Summary
クラスター化の前核 (PN) 注射は定期的に短い回文繰り返し (CRISPR) を空間、CRISPR 関連タンパク質 9 ヌクレアーゼ (CRISPR/Cas9) システムは非常に効率的な遺伝子組み換えゴールデン ハムスターの製造方法。ここで、遺伝子ノックアウト ハムスター CRISPR/Cas9 システムの生産のための詳細な PN 注入プロトコルについて述べる。
Abstract
前核 (PN) 注入法 1 セル段階の胚の前核に外国の遺伝物質を導入するマウスで設立。導入された遺伝物質が胚のゲノムに統合し、次の母親を促進する挿入された胚の転送外国の遺伝情報を持つトランスジェニック動物を生成します。マウスで成功、PN の注入は、他の多くの動物種で正常に適用されています。最近では、PN の注入は正常に遺伝子変更と試薬を紹介に雇われているいくつかの研究室でサイト固有の遺伝的改変を達成し、農場の動物種の CRISPR/Cas9 システムなどの活動。PN 注入による遺伝子改変動物を生産するマイクロインジェクション技術の特別なセットを習得しただけでなく研究者を理解しなければならない繁殖生理学と対象種の動作それぞれの種プレゼント ユニークなので課題。たとえば、シリアのハムスター胚がユニークな PN 注入技術では不可能だったこの種当社グループによる最近の進歩までその体外要件の処理します。私たち種変更 PN 注入プロトコルで、いくつかの遺伝子ノックアウト (KO) の生産でノック (KI) ハムスターは、人間の病気に正常に使用されている成功しました。ここでハムスター、胚の処理条件、胚転送プロシージャの受精卵に CRISPR/Cas9 複雑なを提供するため PN 注入手順を説明、遺伝子を生成するために必要な畜産変更ハムスター。
Introduction
黄金のシリアのハムスター (ん) は、生物医学研究のための最も広く使用されている齧歯動物のひとつです。米国農務省によると約 100,000 ハムスターが動物福祉法 (http://www.aphis.usda.gov; アクセスで覆われて種総研究所動物使用量の 13% を表す、2015 年にはアメリカ合衆国で使用されました。2017 年 3 月 10 日)。
ハムスターは、人間の病気の多数の研究では他の齧歯動物をいくつかの利点を提供しています。BOP 治療は主にラットおよび肺の甲状腺腫瘍、肝腫瘍を誘発するたとえば、ハムスターで誘導される N nitrosobis(2-oxopropyl) アミン (BOP) の病理膵膵管癌は人間の膵臓の腫瘍のようマウス1。ハムスターはアデノ ウィルスのレプリケーションをサポートする唯一の小さい齧歯動物であるため、またアデノ ウイルスによる腫瘍溶解性ベクトルおよび抗アデノ ウイルス薬2,3,4のテストに最適なモデルです。高脂血症の研究では、前記のハムスター モデルはマウスおよびラット上の優位性を提供しています別の例です。人間やハムスターが脂質代謝経路で偉大な類似を表わすし、両種コレステリル エステル転送タンパク (CETP)、脂質代謝、CETP が不在のマウスとラットの5において中心的な役割を担う遺伝子を運ぶ。また、ハムスターはエボラ ウイルス6への露出に続く人間の症状の代表的な出血性疾患を開発します。ハムスターは、また動脈硬化症7、口腔癌8、および炎症性 myopathies9の勉強に最適なモデルです。最近では、それがハムスターをアンデス ウイルスに高い感受性がアンデス ウイルス感染症10のみ齧歯動物モデルを提供するハンタ ウイルス肺症候群のような疾患を発症、実証もされています。
我々 は最近、ハムスターに CRISPR/Cas9 システムを適用することに成功しているし、遺伝子のいくつかの行を生産している信頼性の高い小さな齧歯動物モデルがない利用可能な人間の病気を研究する新しい遺伝的動物モデルの満たされていない必要性に対処するためハムスター11を設計されています。ハムスターの受精卵は、他の種で開発された PN の注入のプロトコルが適してなど環境調査に非常に敏感です。したがって、我々 はハムスター ハムスター胚体外を処理するための特別な要件に対応するため PN 注入プロトコルを開発しました。ここでは、CRISPR/Cas9 システムと受信者の女性に挿入された胚の転送を 1 つのガイド RNA (sgRNA) の準備から、付属の手順を使用して詳細な PN の注入手順をについて説明します。
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Protocol
このプロトコルで説明する手順は、機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) ユタ州立大学によって承認された (IACUC プロトコル: 2484)。このプロトコルで使われるハムスターが大人 (6-10 週齢) LVG ひずみシリアのハムスター。すべてのハムスターは、ユタ州立大学 Bioinnovation センターでビバリウムで収容されます。部屋の温度は 23 ° C に設定されて、湿度が 40-50% に設定されて、ライト サイクルの設定 14:00 (光: 暗い)。可能な限り、胚操作と surugical の手順は生殖不能の技術と実行必要があります。
1. sgRNA Cas9/sgRNA Ribonucleoproteins (RNP) 等
- (材料表、補足 1) 合成キットのマニュアルに記載の in vitro転写の手順に従って sgRNAs を合成します。
- Ribonucleoproteins を組み立て、1 μ g の sgRNA と Cas9 の 2 μ g をミックス ミックス 10-15 分の室温で孵化させなさい。PN 注射用 100 ng/μ L Cas9 と 10 mM TE バッファー (RNase フリー、材料表) と sgRNA を 50 ng/μ L の濃度で実用的なソリューションを作る。
2. 精管切除の準備
注: 精管切除は、6-8 週齢で男性ハムスターに実行されます。手術は 10-14 日前に最初の交配を実施しなければなりません。不妊は、肥沃な女性と交配から失敗した妊娠によって確認されます。精管男性は、少ない性的にアクティブになる前に 1 年間通常使用できます。
- ケタミン ・ キシラジンの 40 mg/kg (ケタミン) と (キシラジン) 10 mg/kg の用量で腹腔注入による男性を麻酔します。ペダル反射 (つま先ピンチ) の欠如によって麻酔を確認します。
- 乾いたティッシュ ペーパーで背臥床で鎮静のハムスターを置きます。リンス腹部手術を交互に防腐剤治療の 3 つのラウンドには、70% アルコールとポビドン ヨードのソリューションをスクラブします。
- 開始 1.5 cm 半ば線 (図 1 a) からそれぞれの側に 1 cm を拡張する包皮に頭蓋手術ハサミで縦切開を確認します。皮膚、皮下組織、リネアを切開腹膜腔 (図 1 b) にアクセスするアルバ。
- 精巣および脂肪質のティッシュを強制的に陰嚢の尾側面に穏やかな圧力を適用します。鉗子で精管を優しくつかみ、慎重に vas から血管の鉗子 (図 1 c) の 2 番目のセットを区切ります。
- ループを形成するための鉗子で、輸精管を保持します。赤、それまで炎のもう一つの鉗子の先端を加熱し、輸精管のループを削除するそれを使用します。脂肪質のティッシュと精巣は腹部に挿入します。同じ手順を反対側の輸精管を削除します。
- まず皮膚を縫合し続いて筋を縫合します。動物が回復するまで暖かいパッド 30 分の檻の中に動物を配置します。それは通常の活動を再開するまでは、動物を観察します。
3. ドナー/受信者ハムスター準備スケジュール
- 監視および記録の発情周期。
メモ: 雌ハムスター分娩後すぐに維持安定した 4 日間の発情周期があります。発情期の最初の日に女性は、不透明、黄色および粘着性の膣分泌物 (図 2 a) によって識別できます。4 日目の発情期の雌は、透明、粘着性粘液 (図 2 b) によって識別できます。 - ドナー ハムスターの過剰排卵処置のため性的に成熟した女性を superovulate (> 6 週間) 妊馬血清性腺刺激ホルモン (PMSG; 50 IU/ml に溶解後 PBS) の IP 注入による発情周期の最初の日に (表 1) 9-12 の間。
注: PMSG は発情周期の同期ではなく、排卵を誘発します。 - 80 - PMSG (日 4、6-8 日)、注射後 84 h は、交配のため男性とケージの中で女性を配置します。ハムスター交尾の交配は発生しませんがプラグと、交配を見てでわれわれの成功を保証します。
- 精管男性と発情期の 4 日目の性的成熟した雌を交尾によって偽妊娠女性を準備します。ドナーとレシピエントの女性を準備するためのタイム スケジュールは、表 2のとおりです。
注: 真の妊娠した女性は、受信者、すなわち女性のコートの色を同じ色の肥沃な男性とつや消しの黄金色と区別としても使用できます。胚移植から派生した子犬は、コートの色に基づいて識別できます。真の妊娠した女性を使用して潜在的な利点は内生に作り出された胚が正常妊娠を確認し、インプラントの注入 PN 胚を助ける受信者として真の妊娠した女性を使用して潜在的な欠点は注入のための胚を内生的に対抗するため注入 PN 胚必要に生産します。
4. 受精卵分離
- 培地を準備 (HECM-9; レシピは補足 2 に記載されて)、マッキアナンと Bavister12で前述のよう。
- 1 日 PN 注入前に、受精卵料理 (25 μ L/ドロップ) と HECM 9 と 35 mm ディッシュのフタで PN 噴射ドロップ (100 μ L) 処理を準備します。鉱物油と媒体の滴を取り上げてください。次の条件の下で一晩インキュベーター中バランス: 37.5 ° C、10% CO25% O2 85% N2湿度 100%。
- PN 注射予定日 HECM 9 が付いている胚フラッシュ皿 (1 皿/ドナー ハムスター) を準備し、インキュベーターに使用するまですべての料理を格納します。
- CO2と排卵のハムスターを安楽死させます。
- 卵管の分離
- 手術用覆布またはティッシュ ペーパーで背の臥床で euthanized メスのハムスターを置き、70% エタノールを噴霧して腹部を準備します。
- しっかり皮膚を押しながら正中線で腹部の筋肉層と切開を行います。腹部の臓器を公開する腹膜を切開します。
- 微細鉗子で子宮の角の 1 つを持ち、腹部から組織を撤回します。Mesometrium と脂肪組織から子宮を区切ります。卵管と子宮 (子宮の一部を含む) の接合部に隣接する卵管と卵巣 2 番目のカットとカットをします。同じフラッシュ皿に 2 つの卵管を配置します。
- フラッシュおよび受精卵を収集
- 解剖顕微鏡の下で #5 ・ デュモン鉗子で子宮角の側を把握し漏斗の端から卵管の内腔に自家製針 (図 3) を挿入し、HECM 9 媒体の 300-400 μ L で卵管をフラッシュします。
- すぐに、受精卵を収集し、処理皿 HECM 9 媒体で 2 回洗ってください。開発のこの段階で、受精卵のすべては卵丘細胞から裸する必要があります。
- インキュベーター (37.5 ° C, 10% CO2, 5% O2 85% N2と 100% 湿度) の光への露出を最小限に抑えるためのコレクションの直後に、受精卵を配置します。
5. PN 注入
- 氷の上の Cas9/sgRNA RNP を解凍し、全体の PN 注入プロセスの間に氷の上複合体を維持します。
- Cas9/sgRNA RNP 液の射出実験直前に注射針をロードします。Cas9/sgRNA RNP ソリューションを格納筒に注射針の後端を置き、Cas9/sgRNA RNP ソリューションを毛管作用によって針を記入します。
- 注入皿や針を準備します。ホルダーの針のベンドの 〜 3 mm 以内に鉱物油とホルダー ピペットを入力します。皿の底に水平方向針の先端とガラスシリンジでホルダーを配置し、吸引して媒体に針の先端を塗りつぶします。ホルダーの反対側 10-15 ° の角度で注射針を設定します。
- PN 注入
- 受精卵を識別し、針とホルダーを良い吸引を適用します。理想的には、男性と女性の前核は、同じ焦点距離とホルダーに平行にあります。
- 注射針でゾーナと男性の前核 (3 ポジション) を浸透します。
- 一度、前核うねり核が針に付着するを防止し、前核の損傷を避けるためにすぐに注射針を撤回します。
6. 受精卵は偽妊娠ハムスターに転送します。
- (上記の精管切除のセクションで説明した方法と同じ) 偽妊娠ハムスターの麻酔し、腹臥床の手術用覆布または乾いたティッシュ ペーパーにそれを置きます。
- 目の乾燥を防ぐため、布や光から目を保護するために紙で頭をカバーする動物の目に目の潤滑剤を適用します。体の外側面を削って準備、ポビドン ヨード ・ スクラブと 3 回 70% エタノール スクラブの 3 回を適用することによって続いてボディの各側面の約 4 cm × 4 cm の皮膚領域。2 cm の縦切開 2 cm 尾側最後の肋骨 (図 4 a、 4 bに示すように)、動物の背中の両側にします。
- 鉗子で脂肪パッドをつかんで、卵管と子宮が表示されますまで丁寧に引き抜きます。クランプ、止血剤と脂肪パッドと脊椎 (図 4 c) 背脂肪パッドを反映します。子宮管胚移植 (図 4 d) 30 g 針に攻め込むことができるような生殖器官を配置します。
- 新しい皿 HECM 9 注入受精卵を洗います。新しいガラス ピペットを使用 (直径: 150 ~ 200 μ m) 10-15 受精卵を読み込めません。いくつかの気泡が続く真珠のチェーンとして、受精卵を配置します。ステップ 6.3 からオープン イク管にピペットを挿入し、受精卵を卵管に転送するピペットに優しく吹きます。最初の空気の泡が卵管管 (図 4e) に解放されるまでを吹いてを継続します。
- 脂肪質のパッドを離し、腹部に組織します。同じプロセスによって挿入された胚のもう一つの卵管管にほぼ同じ数 (10-15) を転送します。
- 筋肉と 2 層で皮膚を縫合します。手術後の鎮痛法としてブプレノルフィン塩酸 (0.5 mg/kg) を皮下管理します。ハムスターをケージに戻るし、回復のための暖かいパッドにケージを置きます。動物が麻酔から完全に回復したとき、動物の部屋にケージを返します。手術後の鎮痛薬は、再び 6 時間後を与えられています。
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Representative Results
遺伝子組み換えのハムスターの生産に記載されているプロトコルの効率によって異なります次の 2 つの重要なステップの結果: 受信者の女性と目的遺伝子の組み換えライブ仔犬の数の出生率。出生率は胚の質の直接結果、PN 注入および胚転送プロシージャを実行する個々 のスキル。操作の胚の発達の可能性が損なわれないように、細心の注意は、ハムスターの胚の体外処理中に必要です。我々 は定期的に偽受信者女性と 60-80% の出生率を達成します。表 3 RAG1ノックアウト実験から出生率を示しています (偽妊娠女性は使用された)、 stat2 のマニュアル ページノックアウト実験 (真の妊娠黒人女性が使用された; 出生率がこの場合として算出した、リットルの生産比率ゴールデン子犬)。
注入 PN 胚由来遺伝子組換えの子犬の割合は、前核にオクターリピートと Cas9/sgRNA ribonucleoproteins の成功の注入を導入することで sgRNA 性に依存します。遺伝子のターゲット (未発表観測) の sgRNA 効率が異なることがわかった。表 3に示すとおり、 stat2 のマニュアル ページ用に設計された sgRNA は遺伝子を標的RAG1の sgRNA はのみ 28.6% 効率的に 88.9% の効率で起因しました。図 5は、 RAG1遺伝子ターゲティングから子犬の PCR 制限断片長多形 (PCR-RFLP) 分析から結果、遺伝子の型の例を提供します。PCR-RFLP が効率をターゲット遺伝子を過小評価するように制限酵素認識シーケンス外いくつかオクターリピートがあります注意してくださいすることが重要です。続いて TA クローニング ベクトルに PCR の製品を subcloning サンガー PCR のシーケンス挿入が正確に測定遺伝子の効率をターゲティングし、オクターリピートの性質を明らかにするため必要。
図 1: 男性ハムスター精管切除。
)とb) 1.5 cm 頭側に拡張する包皮に頭蓋を始めて 2 cm の縦切開を作るc)鉗子; の 2 つのペアで関連付けられた精巣静脈と動脈から vas 敬意を分離d) 1 cm ループを形成するための鉗子で、輸精管を把握します。鉗子の 2 番目のセットを加熱し、同時に両端を焼灼しながらループをします。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 発情周期。
) 1 日目に観察したおりものが不透明、黄色、および粘着性があるb)おりもの観察 4 日目には、はっきりと粘着性があります。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 胚分離針の準備。
、)赤い線に沿って 30 ゲージ針を破壊、それは平滑まで先端を磨きます。b)先端から 〜 3 mm で 30-40 ° の角度を作る。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 受精卵の転送。
)とb) 2 cm (赤い線) の最後の肋骨に尾を開始 2 cm の縦に長い切開を作るc)クランプ、止血剤と脂肪パッドと背側の組織を反映d)卵管管の位置を調整し、30 ゲージ針; オープンを浸透e)胚転送ガラス内真珠の鎖として受精卵ピペットやイク オープンから卵管にそれらを転送の手配します。バー = 1, 000 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5。単一ごみRAG1オクターリピートの創設者動物の PCR-RFLP 分析します。M: 1 Kb ラダー プラス。WT: 野生型。ID 1、3 と 7 をノーカット バンドRAG1オクターリピートと一貫性のあります。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| 体重 (g) | PMSG (IU) | PMSG (ul) |
| < 110 | 10 | 200 |
| 110-135 | 15 | 300 |
| 135-160 | 20 | 400 |
| 160-185 | 25 | 500 |
| > 185 | 30 | 600 |
| PMSG、妊馬血清黄体 | ||
表 1。PMSG は体重に対応します。
| ハムスター | 日 1 | 日 2 | 日 3 | 日 4 | 日 5 |
| ドナー | PMSG (9-12) | 交尾 (6-20) | 受精卵の分離 (12-13) | ||
| PN 注入 (1-15) | |||||
| 受信者 | 交尾 (6-20) | 胚移植 (3-17) |
表 2。ドナー/受信者準備のタイム スケジュール
| 遺伝子 | 違います。胎児 (仔) | 違います。くず (受信者) | 違います。肯定的な子犬 (%) |
| STAT2 のマニュアル ページ | 229 (54) | 14 (19) * | 48 (88.9) |
| RAG1 | 77 (21) | 3 (3) | 6 (28.6) |
| * つや消しの肥沃な男性と女性は使用された;示されるリットル数は、のみこれらの作り出されたゴールデン子犬です。 | |||
表 3。Cas9/sgRNA システムによってシリアのハムスターの遺伝子ターゲティングの効率
| 条件/処理 | 要件 | コメント |
| アンビエント ライト | すべての周囲の光をオフにします。 | ハムスターの胚が光を冷却するために特に光に敏感 |
| In vitro における処理中に光 | PN 注射用 20 分以内 | 光の露出を抑えるラウンドあたり 15 の胚を操作します。 |
| 温度 | 周囲温度: 28±0.5 oC | ハムスターの胚は温度の変動に敏感であります。 |
| 処理温度: 37.5 oC | ||
| 媒体 | HECM 9 | 3 日以上を格納しないでください。 |
| 培養条件 | 37.5 oC、10% CO25% O2湿度 100% | インキュベーターで一晩バランス |
| 胚移植後の飼育 | 前に、/後 5 日以内のケージを変更しない日付 | 受信者は困惑; 場合の子犬を食う十分な給水を提供します。 |
表 4。ハムスター胚の取り扱い、飼育に固有の要件
補足 1: GeneArt 高精度合成キットで sgRNA を合成します。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。
補足 2: ハムスター胚培養培地 9 (HECM-9) レシピ。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。
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Discussion
良いひと疾患のモデルとしてシリアのハムスターの可能性を悪用する、我々 は、CRISPR/Cas9 複雑なハムスターのゲノムを対象とするを提供するため PN 注入プロトコルを開発しました。PN 注入プロトコルには、胚培養培地、温度、光13の波長などいくつかのキーの変数が最適化されます。また、ハムスターの遺伝子ターゲティングを正常に実施するために従う必要がありますいくつかのハムスター固有動物取り扱い手順があります。たとえば、性的成熟雌ハムスターは外因性ホルモン (例: PMSG) と同期することはできません安定の 4 日発情周期を持ちます。こうしてそれぞれの雌の発情周期を正確に追跡は、過剰排卵処理および偽妊娠準備のため重要です。30-60 の受精卵には、彼女は正常に排卵がある場合、女性から作ることが出来ます。正常な排卵を達成するために脂肪の種特異的な沈着を考慮する必要が。特にそれら以上 12 週齢、雌のハムスターは、注射針は、ホルモン注射を実行するときに、脂肪パッドを充分に浸透させるのに正しく配置する必要がありますこのような過剰な腹部の脂肪を持っている傾向があります。腹腔内への浸透途中がホルモン配信に適切な距離を実現できることがわかりました。我々 は、PN 注入、ハムスター処理および表 4の飼育に関する独特の要件を要約しました。
PN 注入注射の各ラウンドの注入皿に転送胚の数が実験的拡張射出時間を避けるために決定する必要があります。長い時間胚に残る料理、大きい彼らが光への露出過度になるチャンス。注射の各ラウンドの注入皿に約 15 胚を転送することをお勧めします。この番号は、注射のラウンド数と光への胚の許容曝露のバランスを保ちます。ハムスターの胚膜の細胞質および前核の両方は非常に柔軟な実質的な力は、前核の細胞膜を貫通する注射針に適用する必要があります。この時間の間に前核は、焦点距離の範囲内で残らなければなりません。
研究者は、胚の転送を実行するときに次の手術の問題を検討してください。まず、体壁の切開が動物の体の大きさに対応していることが重要です。切開が小さすぎる場合その卵管から受精卵の押し出しにおける生殖器官を腹部に戻るとき。切開の大きさに加えて適切な生殖組織ではなく、関連付けられている脂肪パッドを処理することにより卵管から受精卵の押出成形の可能性を最小限にできます。切開の大きさに関して、大きく切開が動物に多くのストレスを引き起こすし、展示 (例えば感染裂) の合併症の確率が高いことを考慮することが重要ですも。第二に、出血を最小限に抑える、研究する必要があります世話をする余分な血損失が胚移植の成功を減らすために手術のストレスを増やすことができるので、回復時間を延長、腹部にアクセスするときに、主要な血管を切開を避けるために
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Disclosures
ZW は学バイオ、llc で金銭的な利益を生物医学研究と農業のアプリケーションのための遺伝子組み換え動物の作成に特化したバイオ テクノロジー会社。
Acknowledgments
この出版物で報告された研究は、国立研究所のアレルギーおよび感染症 (NIAID) の健康の国民の協会 (ZW) に受賞番号 1R41OD021979 の下で、次世代 BioGreen 21 からの研究助成金にサポートされていたプログラムは、韓国の許可なし。PJ01107704 (ZW) に no を与える。(IK) を PJ01107703。内容は著者の責任と BioGreen 21 の国立衛生研究所の公式見解を必ずしも表さない。博士ニコラス Robl は、原稿の編集を感謝いたします。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cas9 | Invitrogen | B25640 | 1 μg/μL (~6.1 μM) |
| GeneArtTM Precision Synthesis Kit | Invitrogen | A29377 | For sgRNA synthesis |
| Albumin from human serum | Sigma | A1653 | For cultivation medium |
| Illuminator | Nikon | NI-150 | For embryo transfer |
| Incubator | New Brunswick | Galaxy 14S | For embryo cultivation |
| Microforge | Narishige | PB-7 | For making injection needles |
| Microscope | Nikon | ECLIPSE Ti-S | For microinjection |
| Microscope | invitrogen | SMZ745T | For embryo transfer |
| Mineral oil | Sigma | M1840 | Keep in dark |
| PMSG | Sigma | G4877-2000IU | For superovulation |
References
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