble volumet av alle løsninger for fornyelse av elektroniske plate L8.
  2. Tilfelle 2: narkotika-leveranser med mesoporous materiale.
    1. Bruke stang-lignende mesoporous silica materialer med en gjennomsnittlig porestørrelse av 5.6 nm som stoffet levering matriser, som tidligere rapporterte20.
      Merk: Her, elektronisk plate var ansatt overvåke narkotika-release effekten på celler.
      1. Legge til mesoporous materialer i inkubasjon løsning av hver brønn av elektroniske platene. Som silica materialer ikke er løselig og bunnfall i elektronisk plate, skyll platen som følger:
    2. Utføre trinn 3.1.3.1-3.1.3.3 som for eksempel 1.
    3. Skyll microchips med 200 µL vaskebuffer vann en gang i biosikkerhet panseret ved romtemperatur.
    4. Skyll microchips med 200 µL absolutt etanol 2 ganger ved romtemperatur.
    5. Skyll microchips med 200 µL 75% etanol når ved romtemperatur.
    6. Legge til 250 µL av 75% etanol i hver brønn og forsegle elektronisk platen med tetting filmen ved romtemperatur.
    7. Spinn 114 x g i 2 minutter og tømme elektronisk platen. Invertere elektronisk plate et sterilt gasbind eller papir Dekanter det samme vannet ved romtemperatur.
    8. Gjenta trinn 3.2.5-3.2.7 en gang.
    9. Ultrafiolett sterilisere Spartments elektronisk platen i 1-2 h i biosikkerhet panseret ved romtemperatur.
      Merk: Doble volumet av alle løsning når skyll L8 elektronisk plater.

4. vurdering av gjenfødelse effekt

  1. Optiske kjennetegn av gjenfødte elektronisk tallerken overflate
    1. Bruk en stål skjeen å nøye demontere den nederste delen av inkubasjon bra av friske og regenerert elektronisk plate som inneholder plassert gull microelectrodes. Iført en plast hanske, nøye tørke ut den mikrobrikke inneholder delen fra elektroniske plate med stål skjeen.
    2. Plasser begge deler i sentrum av objektglass glass og samle de resulterende Raman spektra av Raman mikroskop utstyrt med CCD detektor21.
      Merk: Spectrometer var utstyrt med en 633 nm laser og til spectra ble innspilt i et intervall på 30 s laser eksponering på en bølgelengde mellom 500-3500 cm-1. Optisk bildene ble oppnådd ved Raman mikroskop ved hjelp av en 10 x eye linse og 50 x mål. Figur 1A og figur 1 c ble også innhentet med installerte Raman mikroskop apparatet.
    3. For å evaluere levedyktigheten til tilknyttede cellene etter kreft stoff opptak på frisk og gjenskapte laser elektronisk plater, bruk en AC confocal skanning mikroskop for å overvåke den spontane fluorescensen DOX molekyler absorberes av A549.
      1. For å registrere den spontane fluorescensen av absorbert DOX ved celler (frisk og gjenskapte elektronisk plater med A549 celler), bruk olje en 63 X objektive og 485 nm som eksitasjon bølgelengde.
  2. Elektrokjemiske atferd av gjenfødte elektroder
    Merk: Manuell dissembling av en kommersiell elektronisk plate er vanskelig og ikke ideelt for vurdering av overflaten elektrisk status som sjekket, gjenfødelse effektiviteten av protokollen ble vurdert ved hjelp av vanlig gull/glassaktig karbon elektrode (GCE) som en test plattform, som elektrokjemiske impedans spektroskopi (EIS) ble utført. Diameter på både Au elektroden og GCE er 3 mm. elektrokjemiske data ble innhentet av en elektrokjemisk analyserer med en tre-elektrode og impedans målinger ble utført med en vekselstrøm (AC) signaler fra 10 mV amplituden på en bredt frekvensområde 100 kHz til 0,01 Hz.
    1. Før måling, polsk Au elektroden og GCE til en speilblanke overflate med en alumina slurry polering klut, etterfulgt av sonication i vann for å fjerne partikler.
    2. Aktivere Au elektroden i H 0,5 M2så4. Hente EIS data bare Au elektrode og GCE i 10 mM KCl electrolyte løsning som inneholder 1mM K3[Fe(CN)6] som beskrevet22.
    3. Klargjør lager A549 cell løsningen 2.1.2 og 2.1.3. Slippe 10 µL celle suspensjon på overflaten av Au elektroden og GCE. Inkuber Au elektrode og GCE endret med celler i en 37 oC inkubator for 3 h. få EIS data Au elektroden og GCE endret med celler i 10 mM KCl electrolyte løsning som inneholder 1 mM K3[Fe(CN)6].
    4. Generere elektrodene bruker protokollen og måle EIS.
      1. Fordype Au elektroden og GCE endret med celler i 0.25% trypsin 0,5-2 h. skyll Au elektroden og GCE sakte med vann 4 ganger. Skyll elektrodene sakte med absolutt etanol 4 ganger. Immerge Au elektrode og GCE i 75% etanol for ~ 5 min. skyll chips sakte med 75% etanol 4 ganger.
      2. Hente EIS data Spartments Au elektrode og GCE i 10 mM KCl electrolyte løsning som inneholder 1mM K3[Fe(CN)6].

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Overflateegenskaper av gull microchips: gjenfødelse prosedyrer brukes i denne protokollen ble skissert i figur 1. Figur 2 viser den mikroskopiske overflaten bilder av friske og regenerert elektronisk plater av optisk mikroskopet. Som vist i figur 2A og figur 2C, mikroskopiske observasjoner indikerte at det var nesten ingen forskjell i den optiske egenskapene av microchip overflaten mellom frisk og behandlet elektronisk plater. Bruker den spontane fluorescensen doksorubicin molekyler inkludert i cellene praktisk for vurdering av cellen status, observerte vi en lignende homogenitet kulturperler celleområde i gull microchips etter fornyelse (figur 2B og figur 2D ). I tillegg vises inkubert kreftcellene en veldefinert mobilnettet morfologi i elektronisk platen demonstrere reusability sjetonger. Figur 3 viser Raman spektra av frisk og gjenskapte elektronisk plater. Nesten identisk Raman peak distribusjonen mellom frisk og behandlet elektronisk platene indikerte en vellykket gjenoppbyggingsprosessen av gull microchip overflaten. Raman signaler om elektronisk plater dekket med A549 celler ble forvrengt i noen grad, sannsynligvis på grunn av forstyrrelser fra den spontane fluorescensen A549 celler.

Regenerert mikrobrikker for cytotoksisitet analysen bruker RTCA: Vi har også brukt gjenfødelse protokollen for en test av celle spredning og materiale cytotoksisitet evaluering (Figur 4). A549 celler av optimal var frø på Spartments elektronisk platen 16 og vekst kinetic kurver ble registrert av sanntids celle analyzer. Som vist i figur 4A, alle de resulterende vekst kurvene av parallelle eksperimentelle viste tilstrekkelig konsistens, noe som indikerte at overflaten elektrisk status for elektronisk plate 16 beholdes sterkt etter fornyelse. Spartments elektronisk platen L8 ble også testet for cytotoksisitet bruker mesoporous silica materialer, som vist i figur 4B. Sammenlignet med kontrollen eksperimentet, CI av mesoporous materialer behandlet prøver ned i noen grad, som angir en liten cytotoksisitet materiale. Videre innkapsling og utgivelsen av anti-kreft stoffet av Dox av mesoporous materialer forårsaket en dramatisk nedgang i vekstkurve av A549. Disse eksperimentelle resultatene viste konsistens med bruke fersk elektronisk plater og tidligere rapportert arbeid19, som bekreftet effektiviteten av denne foreslåtte gjenfødelse protokollen.

Gjenfødelse effektivitet vurdert av elektrokjemiske metoder: Kommersielle Au elektroder og glassaktig karbon elektroder ble brukt som test plattformer for vurdering av gjenfødelse effektivitet. Figur 5 viser EIS av Au elektroder og GCE som ble endret kreftceller. Ble det vist at etter inkubasjon av A549 celler på elektroden, ble en tydelig økning av elektron overføring motstand (Ret) observert forhold til nakne elektroder. Ret var sunket betraktelig etter Au elektroden og GCE ble behandlet i henhold til protokollen i figur 5. Lignende endringene Ret av både Au elektroden og GCE indikerte en effektiv og universelle gjenoppbyggingsprosessen av microchips om overflaten elektriske egenskaper.

Figure 1
Figur 1: gjenoppbyggingsprosessen elektronisk plater. I en typisk gjenfødelse kjøre, var fire hovedtrinn involvert inkludert rugende tillegg deres avdelingen på overflaten av elektroniske plater fulgt av skylling, spinning og ultrafiolett sterilisering trinnene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: overflate egenskaper for elektronisk plater. (A) nye elektroniske plater (B) A549 celler var belagt på A. (C) Regenerated elektronisk plater (D) A549 celler var belagt på C. Hvis celler festet på gull microchips, ble DOX brukt. Figur 2A og figur 2C har blitt endret fra Xu, Z. et al. 19 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Raman spektra av ulike behandlet elektronisk plater. (A) nye elektroniske platen. (B) nye elektroniske platen seeded med A549 celler. (C) regenerert elektronisk plate. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: A549 celle vekst kurver på tre-tiden Spartments elektronisk tallerkener. (A) parallelle vekst kurver celleområde seeded på elektronisk plate 16. (B) cytotoksisitet test av mesoporous silica materialer på elektronisk plate L8 med feilfelt (standardavvik, STD) av innspilte kurver med hver inkubering godt. Figur 4A har blitt endret fra Xu, Z. et al. 19 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: Elektrokjemiske impedans spektra av ulike endret gull elektroder og glassaktig karbon elektroder (GCE) i 10 mM KCl electrolyte løsning som inneholder 1 mM K3[Fe(CN)6]. (A) ulike behandlet Au elektroder. (B) ulike behandlet GCE. Figur 5A er modifisert fromXu, Z. et al. 19 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Chip program Gjenfødelse buffer Gjenfødelse strategi
Overflaten plasmon resonans (SPR) Piranha løsning (konsentrert H2så4/30% H2O2 = 3:1, v/v)17 fjerne både analytt og sonde basert på sterk oksidering
Piezoelektriske Microcantilever sensorer (PEMS) Glycine-HCl blanding23,24 dissociate mål-sonden komplekset og fjerne analytt
Høye salt konsentrasjoner løsning (2M MgCl2 + 1,5 M Tris)25
Gullet film 50mM KOH + 25% H2O226 Oksidert organiske

Tabell 1: En kort oppsummering av rapporterte gjenfødelse strategier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi oppsummert flere tilgjengelige metodene17,23,24,25,26 for regenererende microchips i tabell 1. Innerst inne, disse metodene involvert relativt hardt eksperimentelle forhold å oppnå hele fornyelse av chips på grunn av sterk molekyl-molekylet interaksjoner som immun komplekset brukes for SPR sjetonger. Disse harde eksperimentelle forhold kan imidlertid være svært skadelig for egenskapene overflaten av plassert gull microchips brukes i RTCA. Derfor en mild og effektiv metode var de store betraktningene i utviklingen av presentert gjenfødelse strategi. Andre faktorer som er like viktig er miljøhensyn, siden disse disponibel microchips brukes ofte sammen med målrettet kreftceller.

I denne protokollen introduserer vi en generell metode for regenererende kommersielle plassert gull microchips brukes for RTCA. Våre protokollen ble utviklet basert på trypsin-fordøyelsen og skylling med etanol og vann. Ekstra spinning trinnene anses å være effektiv i å fjerne uløselig partikler brukes for analysen for regenerering prosessen. Sammenlignet med reagensene brukes i tidligere rapportert metoder, regenererende reagenser trypsin og etanol er lett tilgjengelig for daglig laboratoriebruk og biologiske produkter/kjemikaliene er lav toksisitet, og dermed anses miljøvennlig, som er ønskelig i forbindelse med gjenfødelse.

I denne protokollen er det kritiske trinnet trypsin fordøyelsen å sikre gjenfødelse ytelsen til gull microchips. Optimalisering av trypsinization, inkludert konsentrasjon og tid, bør være første prioritet å oppnå gjenfødelse. Foruten fordøyelsen tiden som er rasjonalisert i vår forrige rapport19, er en god vurdering for optimaliseringsprosessen bare sjekke egenskapene overflaten med en optisk mikroskop.

En annen bekymring er behandling av microchips under regenerating process. Som en pipette brukes ofte i eksperimenter, bør oppmerksomhet vies av personell for å unngå riper spissen på overflaten av microchips. Det er gunstig for pre sterilisere den tips, gasbind og skjeen å sikre gjenfødelse effektivitet. Sist men ikke minst, gjenfødelse prosessen bør gjennomføres på en biosafety hette å unngå enhver kontaminering.

Det bør bemerkes at skyllingsprosess prosessene i gjenfødelse-protokollen manuelt er gjennomført, som vil uunngåelig føre til skjevhet på grunn av ulike personell. For å overkomme denne begrensningen, kan automatisk eller halvautomatisk utstyr for skylling formål være tilpasset designet, vurderer de modulære elektronisk platene brukes. I tillegg er gjenfødelse protokollen testet for å være effektive for celle-baserte analyser. Men i nærvær av sterk molekylære interaksjoner, for eksempel antistoff-antigen formasjon på grensesnittet av chips, foreslåtte gjenfødelse betingelsene kan være begrenset i stor grad og relativt sterk buffer forhold bør vurderes.

Samlet har gjeldende gjenfødelse protokollen blitt testet for å tillate gjentatt bruk av kommersielle gull microchips, samt andre gjennomfører elektroder som Au og glassaktig karbon elektroder. Vi forventer at anvendelsen av denne protokollen vil spare på den høye kjørende kostnaden på sanntid chip-baserte celle analyser. I det lange løp, microchip-baserte analyser blir oftere brukes for proteomic og cellular analyse og foreslåtte protokollen i denne studien kan tilby et alternativ for gjenfødelse, hvilke automatisk eller halvautomatisk utstyr for skylling kan være utformet og brukt i tilfeller av akkumulert disponibel sjetonger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation of China (U1703118), et prosjekt finansiert av prioritet faglig Program utvikling av Jiangsu høyere utdanning institusjoner (PAPD), Jiangsu Shuangchuang programmet, åpne midler av nøkkelen tilstand Laboratorium for kjemoterapi/Biosensing og kjemometri (2016015) og National Laboratory av Biomacromolecules (2017kf05) og Jiangsu Specially-Appointed Professor prosjektet, Kina.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Rat: Sprague-Dawley Charles River Cat# 400
mouse anti-rat CD11b monoclonal (clone OX42) Bio-Rad Cat# MCA275R Panning: 1:1,000; Staining: 1:500
Goat polycolonal anti-Iba1  Abcam Cat# AB5076 Staining: 1:500
Rabbit polyclonal anti-Ki67  Abcam  Cat# AB15580 Staining: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-mouse 594 Invitrogen Cat# 11055 Staining: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-goat 488 Invitrogen Cat# A-21203 Staining: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-Rabbit 647 Invitrogen Cat# A-31573 Staining: 1:500
Triton-X (detergent in ICC staining) Thermo Fisher Cat# 28313
Heparan sulfate Galen Laboratory Supplies Cat# GAG-HS01
Heparin Sigma  Cat# M3149
Peptone from milk solids Sigma Cat# P6838
TGF-β2 Peprotech Cat# 100-35B
Murine IL-34 R&D Systems Cat# 5195-ML/CF
Ovine wool cholesterol Avanti Polar Lipids Cat# 700000P
Collagen IV Corning  Cat# 354233
Oleic acid Cayman Chemicals  Cat# 90260
11(Z)Eicosadienoic (Gondoic) Acid Cayman Chemicals  Cat# 20606
Calcein AM dye Invitrogen Cat# C3100MP
Ethidium homodimer-1 Invitrogen Cat# E1169
DNaseI Worthington Cat# DPRFS
Percoll PLUS GE Healthcare Cat# 17-5445-02
Trypsin  Sigma Cat# T9935
DMEM/F12 Gibco Cat# 21041-02
Penicillin/ Streptomycin Gibco Cat# 15140-122
Glutamine Gibco Cat# 25030-081
N-acetyl cysteine  Sigma Cat# A9165
Insulin Sigma Cat# 16634
Apo-transferrin  Sigma Cat# T1147
Sodium selenite Sigma Cat# S-5261
DMEM (high glucose) Gibco Cat# 11960-044
Dapi Fluoromount-G Southern Biotech Cat# 0100-20 
Poly-D-Lysine  Sigma Cat# A-003-E
Primaria Plates  VWR Cat# 62406-456
Stock reagents  reconstitution  Concentration used Storage
Apo-transferrin 10 mg/mL in PBS  1:100 -20°C
N-acetyl cysteine 5 mg/mL in H2O  1:1,000 -20°C
Sodium selenite 2.5 mg/mL in H2O  1:25,000 -20°C
Collagen IV 200 μg/mL in PBS  1:100 -80°C
TGF-b2 20 μg/mL in PBS  1:10,000 -20°C
IL-34 100 μg/mL in PBS  1:1,000 -80°C
Ovine wool cholesterol 1.5 mg/mL in 100% ethanol  1:1,000 -20°C
Heparan sulfate 1 mg/mL in H2O 1:1,000 -20°C
Oleic acid/Gondoic acid Gondoic: 0.001 mg/mL; Oleic: 0.1 mg/mL in 100% ethanol  1:1,000 -20°C
Heparin 50 mg/mL in PBS  1:100 -20°C
Solutions  Recipe  Comments
Perfusion Buffer 50 μg/mL heparin in DPBS++ (PBS with Ca++ and Mg+ +) Use when ice-cold
Douncing Buffer 200 μL of 0.4% DNaseI in 50 mL of DPBS++ Use when ice-cold
Panning Buffer 2 mg/mL of peptone from milk solids in DPBS++
Microglia Growth Medium (MGM) DMEM/F12 containing 100 units/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin, 2 mM glutamine, 5 μg/mL N-acetyl cysteine, 5 μg/mL insulin, 100 μg/mL apo-transferrin, and 100 ng/mL sodium selenite Use ice-cold MGM to pan microglia off of immnopanning dish.
Collagen IV Coating MGM containing 2 μg/mL collagen IV
Myelin Seperation Buffer 9 mL Percoll PLUS, 1 mL 10x PBS without Ca++ and Mg++, 9 μL 1 M CaCl2, 5 μL 1 M MgCl2 Mix well after the addition of  CaCl2 and MgCl2
TGF-b2/IL-34/Cholesterol containing growth media (TIC)  MGM containing human 2 ng/mL TGF-b2, 100 ng/mL murine IL-34, 1.5 μg/mL ovine wool cholesterol, 10 μg/mL heparan sulfate, 0.1 μg/ml oleic acid, and 0.001 μg/ml gondoic acid Make sure to add cholesterol to media warmed to 37 °C and do not add more than 1.5 μg/mL or it will precipitate out. Do not filter cholesterol-containing media. Equilibrate TIC media with 10% CO2 for 30 min- 1 hr before adding to cells to insure optimal pH. 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Michaelis, S., Wegener, J., Robelek, R. Label-free monitoring of cell-based assays: Combining impedance analysis with SPR for multiparametric cell profiling. Biosens. Bioelectron. 49, 63-70 (2013).
  2. Hillger, J. M., et al. Whole-cell biosensor for label-free detection of GPCR-mediated drug responses in personal cell lines. Biosens. Bioelectron. 74, 233-242 (2015).
  3. Atienzar, F. A., et al. The use of real-time cell analyzer technology in drug discovery: defining optimal cell culture conditions and assay reproducibility with different adherent cellular models. J. Biomol. Screen. 16 (6), 575-587 (2011).
  4. Chen, H., et al. Label-free luminescent mesoporous silica nanoparticles for imaging and drug delivery. Theranostics. 3 (9), 650-657 (2013).
  5. Gao, Z., et al. Silicon Nanowire Arrays for Label-Free Detection of DNA. Anal. Chem. 79 (9), 3291-3297 (2007).
  6. Giaever, I., Keese, C. A morphological biosensor for mammalian cells. Nature. 366 (6455), 591-592 (1993).
  7. Xiao, C., Lachance, B., Sunahara, G., Luong, J. H. T. Assessment of cytotoxicity using electric cell-substrate impedance sensing: concentration and time response function approach. Anal. Chem. 74 (22), 5748-5753 (2002).
  8. Xiao, C., Lachance, B., Sunahara, G., Luong, J. H. T. An in-depth analysis of electric cell-substrate impedance sensing to study the attachment and spreading of mammalian cells. Anal. Chem. 74 (6), 1333-1339 (2002).
  9. Xing, J. Z., et al. Dynamic monitoring of cytotoxicity on microelectronic sensors. Chem. Res. Toxicol. 18 (2), 154-161 (2005).
  10. Abassi, Y. A., et al. Kinetic cell-based morphological screening: prediction of mechanism of compound action and off-target effects. Chem. Biol. 16 (7), 712-723 (2009).
  11. Urcan, E., et al. Real-time xCELLigence impedance analysis of the cytotoxicity of dental composite components on human gingival fibroblasts. Dent. Mater. 26 (1), 51-58 (2010).
  12. Atienza, J. M., Zhu, J., Wang, X., Xu, X., Abassi, Y. Dynamic monitoring of cell adhesion and spreading on microelectronic sensor arrays. J. Biomol. Screen. 10 (8), 795-805 (2005).
  13. Rahim, S., Uren, A. A Real-time Electrical Impedance Based Technique to Measure Invasion of Endothelial Cell Monolayer by Cancer Cells. J. Vis. Exp. (50), e2792 (2011).
  14. Moodley, K., Angel, C. E., Glass, M., Graham, E. S. Real-time profiling of NK cell killing of human astrocytes using xCELLigence technology. J. Neurosci. Meth. 200 (2), 173-180 (2011).
  15. Marinova, Z., Walitza, S., Grunblatt, E. Real-time impedance-based cell analyzer as a tool to delineate molecular pathways involved in neurotoxicity and neuroprotection in a neuronal cell line. J. Vis. Exp. (90), e51748 (2014).
  16. Chatelier, R. C., Gengenbach, T. R., Griesser, H. J., Brighamburke, M., Oshannessy, D. J. A general method to recondition and reuse Biacore sensor chips fouled with covalently immobilized protein/peptide. Anal. Biochem. 229 (1), 112-118 (1995).
  17. Vashist, S. K. A method for regenerating gold surface for prolonged reuse of gold-coated surface plasmon resonance chip. Anal. Biochem. 423 (1), 23-25 (2012).
  18. Nguyen, T. T., et al. A regenerative label-free fiber optic sensor using surface plasmon resonance for clinical diagnosis of fibrinogen. Int. J. Nanomed. 10, 155-163 (2015).
  19. Xu, Z., et al. A general method to regenerate arrayed gold microelectrodes for label-free cell assay. Anal. Biochem. 516, 57-60 (2017).
  20. Wang, H., et al. Three-dimensionally controllable synthesis of multichannel silica nanotubes and their application as dual drug carriers. ChemPlusChem. 80 (11), 1615-1623 (2015).
  21. Verrier, S., Notingher, I., Polak, J. M., Hench, L. L. In situ monitoring of cell death using Raman microspectroscopy. Biopolymers. 74 (1-2), 157-162 (2004).
  22. Keighley, S. D., Li, P., Estrela, P., Migliorato, P. Optimization of DNA immobilization on gold electrodes for label-free detection by electrochemical impedance spectroscopy. Biosens. Bioelectron. 23 (8), 1291-1297 (2008).
  23. Kandimalla, V. B., et al. Regeneration of ethyl parathion antibodies for repeated use in immunosensor: a study on dissociation of antigens from antibodies. Biosens. Bioelectron. 20 (4), 903-906 (2004).
  24. McGovern, J. P., Shih, W. Y., Shih, W. H. In situ detection of Bacillus anthracis spores using fully submersible, self-exciting, self-sensing PMN-PT/Sn piezoelectric microcantilevers. Analyst. 132 (8), 777-783 (2007).
  25. Loo, L., et al. A rapid method to regenerate piezoelectric microcantilever sensors (PEMS). Sensors. 11 (5), 5520-5528 (2011).
  26. Fischer, L. M., et al. Gold cleaning methods for electrochemical detection applications. Microelectron. Eng. 86 (4-6), 1282-1285 (2009).

Tags

Biokjemi problemet 133 etikett-fri cellebasert analysen gjenfødelse plassert gull microelectrodes sanntids celle analyzer trypsin
Regenerering av plassert gull Microelectrodes utstyrt for en sanntid celle Analyzer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xu, Z., Song, Y., Jiang, H., Kong,… More

Xu, Z., Song, Y., Jiang, H., Kong, Y., Li, X., Chen, J., Wu, Y. Regeneration of Arrayed Gold Microelectrodes Equipped for a Real-Time Cell Analyzer. J. Vis. Exp. (133), e56250, doi:10.3791/56250 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter