Summary
Pronuclear (PN) injeksjon av de klynget regelmessig interspaced kort palindromic gjentar (CRISPR) og CRISPR-assosiert protein-9 nuclease (CRISPR/Cas9) er en svært effektiv metode for å produsere genmodifiserte golden syrer hamsters. Her beskriver vi detaljerte PN injeksjon protokollen for produksjon av genet knockout hamstere med CRISPR/Cas9-systemet.
Abstract
Pronuclear (PN) injeksjon teknikken ble først etablert i mus å innføre genetisk fremmedlegemer i pronuclei av en celle scenen embryo. Introdusert arvestoffet kan integrere embryonale genomet og generere transgene dyr med utenlandske genetisk informasjon etter overføring av de injiserte embryoene å fremme mødre. Etter suksessen i mus, PN injeksjon er brukt med hell i mange andre dyrearter. Nylig PN injeksjon har vært ansatt å innføre reagenser med endring av genet aktiviteter, for eksempel CRISPR/Cas9 system, å oppnå områdespesifikke genetiske modifikasjoner i flere laboratorium, og gården dyrearter. I tillegg til mestring spesielle settet av microinjection ferdigheter å produsere genmodifiserte dyr av PN injeksjon, må forskere forstå reproduksjon fysiologi og atferd av målet artene, fordi hver art presenterer unike utfordringer. For eksempel golden Syrer hamster embryoer har unik håndtering krav i vitro slik at PN-injeksjon teknikker ikke var mulig i denne arten til siste gjennombrudd av vår gruppe. Med våre arter endret PN injeksjon protokollen, har vi lykkes i produksjon flere genet knockout (KO) og knockin (KI) hamsters, som har vært brukt med hell modell menneskelige sykdommer. Beskriver her vi PN injeksjon prosedyren for å levere CRISPR/Cas9 kompleks til zygotes hamster, fosteret håndtering forhold, fosteret overføring prosedyrer, og dyrehold kreves for å produsere genetisk endret hamstere.
Introduction
Golden Syreren hamster (Mesocricetus auratus) er en av de mest brukte gnagere for biomedisinsk forskning. Ifølge US Department of Agriculture, ble ca 100.000 hamstere brukt i USA i 2015, som representerer 13% av totale laboratorium dyr bruk blant artene som omfattes av det dyr velferd gjerning (http://www.aphis.usda.gov; tilgjengelig 10 mars 2017).
Hamster tilbyr flere fordeler sammenlignet med annet Red i studiet av en rekke menneskelige sykdommer. For eksempel histopatologi av N-nitrosobis(2-oxopropyl) Amin (BOP) indusert bukspyttkjertelen ductal adenocarcinomas i hamster ligner menneskelige bukspyttkjertelen svulster, mens BOP behandling hovedsakelig induserer skjoldbruskkjertelen svulster i rotter og lunge og leverskader svulster i mus1. Fordi hamsters er bare små gnagere grunnlegge for å oppbacking replikering av adenoviruses, er de også modell av valget for adenovirus-basert kan vektorer og anti-adenovirus narkotika2,3,4. Et annet eksempel hvor hamster modellen tilbyr en fordel over mus og rotter er i studiet av hyperlipidemi. Mennesker og hamstere viser stor likheter i lipid metabolske veier og begge arter bærer genet koding cholesteryl ester overføring protein (CETP), som spiller en sentral rolle i lipid metabolisms, mens CETP er fraværende i mus og rotter5. I tillegg utvikle hamstere hemorrhagic sykdommen mer representative for menneskelig manifestasjonen etter eksponering for Ebola-viruset6. Hamsters er også modeller av valget for å studere aterosklerose7, muntlig kreftsvulster8og inflammatoriske myopathies9. Nylig har det også vært vist at hamsters er svært utsatt for Andes virusinfeksjon og utvikle hantavirus lunge syndrom-lignende sykdom, gir bare gnager modell av Andes virus infeksjon10.
For å løse udekkede behov for romanen genetisk dyremodeller å studere menneskelige sykdommer der ingen pålitelig små gnagere modell er tilgjengelig, vi nylig har lyktes i å bruke CRISPR/Cas9 systemet til hamster og har produsert flere linjer med genetisk konstruert hamstere11. Hamster zygotes er svært følsom for miljømessige miljøer slik at PN injeksjon protokoller utviklet i andre arter er uegnet. Derfor utviklet vi en PN injeksjon protokoll for hamster som er tilpasset de spesielle kravene for håndtering av hamster embryo i vitro. Her beskriver vi detaljerte PN injeksjon prosedyren bruker CRISPR/Cas9 systemet og følger trinnene, utarbeidelse av enkelt støttelinje RNA (sgRNA) til å overføre injisert embryo i mottakerens kvinner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Fremgangsmåtene i denne protokollen ble godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC) av Utah State University (IACUC protokollen: 2484). Hamsters brukes i denne protokollen er voksen (6-10 uker gammel) LVG belastning golden syrer hamsters. Alle hamstere ligger i vivarium i Bioinnovation sentrum, Utah State University. Romtemperatur ligger på 23 ° C, luftfuktighet ligger 40-50% og lyset sykle ligger 14L: 10D (lys: dark). Mulig embryoet manipulasjon og surugical prosedyrer bør utføres med sterilt teknikker.
1. sgRNA og Cas9/sgRNA Ribonucleoproteins (RNP) forberedelse
- Syntetisere sgRNAs følgende i vitro transkripsjon fremgangsmåtene i manualen for syntese kit (materialer tabell, Supplement 1).
- For å montere ribonucleoproteins, bland 2 µg av Cas9 med 1 µg av sgRNA og ruge blandingen ved romtemperatur for 10-15 min. For PN injeksjon, foreta en fungerende løsning på konsentrasjonen av 100 ng/µL Cas9 og 50 ng/µL sgRNA med 10 mM TE buffer (RNase gratis, Materialer tabell).
2. vasektomi forberedelse
Merk: Vasektomi utføres på mannlige hamstere for 6-8 ukens av alderen. Operasjonen skal utføres 10-14 dager før første mating. Sterilitet er bekreftet av mislykkede svangerskap fra parring fruktbare kvinner. Vasectomized menn kan vanligvis brukes for et år før de blir mindre seksuelt aktive.
- Bedøve menn ved intraperitoneal (IP) injeksjon av ketamin/xylazine med en dose av 40 mg/kg (ketamin) og 10 mg/kg (xylazine). Bekreft anestesi ved mangel på en pedal refleks (toe knip).
- Lå bedøvet hamster i dorsal recumbency på en tørr papir. Skyll magen med tre runder med antiseptisk behandlinger av vekslende kirurgisk skrubbe løsninger mellom 70% alkohol og povidon-jod.
- Gjøre en loddrett snitt med kirurgisk saks starter 1,5 cm skallen til prepuce utvide 1 cm på hver side fra midtlinjen (figur 1a). Incise huden, subkutant vev, og linea alba tilgang til peritoneal plassen (figur 1b).
- Bruke lett trykk caudal aspekt av pungen å tvinge testiklene og fettvev ut. Forstå vas deferens forsiktig med tang og forsiktig skille blodkaret fra vas med et annet sett med tang (figur 1 c).
- Hold vas deferens med tang å danne en løkke. Varme spissen av en annen tang i flammen til det er røde, og deretter bruke den til å fjerne løkken av vas deferens. Sett inn fettvev og testiklene til magen. Fjerne vas deferens på motstående side med de samme fremgangsmåtene.
- Sutur muskulatur først etterfulgt av suturing huden. Plassere dyret på en varm pute i bur i 30 min før dyret gjenoppretter. Observere dyret før det fortsetter normal aktivitet.
3. donor/mottaker Hamster forberedelse tidsplan
- Overvåke og registrere estrous sykluser.
Merk: Kvinnelige hamstere har en stabil 4-dager estrous syklus som vedlikeholdes umiddelbart etter fødsel. Kvinner på den første dagen av estrous kan identifiseres ved at ugjennomsiktige, gulaktig og klissete utflod (figur 2a). Kvinner på dag 4 av estrous kan identifiseres ved gjennomsiktig, klissete Slim (figur 2b). - For superovulation av donor hamster, superovulate seksuell modne kvinner (> 6 uker) på den første dagen av estrous syklusen av IP injeksjon av gravid mare's serum gonadotropin (PMSG, oppløst i PBS som 50 IU/mL) (tabell 1) mellom 9-12 AM.
Merk: PMSG er for inducing superovulation men ikke for estrous syklus synkronisering. - 80 - 84 h etter injeksjon av PMSG (dag 4, 6-8 PM), sted kvinner i bur med menn for mating. Som hamster parring ikke resultere i copulation plugger, sikre vellykket parring ved å se på parring.
- Klargjør pseudopregnant kvinner ved parring seksuell modne kvinner på dag 4 av estrous med vasectomized menn. Tidsplan for å forberede giver og mottaker kvinner er vist i tabell 2.
Merk: Ekte gravide kvinner kan også brukes som mottakere, dvs, kvinner med en belegge fargen skilles fra den gylne fargen samanfletta med samme farge fruktbare hanner. Pups avledet fra embryoer kan identifiseres basert på belegge fargene. En potensiell fordel i å bruke ekte gravide kvinner er at endogenously produsert embryo vil sikre vellykket svangerskap og hjelpe PN injisert embryo til implantatet; en potensiell ulempe ved ekte gravide kvinner som mottakere er at PN injisert embryo måtte konkurrere med endogenously produsert embryo for implantasjon.
4. zygote isolasjon
- Forberede kultur medium (HECM-9; oppskrift er beskrevet i tillegget 2), som beskrevet tidligere i McKiernan og Bavister12.
- Én dag før PN injeksjon, forberede zygote retter (25 µL/slipp) og en PN injeksjon dråpe (100 µL) i lokket på en 35 mm parabolen med HECM-9. Deretter dekk middels dråper med mineralolje. Balanse medium i en inkubator natten under følgende betingelser: 37,5 ° C, 10% CO2, 5% O2, 85% N2 og 100% luftfuktighet.
- På dag planlagt PN injeksjon, forberede embryoet rødme retter (1 rett/donor hamster) med HECM-9 og lagre alle retter i inkubator før bruk.
- Euthanize superovulated hamstere med CO2.
- Oviduct isolasjon
- Plasser en euthanized kvinnelig hamster i dorsal recumbency på en kirurgisk drapere eller papir og forberede magen med 70% etanol spray.
- Fast holde huden og bukmuskel lag på midtlinjen og gjøre et snitt. Incise peritoneum å avsløre abdominal organer.
- Hold en av livmor hornene med en fin tang og trekke vev fra magen. Skille livmoren fra mesometrium og fett vev. Gjøre et kutt mellom oviduct og eggstokk og en andre kutt ved krysset oviduct og livmoren (inkluderer en liten del av livmoren). Sett de to oviducts i samme flush parabolen.
- Flush og samle zygotes
- Under disseksjon mikroskopet, forstå siden av livmor horn med en #5 Dumont tang og en hjemmelaget nål (Figur 3) inn lumen av oviduct fra infundibular slutten og tømme oviduct med 300-400 µL av HECM-9 medium.
- Samle zygotes umiddelbart og vaske dem to ganger med HECM-9 medium i håndtering parabolen. På dette stadiet i utviklingen, skal alle zygotes være blottet fra cumulus celler.
- Sett zygotes i en inkubator (37,5 ° C, 10% CO2, 5% O2, 85% N2 og 100% luftfuktighet) umiddelbart etter samling å minimere eksponering for lys.
5. PN injeksjon
- Tine Cas9/sgRNA-RNP på is og opprettholde komplekset på is under hele PN injeksjon prosessen.
- Last injeksjon nåler med Cas9/sgRNA RNP løsning umiddelbart før injeksjon eksperimenter. Sted på baksiden slutten av injeksjon pinnene inn i røret som inneholder Cas9/sgRNA RNP løsningen og la Cas9/sgRNA RNP løsningen å fylle nålen kapillær handling.
- Forberede injeksjon parabolen og nåler. Fyll holderen pipette med mineralolje til innen ~ 3 mm bøyningsvinkelen holderen nålen. Plasser holderen i microinjector med spissen av nålen vannrett til bunnen av fatet og fyll spissen av nålen med medium ved å suge. Angi injeksjon nålen i 10-15° vinkel motsatt holderen.
- PN injeksjon
- Identifisere en zygote og bruke en fin sugekraft med holderen nålen. Ideelt sett er de mannlige og kvinnelige pronuclei innenfor samme brennvidde og justert parallell til holderen.
- Trenge gjennom zona og mannlige pronuclei (3 oclock ' holdning) med injeksjon nålen.
- Trekke injeksjon nålen raskt når pronucleus sveller å forebygge kjernen fra å nålen og unngå skade på pronucleus.
6. zygotes overføring til Pseudopregnant hamstere
- Bedøve en pseudopregnant hamster (på samme måte som beskrevet i avsnittet vasektomi ovenfor) og legge den på en kirurgisk drapere eller tørr papir i ventrale recumbency.
- Bruke øye smøremidler øynene til dyret å hindre øye tørrhet og dekker hodet med en klut eller papir for å beskytte øynene mot lyset. Forberede den laterale aspektet av kroppen ved å barbere en ca 4 cm x 4 cm hud området på begge sider av kroppen etterfulgt av å bruke 3 ganger povidon-jod scrubs og 3 ganger 70% etanol scrubs. Gjøre en 2 cm loddrett snitt 2 cm caudal siste vrborden (som vist i tall 4a, 4b) på hver side av baksiden av dyret.
- Forstå fett puten med tang og trekk forsiktig til oviduct og livmoren blir synlig. Klemme det fett puten med en hemostats og reflekterer fett puten ytterst ryggraden (Figur 4 c). Plasser skjede slik at livmor røret kan gjennomsyret med en 30 gauge nål for embryoer (Figur 4 d).
- Vask de injiserte zygotes med HECM-9 i en ny rett. Bruk en ny glass pipette (diameter: ~ 150-200 µm) laste 10-15 zygotes. Ordne zygotes som en kjede av perler etterfulgt av flere luftbobler. Sett inn Pipetter i åpne gjennomsyret røret fra trinn 6.3 og forsiktig blåse i pipette overføre zygotes til oviduct. Fortsatt blåser til den første luftboble slippes i oviduct skrift (figur 4e).
- Slipp fett puten og returnere vevet til magen. Overføre omtrent det samme nummeret (10-15) av injisert embryoene til en annen oviduct skrift av samme prosessene.
- Sutur muskulatur og huden i 2 lagene. Administrere buprenorfin-HCL (0,5 mg/kg) subcutaneously som post-op analgesi. Returnere hamster å en bur og plasser byrået på en varm pute for gjenoppretting. Returner buret til dyr rommet når dyret er helt tilbake fra anestesi. Post-op analgetika får igjen seks timer senere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Effektiviteten av beskrevet protokollen produsere genmodifiserte hamstere avhenger av utfallet av følgende to viktige trinn: live fødselsrate av mottakeren kvinner og antall live pups med de tiltenkte genetiske modifikasjonene. Live fødselen er et direkte resultat av embryoet kvalitet og dyktighet av enkelt PN injeksjon og embryo overføring prosedyrer. For å sikre at den utviklingsmessige potensialet av manipulert embryo ikke er i fare, er stor forsiktighet nødvendig under i vitro behandlingen av hamster embryoer. Vi oppnå regelmessig en live fødselsrate på 60-80% pseudopregnant mottaker kvinner. Tabell 3 viser live fødselstall fra RAG1 knockout eksperimentet (pseudopregnant kvinner ble brukt) og STAT2 knockout eksperimentet (sann gravid svarte kvinner ble brukt, live fødselsrate i dette tilfellet beregnet som den prosentandel av søppel produsert golden pups).
Prosentandelen av genmodifiserte pups produsert fra PN injisert embryo avhenger både effektiviteten av sgRNA introdusere indeler og vellykket injeksjon av Cas9/sgRNA-ribonucleoproteins i pronuclei. Vi fant at sgRNA effektiviteten varierer blant genet mål (upubliserte observasjoner). Som vist i tabell 3, resulterte sgRNA utviklet for STAT2 i et gen målretting effektiviteten til 88.9%, mens sgRNA for RAG1 var bare 28,6% effektiv. Figur 5 gir et eksempel på genotyperingteknologi resultater fra en PCR begrensning fragment lengde polymorfisme (PCR-RFLP) analysen av pups fra RAG1 gene målretting. Det er viktig å merke seg at noen indeler kan oppstå utenfor begrensning enzym anerkjennelse sekvensen, slik at PCR-RFLP kan undervurdere genet målrette effektivitet. Subcloning PCR produktene i TA kloning vektorer etterfulgt av Sanger sekvensering av PCR setter er å nøyaktig måle genet målrette effektivitet og avsløre natur indeler.
Figur 1: Mannlige Hamster vasektomi.
a) og b) gjøre en 2 cm loddrett snitt begynner 1,5 cm skallen til prepuce utvider cranially; c) skille av vas ærbødighet fra tilknyttede testicular vene og arterie med to par tang; d) forstå vas deferens med en tang til en 1 cm loop. Varme et annet sett med tang og avgiftsdirektoratet loopen mens cauterizing ender samtidig. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Estrous syklus.
a) vaginal utslippet observert på dag 1 er ugjennomsiktig, gulaktig og klissete b) utflod observerbare på dag 4 er klar og klissete. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Utarbeidelse av nålen Embryo isolering.
en) brudd en 30 gauge nålen langs den røde linjen og polske spissen til det er flat og jevn. b) gjøre en 30-40 ° vinkel på ~ 3 mm fra spissen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Zygote overføring.
a) og b) gjøre en 2 cm lang vertikal snitt starter 2 cm caudal til siste vrborden (rød linje); c) klemme fett pad med en Hemostats og reflektere vevet ryggen; d) Juster plasseringen av oviduct skrift og trenge en åpen med en 30 gauge nål; e) zygotes som en kjede av perler i fosteret overføring glasset Pipetter og overføre dem i oviduct fra gjennomsyret open. Bar = 1 000 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. PCR-RFLP analysen av et enkelt kull grunnlegger dyr med RAG1 indeler. M: 1 Kb pluss stigen. WT: wild type. ID 1, 3 og 7 viser uncut bandet samsvar med RAG1 indeler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Kroppsvekt (g) | PMSG (IU) | PMSG (ul) |
| < 110 | 10 | 200 |
| 110-135 | 15 | 300 |
| 135-160 | 20 | 400 |
| 160-185 | 25 | 500 |
| > 185 | 30 | 600 |
| PMSG, gravid mare's serum gonadatropin | ||
Tabell 1. PMSG gjør tilsvarer kroppen vekter
| Hamster | Dag 1 | Dag 2 | Dag 3 | Dag 4 | Dag 5 |
| Donor | PMSG (9-12 am) | Mating (6-8 pm) | Zygote isolasjon (12-1 pm) | ||
| PN injeksjon (1-3 pm) | |||||
| Mottakeren | Mating (6-8 pm) | Embryoer (3-5 pm) |
Tabell 2. Tidsplan Donor/mottaker forberedelser
| Gener | nei. Embryo (Pups) | nei. Kull (mottakere) | nei. Positiv pups (%) |
| STAT2 | 229 (54) | 14 (19) * | 48 (88.9) |
| RAG1 | 77 (21) | 3 (3) | 6 (28,6) |
| * kvinner sammenfiltret med fruktbare menn ble brukt; søppel angitt er bare de produsert golden pups. | |||
Tabell 3. Effektiviteten av Gene Targeting i Golden syrer Hamster av Cas9/sgRNA systemet
| Tilstand/håndtering | Krav | Kommentarer |
| Omgivelseslys | Slå av alle omgivelseslys | Hamster embryoer er følsom for lys, spesielt å kjøle lys |
| Lys under i vitro håndtering | Mindre enn 20 min til PN injeksjon | Manipulere 15 embryo per runde å redusere eksponering |
| Temperatur | Omgivelsestemperatur: 28±0.5 oC | Hamster embryoer er følsomme for temperatursvingninger |
| Håndtering temperatur: 37,5 oC | ||
| Middels | HECM-9 | Lagre ikke mer enn 3 dager |
| Kultur tilstand | 37,5 oC, 10% CO2, 5% O2 og 100% luftfuktighet | Balansert overnatting i kuvøse |
| Reindriftens etter embryoer | Ikke endre bur innen 5 dager før/etter forfallsdato dato | Mottakeren vil cannibalize pups hvis forstyrret; gi nok fôr/vann |
Tabell 4. Unike krav Hamster Embryo håndtering og røkting
Supplement 1: syntetisere sgRNA av GeneArt presisjon syntese. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplement 2: Hamster Embryo kultur Medium-9 (HECM-9) oppskrift. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bedre utnytte potensialet i golden syrer hamsters som modeller for menneskelig sykdom, utviklet vi en PN injeksjon protokoll for å levere en CRISPR/Cas9 komplekse målrettingsland hamster genomet. PN injeksjon protokollen optimaliserer flere viktige variabler inkludert embryoet kultur medium, temperatur og bølgelengder av lys13. Det er også flere hamster-spesifikke dyr håndteringsprosedyrer må følge for å kunne gjennomføre genet målretting i hamster. For eksempel har seksuelt modnet kvinnelige hamstere stabil 4-dagers estrous sykluser som ikke kan synkroniseres med eksogene hormoner (f.eks PMSG). Dermed nøyaktig sporing estrous sykluser av hver hunn er viktig for både superovulation og pseudopregnancy forberedelser. 30 - 60 zygotes kan produseres fra en kvinne hvis hun er vellykket superovulated. For å oppnå vellykket superovulation, er det nødvendig å vurdere artsspesifikke deponering av fett. Kvinnelige hamsters, spesielt de over 12 ukens av alderen, pleier å ha overdreven fett slik at sprøytenålen må plasseres riktig å fullt trenge fett puten under hormon injeksjoner. Vi har funnet at gjennomtrengning halvveis i bukhulen oppnår riktig avstand for hormon levering. Vi oppsummert entydige krav for PN injeksjon, hamster håndtering og røkting i Tabell 4.
For PN injeksjon, må hvor mange embryoer overført til injeksjon parabolen for hver runde av injeksjon bestemmes eksperimentelt å unngå utvidet injeksjon. Lenger tiden embryoene forblir i fatet, jo større er sjansen for at de opplever overeksponering for lys. Vi anbefaler overføre ca 15 embryo til injeksjon parabolen for hver runde av injeksjoner. Dette nummeret oppnår en god balanse mellom antall runder av injeksjoner og utholdelig eksponering for embryoene lys. Som begge cytoplasmatiske og pronuclear membraner av hamster embryo er fleksible, må betydelig kraft brukes til injeksjon nålen å trenge gjennom membranen av pronucleus. Samtidig må på pronuclei være innenfor brennvidde.
Forskere bør vurdere følgende kirurgisk problemer når embryoet overføringer. Først er det viktig at snitt gjennom kroppen veggen tilsvarer kroppen størrelsen på dyret. Hvis snittet er for lite, kan det medføre utelukkelse av zygotes fra oviduct ved retur skjede til magen. I tillegg til snitt størrelse, kan potensialet for utelukkelse av zygotes fra oviduct minimeres ved å håndtere tilknyttede fett puten i stedet for reproduktiv vevet riktig. I forhold til snitt størrelse er det også viktig å tenke at større snitt kan føre til mer stress til dyret og viser en høyere sannsynlighet for komplikasjoner (f.eks infeksjon dehiscence). Andre, for å minimere blødning, forskere burde ta for å unngå incising store blodkar når magen fordi overskytende blodtap kan øke kirurgi stress for å redusere suksessen til embryoer, og utvide gjenopprettingstiden
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ZW har økonomiske interesser i Auratus Bio, LLC., et bioteknologiselskap spesialisert i å skape genmodifiserte dyr for biomedisinsk forskning og landbruket.
Acknowledgments
Forskningen i denne publikasjonen ble støttet av National Institutes of Allergy og smittsomme sykdommer (NIAID) av National Institutes of Health under prisen nummer 1R41OD021979 (å ZW) og et forskningsstipend fra neste generasjons BioGreen 21 Programmet, Sør-Korea, gir ingen. PJ01107704 (til ZW) og nei. PJ01107703 (til IK). Innholdet er ansvar forfattere og representerer ikke nødvendigvis den offisielle synet av National Institutes of Health eller BioGreen 21. Vi takker Dr. Nikolas Robl for redigering manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cas9 | Invitrogen | B25640 | 1 μg/μL (~6.1 μM) |
| GeneArtTM Precision Synthesis Kit | Invitrogen | A29377 | For sgRNA synthesis |
| Albumin from human serum | Sigma | A1653 | For cultivation medium |
| Illuminator | Nikon | NI-150 | For embryo transfer |
| Incubator | New Brunswick | Galaxy 14S | For embryo cultivation |
| Microforge | Narishige | PB-7 | For making injection needles |
| Microscope | Nikon | ECLIPSE Ti-S | For microinjection |
| Microscope | invitrogen | SMZ745T | For embryo transfer |
| Mineral oil | Sigma | M1840 | Keep in dark |
| PMSG | Sigma | G4877-2000IU | For superovulation |
References
- Takahashi, M., Hori, M., Mutoh, M., Wakabayashi, K., Nakagama, H. Experimental animal models of pancreatic carcinogenesis for prevention studies and their relevance to human disease. Cancers (Basel). 3 (1), 582-602 (2011).
- Wold, W. S., Toth, K. Chapter three--Syrian hamster as an animal model to study oncolytic adenoviruses and to evaluate the efficacy of antiviral compounds. Adv Cancer Res. , 69-92 (2012).
- Thomas, M. A., et al. Syrian hamster as a permissive immunocompetent animal model for the study of oncolytic adenovirus vectors. Cancer Res. 66 (3), 1270-1276 (2006).
- Thomas, M. A., Spencer, J. F., Wold, W. S. Use of the Syrian hamster as an animal model for oncolytic adenovirus vectors. Methods Mol Med. , 169-183 (2007).
- Hogarth, C. A., Roy, A., Ebert, D. L. Genomic evidence for the absence of a functional cholesteryl ester transfer protein gene in mice and rats. Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 135 (2), 219-229 (2003).
- Ebihara, H., et al. A Syrian golden hamster model recapitulating ebola hemorrhagic fever. J Infect Dis. 207 (2), 306-318 (2013).
- Jove, M., et al. Lipidomic and metabolomic analyses reveal potential plasma biomarkers of early atheromatous plaque formation in hamsters. Cardiovasc Res. 97 (4), 642-652 (2013).
- Vairaktaris, E., et al. The hamster model of sequential oral oncogenesis. Oral Oncol. 44 (4), 315-324 (2008).
- Paciello, O., et al. Syrian hamster infected with Leishmania infantum: a new experimental model for inflammatory myopathies. Muscle Nerve. 41 (3), 355-361 (2010).
- Safronetz, D., Ebihara, H., Feldmann, H., Hooper, J. W. The Syrian hamster model of hantavirus pulmonary syndrome. Antiviral Res. 95 (3), 282-292 (2012).
- Fan, Z., et al. Efficient gene targeting in golden Syrian hamsters by the CRISPR/Cas9 system. PLoS One. 9 (10), e109755 (2014).
- McKiernan, S. H., Bavister, B. D. Culture of one-cell hamster embryos with water soluble vitamins: pantothenate stimulates blastocyst production. Hum Reprod. 15 (1), 157-164 (2000).
- Takenaka, M., Horiuchi, T., Yanagimachi, R. Effects of light on development of mammalian zygotes. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (36), 14289-14293 (2007).
